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人教版 (2019)选择性必修3第3章 基因工程第2节 基因工程的基本操作程序精品巩固练习
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这是一份人教版 (2019)选择性必修3第3章 基因工程第2节 基因工程的基本操作程序精品巩固练习，文件包含321《基因工程的基本操作程序》原卷版分层练习docx、321《基因工程的基本操作程序》解析版分层练习docx等2份试卷配套教学资源，其中试卷共31页， 欢迎下载使用。
单选题
1．以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是（ ）
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶
B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能催化形成氢键
D．从骨骼肌细胞提取的RNA构建的cDNA经PCR过程可以获得胰岛素基因
【答案】B
【分析】1、由题意可知，①②③④分别表示反转录、 DNA 的复制、 DNA 解旋、引物结合到互补 DNA 链上及互补链的合成过程。
2、PCR 技术是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。目的：获取大量的目的基因。原理：DNA 双链复制。过程：第一步：加热至 90～95℃DNA 解链为单链；第二步：冷却到 55～60℃，引物与两条单链 DNA 结合；第三步：加热至 70～75℃，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
【详解】A、①过程表示逆转录过程，由逆转录酶催化完成， A 错误
B、由题意可知，④表示引物结合到互补 DNA 链上及互补链的合成过程， B 正确；
C、催化②⑤过程的酶都是 DNA 聚合酶，但是催化形成的是磷酸二酯键，不需要催化形成氢键， C 错误；
D、骨骼肌细胞中不表达胰岛素基因，所以不能在骨骼肌细胞中提取出来胰岛素的RNA，无法构建cDNA， D 错误。
2．2015年10月，我国科学家屠呦呦因发现青蒿素可以有效降低疟疾患者的死亡率而获得了诺贝尔生理学奖。某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，通过一定的技术，使青蒿素合成过程的某一关键酶基因fps在野生青蒿中得到了过量表达，其过程如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．构建重组质粒过程中，目的基因需插入Ti质粒的T-DNA上
B．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止密码子和标记基因等
C．用荧光标记的fps基因作为探针可以检测目的基因是否成功表达
D．上图中①为逆转录酶，②为限制酶，PCR过程中需要用到解旋酶、DNA聚合酶等
【答案】A
【分析】据图分析可知，酶①为逆转录过程中所需的逆转录酶；酶②是处理目的基因和质粒，产生相同切口的限制酶；酶③是将目的基因和质粒连接，构建基因表达载体的DNA连接酶。
【详解】A、Ti质粒的T-DNA可以转移到受体细胞的染色体上，因此目的基因需插入Ti质粒的T-DNA上，A正确；
B、基因表达载体包括的是终止子，不是终止密码，B错误；
C、检测目的基因是否成功表达一般选择抗原-抗体杂交法，而用fps基因作为探针检测的是目的基因是否插入，C错误；
D、PCR过程中需要用到限制酶、DNA连接酶等，D错误。
故选A。
3．大肠杆菌乳糖操纵子包括lacZ、lacY、lacA三个结构基因（编码参与乳糖代谢的酶，其中酶a能够水解乳糖），以及操纵基因、启动子和调节基因。培养基中无乳糖存在时，调节基因表达的阻遏蛋白和操纵基因结合，导致RNA聚合酶不能与启动子结合，使结构基因无法转录；乳糖存在时，结构基因才能正常表达，调节过程如下图所示。下列说法错误的是（ ）
A．结构基因转录时，只能以β链为模板，表达出来的酶a会使结构基因的表达受到抑制
B．过程①的碱基配对方式与②过程不完全相同，参与②过程的氨基酸都可被多种tRNA转运
C．若调节基因的碱基被甲基化修饰，可能导致结构基因持续表达，造成大肠杆菌物质和能量的浪费
D．据图可知，乳糖能够调节大肠杆菌中基因的选择性表达，没有发生细胞的分化
【答案】B
【分析】 基因的表达：①转录：以DNA为模板，通过碱基互补配对原则，在RNA聚合酶的作用下合成mRNA；②翻译：以mRNA为模板，在核糖体的参与和酶的催化作用下，合成多肽链。
【详解】A、结构基因转录时，启动子在结构基因的左侧，RNA聚合酶只能从左侧往右侧移动，mRNA的合成方向为5'→3'，则模板链方向为3'→5'，只能以β链为模板。表达出来的酶a会水解乳糖，培养基中无乳糖存在时，调节基因表达的阻遏蛋白和操纵基因结合，导致RNA聚合酶不能与启动子结合，使结构基因无法转录，A正确；
B、过程①为转录，碱基配对方式有A-U、T-A、C-G、G-C，过程②为翻译，碱基配对方式有A-U、U-A、C-G、G-C，过程①的碱基配对方式与②过程不完全相同，色氨酸只有一种tRNA转运，B错误；
C、若调节基因的碱基被甲基化修饰，可能导致结构基因持续表达，不停合成酶a水解乳糖，造成大肠杆菌物质和能量的浪费，C正确；
D、据图可知，培养基中无乳糖存在时，调节基因表达的阻遏蛋白和操纵基因结合，导致RNA聚合酶不能与启动子结合，使结构基因无法转录；乳糖存在时，结构基因才能正常表达，由此可知，乳糖能够调节大肠杆菌中基因的选择性表达；大肠杆菌为单细胞生物，该过程发生基因的选择性表达，但该过程没有发生细胞的分化，D正确。
故选B。
4．图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是（ ）
A．使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理图1质粒，所得的产物中含有2个游离的磷酸基团
B．如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成的重组DNA中具有2个EcRⅠ酶的切点
C．为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理
D．使用EcRⅠ处理外源DNA分子时需消耗4分子H2O
【答案】A
【分析】基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒．在构建重组Ti质粒时，必须使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。
