人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序课前预习课件ppt

这是一份人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序课前预习课件ppt，共60页。PPT课件主要包含了从社会中来，目的基因的概念，目的基因，目的基因的筛选与获取，PCR的条件，PCR扩增过程，PCR结果，n-2n，n-1，n＋1-2等内容，欢迎下载使用。
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。
如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因 转入普通棉花
培育转基因抗虫棉的简要过程
普通棉花（无抗虫特性）
抗虫棉 （有抗虫特性）
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成了目的基因。现在，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。
获取目的基因的方法有多种
利用PCR获取和扩增目的基因
通过构建基因文库来获取目的基因
在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。
（2）从基因文库中获取
基因文库概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体
cDNA文库含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体
cDNA：先由mRNA在逆转录酶作用下获得单链DNA，再利用DNA聚合酶，将单链DNA复制，产生双链DNA，即为cDNA。
（3）利用PCR获取和扩增目的基因
PCR——聚合酶链式反应原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR是聚合酶链式反应的缩写，一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）
什么是引物？引物的作用是什么？
定义：引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单 链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）
作用：引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从3’端开 始拼接单个的核苷酸进行PCR扩增。
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
问题4： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
一个DNA，一对引物（A与B），复制n次：
（1）子代DNA分子等长的DNA分子数为：_________个（2）子代DNA分子中不等长链DNA分子数为：_________个（3）子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__________个（4）子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：____个（5）复制过程中共需引物________个（6）第n次复制需要引物_________个
（1）方法：琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
问题1：获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？
目的：确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代； 使目的基因能够表达和发挥作用。
思考：各个元件有什么作用？
基因通常是有遗传效应的DNA片段
编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。
非编码区：不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段。
1.原核生物的基因结构
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA。
是一段有特殊序列结构的DNA片段
也是一段有特殊序列结构的DNA片段
2.真核生物的基因结构
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
复制原点：DNA复制的起始位点
终止子：位置：基因的下游功能：终止转录
标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。
1、基因表达载体的组成
问题2：目的基因应该插入什么位置？
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
激活或抑制目的基因表达
问题3：如何构建抗虫棉的基因表达载体？
用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口
用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成了一个重组DNA分子。
（1）使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
目的基因与目的基因连接
正向连接 反向连接
A、质粒重新环化B、目的基因自身环化C、质粒与目的基因反向连接
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
（2）如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
A、防止质粒重新环化B、防止质粒与目的基因反向连接C、防止目的基因自身环化
1.请结合下图，回答问题：
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
（2）只使用EcRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
①质粒、目的基因发生自身环化；
②质粒与目的基因会发生反向连接。
将目的基因导入受体细胞
（1）花粉管通道法 (我国独创)
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
冠瘿瘤农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等
A、农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。B、农杆菌细胞内含有的 Ti 质粒上的 T - DNA 可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染色体 DNA 上。
Ti质粒的T-DNA中
受体细胞的染色体DNA上（使目的基因能够维持稳定和表达）
含目的基因的重组Ti质粒
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
常用受体细胞：动物受精卵最常用的方法：利用显微注射直接将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。
生物：在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。方法：一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。
原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
方法2：DNA分子杂交技术
过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
方法：抗原-抗体杂交技术
实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA 双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控 温度的仪器。
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 一次PCR一般要经历30次循环。
1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理
2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物
2.DNA片段电泳鉴定的原理：
（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。
（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
①无菌水、琼脂糖；②电泳缓冲液（TAE或TBE）；③凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；④核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
① PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
注意：加不同样品时，需要更换枪头
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子， 以形成加样孔。
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
②凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
——加样孔侧连电极负极。
电泳缓冲液用来维持pH值，使DNA带负电荷。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
凝胶载样缓冲液类似层析液
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、 枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成 小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放 在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后， 移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带， 请分析产生这个结果的可能原因。
1.下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述， 正确的是（ ）A.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液B.采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡， 观察颜色变化