【详解】A、一个图1所示的质粒分子经BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶切割后，所得的产物中含有两段DNA分子，每条DNA分子由两条脱氧核苷酸链组成，因此含有4个游离的磷酸基团，A错误；
B、若将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcRⅠ酶切后再用DNA连接酶连接，则形成的重组DNA中，目的基因两端应各含1个EcRⅠ酶切位点，即重组DNA中EcRⅠ酶切点有2个，B正确；
C、为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，可用两种限制酶进行切割，由于质粒和含目的基因上都含有BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点，故酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理，C正确；
C、使用EcRⅠ处理外源DNA分子时，有4个磷酸二酯键断裂，因此需消耗4分子H2O，D正确。
故选A。
5．大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具，人生长激素的基因工程过程如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．经①获得该mRNA的最佳材料是受精卵
B．通过①②过程，可以构建基因组文库
C．要检测③⑥过程的产物可分别用PCR技术和抗原—抗体杂交技术
D．⑤过程要在低温和较高浓度的氯化钙溶液中处理使重组DNA易进入受体细胞
【答案】C
【分析】基因工程过程：
1、目的基因的提取；
2、目的基因与运载体结合；
3、目的基因导入受体细胞；
4、受体细胞内基因的表达。
【详解】A、经①获得该mRNA的最佳材料是特定的组织细胞，而不是受精卵，A错误；
B、通过①②过程得到cDNA，cDNA所含的基因不是全部基因不能构建基因组文库，B错误；
C、要检测③的产物生长激素基因可以用PCR技术扩增，要检测⑥过程的产物可用抗原—抗体杂交技术，C正确；
D、⑤过程要在低温和低渗氯化钙溶液中处理，通过增大细菌细胞壁通透性使重组DNA易进入受体细胞，D错误。
故选C。
6．某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，将青蒿素合成过程的某－－关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如下图所示。有关叙述错误的是（ ）
A．经图示过程得到的fps基因不含启动子和终止子
B．酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键
C．图中含fps基因的DNA片段中有酶2的识别序列
D．导入fps基因的青蒿植株中该基因都能过量表达
【答案】D
【分析】据图分析，酶1可以催化逆转录过程，表示逆转录酶，酶2是限制酶，酶3是DNA连接酶，据此分析作答。
【详解】A、真核细胞的mRNA转录后通过加工剪切了启动子和终止子，故反转录得到的基因不含启动子和终止子，A正确；
B、酶1促进逆转录的过程，故为逆转录酶，酶2、酶3用于切割目的基因和质粒，为限制酶和DNA连接酶，都能连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键，B正确；
C、酶2 是限制酶，限制酶对于DNA序列的识别具有特异性，故图中含fps基因的DNA片段中有酶2的识别序列，C正确；
D、导入fps基因的青蒿植株中基因不一定能过量表达，故必须检测转基因青蒿植株中的青蒿素产量，若产量增高，则说明达到了目的，D错误。
故选D。
7．下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中ampr为抗氨苄青霉素基因）。下列叙述错误的是（ ）
A．④过程中可利用目的基因作为探针对植株进行筛选
B．可同时选用限制酶PstI、SmaI对含目的基因的DNA进行剪切
C．过程②可采用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞
D．质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达
【答案】D
【分析】分析题图：图示为转基因抗冻番茄培育过程的示意图，图中①表示基因表达载体的构建过程；②表示将目的基因导入受体细胞；③表示植物组织培养过程；④表示转基因植物的检测。
【详解】A、④过程中可利用目的基因作为探针对植株进行筛选，以获得含有目的基因的植株，A正确；
B、Alu酶切位点位于目的基因内部，若选择该酶切割会破坏目的基因，若选择同一种限制酶切割目的基因，则容易导致构建基因表达载体时形成自体连接，而目的基因两侧含有限制酶PstⅠ和SmaⅠ的识别序列，且质粒上也含有这两种限制酶的切割位点，所以可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA进行切割，B正确；
C、农杆菌转化法适用于双子叶植物或裸子植物，因此过程②可采用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞，C正确；
D、质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞，但不能促进目的基因的表达，D错误。
故选D。
8．研究人员将大麦细胞的LTP1基因导入酵母中，让酵母产生LTP1蛋白。下图为该实验过程的部分流程。下列说法正确的是（ ）
A．运用PCR扩增LTP1基因时，应选择左图的A和D作为引物
B．为方便构建重组质粒，可在引物5’端添加限制酶的识别序列
C．如图中为了筛选导入重组质粒的啤酒酵母，只需配制含青霉素的培养基
D．为了让大麦的基因在酵母中表达，需要在目的基因两侧添加大麦的启动子和终止子
【答案】B
【分析】图示表示将使啤酒产生丰富泡沫的LTPI基因植入啤酒酵母菌中，使其产生LTP1蛋白，酸出泡沫丰富的啤酒的过程，图中A为获取目的基因的过程，B为质粒，C为基因表达体。
【详解】A、结合题意可知，DNA复制只能从5’到3’，而DNA聚合酶只能从引物的3’端延伸DNA链，因此构建前利用PCR技术扩增目的基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取 B和C作为引物，A错误；
B、为构建重组质粒(即将目的基因和质粒整合到一起)，在引物5’端需要适当增加限制酶识别序列B正确；
C、由图可知，构建基因表达载体时，四环素抗性基因被破坏，而青霉素抗性基因没有被破坏，因此将导入C的酵母菌分别在含有青霉素和四坏素的两种选择培养基上培养，则在含有青霉素的培养基上能存活，但在含有四环素的培养基上不能存活，才能筛选导入重组质粒的啤酒酵母，C错误；
D、为了让大麦的基因在酵母中表达，需要在目的基因两侧添加酵母的启动子和终止子，D错误。
故选B。
9．精子载体法（SMGT）是将精子适当处理，使其携带外源基因，通过人工授精或体外受精等途径获得转基因动物的方法。下图是某研究所利用SMGT法获得转基因鼠的过程，下列叙述正确的是（ ）
A．①过程将标记的外源基因直接导入成熟精子即可
B．②过程需将成熟精子放入ATP溶液中进行获能处理
C．若需要对③产生的早期胚胎进行分割，可选择桑椹胚或囊胚
D．进行过程④操作前，需要对代孕母体进行免疫抑制剂处理
【答案】C
【分析】1、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。其中启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。2、胚胎移植的基本程序主要包括：①对供、受体的选择和处理；②配种或人工授精；③对胚胎的收集、检查、培养或保存；④对胚胎进行移植；⑤移植后的检查。3、胚胎移植是指将早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。
【详解】A、完成过程①时需要将标记的外源基因与载体连接，以构建基因表达载体，然后将基因表达载体通过显微注射的方法导入受体细胞中，A错误；
B、②过程需将成熟的精子放入获能液中进行获能处理，B错误；
C、对早期胚胎进行胚胎分割，进行此操作时应选择发育良好的、形态正常的桑葚胚或囊胚的胚胎，对囊胚期的胚胎进行分割时，要特别注意内细胞团均等分割，C正确；
D、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。因此进行过程④操作前，不需要对代孕母体进行免疫抑制剂处理，D错误。
故选C。
10．为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表，phb2基因序列不含图1中限制酶的识别序列。转化后的大肠杆菌提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2．下列叙述错误的是（ ）
相关限制酶的识别序列及切割位点（注：箭头表示切割位点）
A．需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因
B．为使phb2基因与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入KpnⅠ和EcRⅠ两种不同限制酶的识别序列
C．需用CaCl2处理大肠杆菌制备感受态细胞，以提高转化率
D．图2中3号的质粒很可能是含目的基因的重组质粒
【答案】B
【分析】限制酶的选择不能破坏目的基因，不能破坏载体上的关键结构，比如启动子、终止子、复制原点等。
【详解】A、需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因，A正确；
B、目的基因应导入启动子和终止子之间。图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列，B错误；
C、需用CaCl2处理大肠杆菌制备感受态细胞，以提高转化率，C正确；
D、用EcRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶切割质粒，会获得一大一小两个片段，图2中3号的质粒酶切后得到一大一小两个片段，很可能是含目的基因的重组质粒，D正确。
故选B。
11．实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的Taqman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光（如图所示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值（该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关）。下列相关叙述正确的是（ ）
A．每个模板DNA分子含有4个游离的磷酸基团
B．在反应过程中，需要ATP为新链的合成提供能量
C．做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和Taqman探针
D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小
【答案】C
【分析】PCR技术：概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理：DNA复制。前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。条件：模板DNA、四种dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
【详解】A、DNA分子为两条反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A错误；
B、在反应过程中，dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）既是原料又为新链的合成提供能量，无需ATP，B错误；
C、做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，C正确；
D、若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。
故选C。
12．研究发现肺细胞中的let- 7基因与癌基因RAS存在功能上的关联。研究人员利用转基因技术将let- 7基因导人肺癌细胞并表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制，其作用机理如图所示。下列有关叙述正确的是（ ）
A．let-7基因与RAS基因的序列相同
B．从功能上看，let-7基因可能属于抑癌基因
C．let-7基因与RAS基因转录的模板链一定相同
D．癌变细胞中检测到大量RASmRNA与miRNA的杂交链
【答案】B
【分析】let-7基因影响癌基因RAS的表达的原理，let-7基因转录产物miRNA与RAS基因转录产物RAS mRNA结合，使RAS基因翻译受到抑制，引起细胞中的RAS蛋白含量减少，进而导致癌细胞增殖受到抑制。
【详解】A、let-7基因转录产物miRNA与RAS基因转录产物RAS mRNA结合，但其经过了加工，其基因的序列不一定相同，A错误；
B、let-7基因影响癌基因RAS的表达的原理，let-7基因转录产物miRNA与RAS基因转录产物RAS mRNA结合，使RAS基因翻译受到抑制，引起细胞中的RAS蛋白含量减少，进而导致癌细胞增殖受到抑制，抑癌基因能抑制细胞不正常的增殖，故let-7基因可能属于抑癌基因，B正确；
C、let-7基因与RAS基因转录的模板链经过了加工，转录的模板链不一定相同，C错误；
D、利用转基因技术将let-7基因导人肺癌细胞并表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制，在癌变细胞中，不可能存在大量的let-7基因，故不能检测到大量RASmRNA与miRNA的杂交链，D错误。
二、综合题
13．载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）以及一些酶切位点。请回答下列问题：
(1)若图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，四环素抗性基因（tetr）上有EcRV的酶切位点，氨苄青霉素抗性基因（ampr）上无酶切位点，质粒其他部位也有合适的其他种类的酶切位点，选用EcRV酶处理质粒的原因是：_____________________。
(2)若P0质粒含有3个限制酶切点（如图2），请据图回答问题：在构建上图中重组质粒时，若用两种酶切割目的基因的两端及质粒，应选用______两种酶，好处是______________。（至少答2点）
(3)若P0质粒含有5个限制酶切点（如图3）。将重组质粒导入大肠杆菌，并成功地在大肠杆菌中得以表达。请据图回答问题：重组质粒形成与否需要鉴定和筛选，方法是将重组质粒的DNA分子导入大肠杆菌，用含抗生素的培养基进行培养，观察大肠杆菌的生长、繁殖情况并进行判断，如图4所示：①如果受体菌在培养基A上能生长、繁殖形成菌落，而不能在培养基B上生长、繁殖，则限制酶a的切点是图4中的____________。
②如果受体菌在培养基A上不能生长、繁殖形成菌落，而在培养基B上能生长、繁殖，则限制酶a的切点是图4中的______________________。
③如果受体菌在培养基A和培养基B上都能生长、繁殖形成菌落，则限制酶a的切点是图4中的____________。
【答案】(1)使得重组质粒只含有一个抗性基因，有利于筛选含目的基因的受体细胞（其他合理答案也给分）
(2) HindIII和SalI ①防止破坏目的基因；②防止目的基因自连和质粒自连以及目的基因倒接，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率
(3) 切点3或切点4或切点5 切点1 切点2
【分析】基因工程的基本步骤：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）由于该质粒有2个标记基因，四环素抗性基因上有EcRV的酶切位点，氨苄青霉素抗性基因上无酶切位点，使用EcRV切割，形成重组质粒后，只有氨苄青霉素抗性基因这一个标记基因，因此可以配置含四环素和氨苄青霉素以及只含氨苄青霉素的培养基，从而有利于筛选含目的基因的受体细胞。
（2）抗盐基因中有BamH的酶切位点，若选择BamH，将破坏目的基因。若用两种酶切割目的基因的两端及质粒，应选用HindIII和SalI两种酶，好处是既可以防止破坏目的基因，又可以防止目的基因自连和质粒自连以及目的基因倒接，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率。
（3）①若受体菌在培养基A上能生长而在培养基B上不能生长，则质粒中抗氨苄青霉素基因完整而抗四环素基因被破坏，限制酶a的切点是图4中切点3或切点4或切点5；
②若受体菌在培养基B上能生长而在培养基A上不能生长，则质粒中抗氨苄青霉素基因被破坏而抗四环素基因完整，判断限制酶a的切点是切点1；
③若受体菌在培养基A和培养基B上都能生长，则质粒中抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因都未被破坏，判断限制酶a的切点是切点2
14．甜柿果肉鲜美，受消费者的喜爱。甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因（PDC）密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员进行了下列实验。回答下列问题。
(1)启动子位于基因的首端，存在着许多调控蛋白的结合位点直接影响基因的_______过程。
(2)PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在_______________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行PCR扩增，在扩增过程中使用的DNA聚合酶与体内的相比具有_______________的特点。
(3)AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，据此可利用与AD蛋白形成的融合蛋白来筛选待测蛋白。利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含__________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H；将从甜柿中提取的RNA逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点__________（填序号1～5）作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
(4)重组酵母Y1H与Y187能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有_________的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白。
【答案】(1)转录
(2) DNA连接酶 耐高温
(3) 尿嘧啶 2
(4)金担子素
【分析】1、基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体有质粒等。
【详解】（1）启动子位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，直接决定基因转录起始。
（2）该操作为目的基因和运载体的酶切和连接，限制酶切割后需要在DNA连接酶的作用下连接。由于PCR技术中温度能达到90°C以上，故在PCR扩增过程中使用的DNA聚合酶与体内的相比具有耐高温的特点。
（3）由质粒A的图谱可知，带有选择功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金担子素抗性基因两种，但是金担子素抗性基因无法启动，所以选择尿嘧啶合成基因作为选择依据，则用不含尿嘧啶的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H；
科研人员从甜柿中提取RNA，将逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，cDNA片段需要插入启动子和终止子之间，且不能破坏目的基因，故选择2作为cDNA的插入位点。
（4）依据题干和图丙，重组酵母Y187与Y1H接合子应同时含有质粒A、质粒G，则接合子有质粒A为含有PDC基因、金担子素抗性基因的质粒；质粒G为可正常表达AD蛋白、待测蛋白的质粒，接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，则AD蛋白携带的待测蛋白靠近PDC基因启动子，激活PDC基因的转录，并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性，能在含有金担子素的培养基中生存。
15．研究人员利用绿色荧光蛋白基因（）转染大丽轮枝菌，培育表达绿色荧光蛋白的转基因菌株。主要过程如下（图中a链和b链分别是相应基因转录的模板链）。回答下列问题：
(1)第①步：扩增基因。扩增的原理是___________；图中b链的碱基序列黏性末端（）为___________。
(2)第②步：目的基因与运载体结合。②需要的工具酶是___________，此时目的基因插入到___________启动子之后，目的是______________________。
(3)第③步：目的基因导入大丽轮枝菌。该过程需要先将目的基因导人农杆菌，而后将转化后的农杆菌放置于含有___________的培养基上，筛选出含有目的基因的农杆菌。将导入重组质粒的农杆菌加入大丽轮枝菌的孢子细胞悬液中，在适宜条件下完成转染后利用滤膜过滤得到孢子细胞，再在真菌培养基上培养获得菌落，最终通过检测______________________筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
【答案】(1) DNA双链复制 AGCT
(2) DNA连接酶 构巢曲霉 保证sGFP基因可以在大丽轮枝菌细胞中表达
(3) 潮霉素 （绿色）荧光（强度）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取；
（2）基因表达载体的构建；
（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）PCR扩增sGFP的原理是DNA双链复制，由于DNA的两条链反向平行，且DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5'→3’方向延伸，所以该过程需要根据sGFP两端（3’端）核苷酸（或碱基）序列设计特异性引物序列。为了保证sGFP正确插入质粒中，还需要在引物的5端添加限制酶识别序列，由于质粒大片段是利用HindⅢ和BamHI共同切割得到的质粒的长片段，所以b链5'端是利用HindⅢ切割形成的黏性末端，根据HindIⅢI识别的碱基序列可知，图中b链的黏性末端碱基序列（5'→3'）为AGCT。
（2）过程②为构建重组DNA，需要的工具酶是DNA连接酶。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子是使转录终止的序列，而目的基因不携带启动子和终止子，所以将sGFP插入构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是保证SGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达。
（3）过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80℃左右后，加入用无菌水配制的适宜浓度的潮霉素溶液，以防止杂菌污染。由于潮霉素在高温灭菌时结构会被破坏，不能发挥选择作用，所以潮霉素不能与培养基一同灭菌；转基因成功的标志是形成目的基因的产物，所以最终可通过检测大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度，以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
【点睛】本题主要考查基因工程相关知识，要求考生掌握基因工程的操作步骤，能准确识别图示的各个过程，理解基因表达载体的组成及其各组分的作用，理解PCR扩增的原理和过程。
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
单选题
1．以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是（ ）
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶
B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能催化形成氢键
D．从骨骼肌细胞提取的RNA构建的cDNA经PCR过程可以获得胰岛素基因
【答案】B
【分析】1、由题意可知，①②③④分别表示反转录、 DNA 的复制、 DNA 解旋、引物结合到互补 DNA 链上及互补链的合成过程。
2、PCR 技术是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。目的：获取大量的目的基因。原理：DNA 双链复制。过程：第一步：加热至 90～95℃DNA 解链为单链；第二步：冷却到 55～60℃，引物与两条单链 DNA 结合；第三步：加热至 70～75℃，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
【详解】A、①过程表示逆转录过程，由逆转录酶催化完成， A 错误
B、由题意可知，④表示引物结合到互补 DNA 链上及互补链的合成过程， B 正确；
C、催化②⑤过程的酶都是 DNA 聚合酶，但是催化形成的是磷酸二酯键，不需要催化形成氢键， C 错误；
D、骨骼肌细胞中不表达胰岛素基因，所以不能在骨骼肌细胞中提取出来胰岛素的RNA，无法构建cDNA， D 错误。
2．2015年10月，我国科学家屠呦呦因发现青蒿素可以有效降低疟疾患者的死亡率而获得了诺贝尔生理学奖。某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，通过一定的技术，使青蒿素合成过程的某一关键酶基因fps在野生青蒿中得到了过量表达，其过程如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．构建重组质粒过程中，目的基因需插入Ti质粒的T-DNA上
B．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止密码子和标记基因等
C．用荧光标记的fps基因作为探针可以检测目的基因是否成功表达
D．上图中①为逆转录酶，②为限制酶，PCR过程中需要用到解旋酶、DNA聚合酶等
【答案】A
【分析】据图分析可知，酶①为逆转录过程中所需的逆转录酶；酶②是处理目的基因和质粒，产生相同切口的限制酶；酶③是将目的基因和质粒连接，构建基因表达载体的DNA连接酶。
【详解】A、Ti质粒的T-DNA可以转移到受体细胞的染色体上，因此目的基因需插入Ti质粒的T-DNA上，A正确；
B、基因表达载体包括的是终止子，不是终止密码，B错误；
C、检测目的基因是否成功表达一般选择抗原-抗体杂交法，而用fps基因作为探针检测的是目的基因是否插入，C错误；
D、PCR过程中需要用到限制酶、DNA连接酶等，D错误。
故选A。
3．大肠杆菌乳糖操纵子包括lacZ、lacY、lacA三个结构基因（编码参与乳糖代谢的酶，其中酶a能够水解乳糖），以及操纵基因、启动子和调节基因。培养基中无乳糖存在时，调节基因表达的阻遏蛋白和操纵基因结合，导致RNA聚合酶不能与启动子结合，使结构基因无法转录；乳糖存在时，结构基因才能正常表达，调节过程如下图所示。下列说法错误的是（ ）
A．结构基因转录时，只能以β链为模板，表达出来的酶a会使结构基因的表达受到抑制
B．过程①的碱基配对方式与②过程不完全相同，参与②过程的氨基酸都可被多种tRNA转运
C．若调节基因的碱基被甲基化修饰，可能导致结构基因持续表达，造成大肠杆菌物质和能量的浪费
D．据图可知，乳糖能够调节大肠杆菌中基因的选择性表达，没有发生细胞的分化
【答案】B
【分析】 基因的表达：①转录：以DNA为模板，通过碱基互补配对原则，在RNA聚合酶的作用下合成mRNA；②翻译：以mRNA为模板，在核糖体的参与和酶的催化作用下，合成多肽链。
【详解】A、结构基因转录时，启动子在结构基因的左侧，RNA聚合酶只能从左侧往右侧移动，mRNA的合成方向为5'→3'，则模板链方向为3'→5'，只能以β链为模板。表达出来的酶a会水解乳糖，培养基中无乳糖存在时，调节基因表达的阻遏蛋白和操纵基因结合，导致RNA聚合酶不能与启动子结合，使结构基因无法转录，A正确；
B、过程①为转录，碱基配对方式有A-U、T-A、C-G、G-C，过程②为翻译，碱基配对方式有A-U、U-A、C-G、G-C，过程①的碱基配对方式与②过程不完全相同，色氨酸只有一种tRNA转运，B错误；
C、若调节基因的碱基被甲基化修饰，可能导致结构基因持续表达，不停合成酶a水解乳糖，造成大肠杆菌物质和能量的浪费，C正确；
D、据图可知，培养基中无乳糖存在时，调节基因表达的阻遏蛋白和操纵基因结合，导致RNA聚合酶不能与启动子结合，使结构基因无法转录；乳糖存在时，结构基因才能正常表达，由此可知，乳糖能够调节大肠杆菌中基因的选择性表达；大肠杆菌为单细胞生物，该过程发生基因的选择性表达，但该过程没有发生细胞的分化，D正确。
故选B。
4．图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是（ ）
A．使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理图1质粒，所得的产物中含有2个游离的磷酸基团
B．如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成的重组DNA中具有2个EcRⅠ酶的切点
C．为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理
D．使用EcRⅠ处理外源DNA分子时需消耗4分子H2O
【答案】A
【分析】基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒．在构建重组Ti质粒时，必须使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。
【详解】A、一个图1所示的质粒分子经BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶切割后，所得的产物中含有两段DNA分子，每条DNA分子由两条脱氧核苷酸链组成，因此含有4个游离的磷酸基团，A错误；
B、若将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcRⅠ酶切后再用DNA连接酶连接，则形成的重组DNA中，目的基因两端应各含1个EcRⅠ酶切位点，即重组DNA中EcRⅠ酶切点有2个，B正确；
C、为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，可用两种限制酶进行切割，由于质粒和含目的基因上都含有BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点，故酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理，C正确；
C、使用EcRⅠ处理外源DNA分子时，有4个磷酸二酯键断裂，因此需消耗4分子H2O，D正确。
故选A。
5．大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具，人生长激素的基因工程过程如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．经①获得该mRNA的最佳材料是受精卵
B．通过①②过程，可以构建基因组文库
C．要检测③⑥过程的产物可分别用PCR技术和抗原—抗体杂交技术
D．⑤过程要在低温和较高浓度的氯化钙溶液中处理使重组DNA易进入受体细胞
【答案】C
【分析】基因工程过程：
1、目的基因的提取；
2、目的基因与运载体结合；
3、目的基因导入受体细胞；
4、受体细胞内基因的表达。
【详解】A、经①获得该mRNA的最佳材料是特定的组织细胞，而不是受精卵，A错误；
B、通过①②过程得到cDNA，cDNA所含的基因不是全部基因不能构建基因组文库，B错误；
C、要检测③的产物生长激素基因可以用PCR技术扩增，要检测⑥过程的产物可用抗原—抗体杂交技术，C正确；
D、⑤过程要在低温和低渗氯化钙溶液中处理，通过增大细菌细胞壁通透性使重组DNA易进入受体细胞，D错误。
故选C。
6．某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，将青蒿素合成过程的某－－关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如下图所示。有关叙述错误的是（ ）
A．经图示过程得到的fps基因不含启动子和终止子
B．酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键
C．图中含fps基因的DNA片段中有酶2的识别序列
D．导入fps基因的青蒿植株中该基因都能过量表达
【答案】D
【分析】据图分析，酶1可以催化逆转录过程，表示逆转录酶，酶2是限制酶，酶3是DNA连接酶，据此分析作答。
【详解】A、真核细胞的mRNA转录后通过加工剪切了启动子和终止子，故反转录得到的基因不含启动子和终止子，A正确；
B、酶1促进逆转录的过程，故为逆转录酶，酶2、酶3用于切割目的基因和质粒，为限制酶和DNA连接酶，都能连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键，B正确；
C、酶2 是限制酶，限制酶对于DNA序列的识别具有特异性，故图中含fps基因的DNA片段中有酶2的识别序列，C正确；
D、导入fps基因的青蒿植株中基因不一定能过量表达，故必须检测转基因青蒿植株中的青蒿素产量，若产量增高，则说明达到了目的，D错误。
故选D。
7．下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中ampr为抗氨苄青霉素基因）。下列叙述错误的是（ ）
A．④过程中可利用目的基因作为探针对植株进行筛选
B．可同时选用限制酶PstI、SmaI对含目的基因的DNA进行剪切
C．过程②可采用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞
D．质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达
【答案】D
【分析】分析题图：图示为转基因抗冻番茄培育过程的示意图，图中①表示基因表达载体的构建过程；②表示将目的基因导入受体细胞；③表示植物组织培养过程；④表示转基因植物的检测。
【详解】A、④过程中可利用目的基因作为探针对植株进行筛选，以获得含有目的基因的植株，A正确；
B、Alu酶切位点位于目的基因内部，若选择该酶切割会破坏目的基因，若选择同一种限制酶切割目的基因，则容易导致构建基因表达载体时形成自体连接，而目的基因两侧含有限制酶PstⅠ和SmaⅠ的识别序列，且质粒上也含有这两种限制酶的切割位点，所以可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA进行切割，B正确；
C、农杆菌转化法适用于双子叶植物或裸子植物，因此过程②可采用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞，C正确；
D、质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞，但不能促进目的基因的表达，D错误。
故选D。
8．研究人员将大麦细胞的LTP1基因导入酵母中，让酵母产生LTP1蛋白。下图为该实验过程的部分流程。下列说法正确的是（ ）
A．运用PCR扩增LTP1基因时，应选择左图的A和D作为引物
B．为方便构建重组质粒，可在引物5’端添加限制酶的识别序列
C．如图中为了筛选导入重组质粒的啤酒酵母，只需配制含青霉素的培养基
D．为了让大麦的基因在酵母中表达，需要在目的基因两侧添加大麦的启动子和终止子
【答案】B
【分析】图示表示将使啤酒产生丰富泡沫的LTPI基因植入啤酒酵母菌中，使其产生LTP1蛋白，酸出泡沫丰富的啤酒的过程，图中A为获取目的基因的过程，B为质粒，C为基因表达体。
【详解】A、结合题意可知，DNA复制只能从5’到3’，而DNA聚合酶只能从引物的3’端延伸DNA链，因此构建前利用PCR技术扩增目的基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取 B和C作为引物，A错误；
B、为构建重组质粒(即将目的基因和质粒整合到一起)，在引物5’端需要适当增加限制酶识别序列B正确；
C、由图可知，构建基因表达载体时，四环素抗性基因被破坏，而青霉素抗性基因没有被破坏，因此将导入C的酵母菌分别在含有青霉素和四坏素的两种选择培养基上培养，则在含有青霉素的培养基上能存活，但在含有四环素的培养基上不能存活，才能筛选导入重组质粒的啤酒酵母，C错误；
D、为了让大麦的基因在酵母中表达，需要在目的基因两侧添加酵母的启动子和终止子，D错误。
故选B。
9．精子载体法（SMGT）是将精子适当处理，使其携带外源基因，通过人工授精或体外受精等途径获得转基因动物的方法。下图是某研究所利用SMGT法获得转基因鼠的过程，下列叙述正确的是（ ）
A．①过程将标记的外源基因直接导入成熟精子即可
B．②过程需将成熟精子放入ATP溶液中进行获能处理
C．若需要对③产生的早期胚胎进行分割，可选择桑椹胚或囊胚
D．进行过程④操作前，需要对代孕母体进行免疫抑制剂处理
【答案】C
【分析】1、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。其中启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。2、胚胎移植的基本程序主要包括：①对供、受体的选择和处理；②配种或人工授精；③对胚胎的收集、检查、培养或保存；④对胚胎进行移植；⑤移植后的检查。3、胚胎移植是指将早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。
【详解】A、完成过程①时需要将标记的外源基因与载体连接，以构建基因表达载体，然后将基因表达载体通过显微注射的方法导入受体细胞中，A错误；
B、②过程需将成熟的精子放入获能液中进行获能处理，B错误；
C、对早期胚胎进行胚胎分割，进行此操作时应选择发育良好的、形态正常的桑葚胚或囊胚的胚胎，对囊胚期的胚胎进行分割时，要特别注意内细胞团均等分割，C正确；
D、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。因此进行过程④操作前，不需要对代孕母体进行免疫抑制剂处理，D错误。
故选C。
10．为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表，phb2基因序列不含图1中限制酶的识别序列。转化后的大肠杆菌提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2．下列叙述错误的是（ ）
相关限制酶的识别序列及切割位点（注：箭头表示切割位点）
A．需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因
B．为使phb2基因与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入KpnⅠ和EcRⅠ两种不同限制酶的识别序列
C．需用CaCl2处理大肠杆菌制备感受态细胞，以提高转化率
D．图2中3号的质粒很可能是含目的基因的重组质粒
【答案】B
【分析】限制酶的选择不能破坏目的基因，不能破坏载体上的关键结构，比如启动子、终止子、复制原点等。
【详解】A、需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因，A正确；
B、目的基因应导入启动子和终止子之间。图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列，B错误；
C、需用CaCl2处理大肠杆菌制备感受态细胞，以提高转化率，C正确；
D、用EcRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶切割质粒，会获得一大一小两个片段，图2中3号的质粒酶切后得到一大一小两个片段，很可能是含目的基因的重组质粒，D正确。
故选B。
11．实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的Taqman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光（如图所示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值（该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关）。下列相关叙述正确的是（ ）
A．每个模板DNA分子含有4个游离的磷酸基团
B．在反应过程中，需要ATP为新链的合成提供能量
C．做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和Taqman探针
D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小
【答案】C
【分析】PCR技术：概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理：DNA复制。前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。条件：模板DNA、四种dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
【详解】A、DNA分子为两条反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A错误；
B、在反应过程中，dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）既是原料又为新链的合成提供能量，无需ATP，B错误；
C、做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，C正确；
D、若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。
故选C。
12．研究发现肺细胞中的let- 7基因与癌基因RAS存在功能上的关联。研究人员利用转基因技术将let- 7基因导人肺癌细胞并表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制，其作用机理如图所示。下列有关叙述正确的是（ ）
A．let-7基因与RAS基因的序列相同
B．从功能上看，let-7基因可能属于抑癌基因
C．let-7基因与RAS基因转录的模板链一定相同
D．癌变细胞中检测到大量RASmRNA与miRNA的杂交链
【答案】B
【分析】let-7基因影响癌基因RAS的表达的原理，let-7基因转录产物miRNA与RAS基因转录产物RAS mRNA结合，使RAS基因翻译受到抑制，引起细胞中的RAS蛋白含量减少，进而导致癌细胞增殖受到抑制。
【详解】A、let-7基因转录产物miRNA与RAS基因转录产物RAS mRNA结合，但其经过了加工，其基因的序列不一定相同，A错误；
B、let-7基因影响癌基因RAS的表达的原理，let-7基因转录产物miRNA与RAS基因转录产物RAS mRNA结合，使RAS基因翻译受到抑制，引起细胞中的RAS蛋白含量减少，进而导致癌细胞增殖受到抑制，抑癌基因能抑制细胞不正常的增殖，故let-7基因可能属于抑癌基因，B正确；
C、let-7基因与RAS基因转录的模板链经过了加工，转录的模板链不一定相同，C错误；
D、利用转基因技术将let-7基因导人肺癌细胞并表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制，在癌变细胞中，不可能存在大量的let-7基因，故不能检测到大量RASmRNA与miRNA的杂交链，D错误。
二、综合题
13．载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）以及一些酶切位点。请回答下列问题：
(1)若图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，四环素抗性基因（tetr）上有EcRV的酶切位点，氨苄青霉素抗性基因（ampr）上无酶切位点，质粒其他部位也有合适的其他种类的酶切位点，选用EcRV酶处理质粒的原因是：_____________________。
(2)若P0质粒含有3个限制酶切点（如图2），请据图回答问题：在构建上图中重组质粒时，若用两种酶切割目的基因的两端及质粒，应选用______两种酶，好处是______________。（至少答2点）
(3)若P0质粒含有5个限制酶切点（如图3）。将重组质粒导入大肠杆菌，并成功地在大肠杆菌中得以表达。请据图回答问题：重组质粒形成与否需要鉴定和筛选，方法是将重组质粒的DNA分子导入大肠杆菌，用含抗生素的培养基进行培养，观察大肠杆菌的生长、繁殖情况并进行判断，如图4所示：①如果受体菌在培养基A上能生长、繁殖形成菌落，而不能在培养基B上生长、繁殖，则限制酶a的切点是图4中的____________。
②如果受体菌在培养基A上不能生长、繁殖形成菌落，而在培养基B上能生长、繁殖，则限制酶a的切点是图4中的______________________。
③如果受体菌在培养基A和培养基B上都能生长、繁殖形成菌落，则限制酶a的切点是图4中的____________。
【答案】(1)使得重组质粒只含有一个抗性基因，有利于筛选含目的基因的受体细胞（其他合理答案也给分）
(2) HindIII和SalI ①防止破坏目的基因；②防止目的基因自连和质粒自连以及目的基因倒接，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率
(3) 切点3或切点4或切点5 切点1 切点2
【分析】基因工程的基本步骤：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）由于该质粒有2个标记基因，四环素抗性基因上有EcRV的酶切位点，氨苄青霉素抗性基因上无酶切位点，使用EcRV切割，形成重组质粒后，只有氨苄青霉素抗性基因这一个标记基因，因此可以配置含四环素和氨苄青霉素以及只含氨苄青霉素的培养基，从而有利于筛选含目的基因的受体细胞。
（2）抗盐基因中有BamH的酶切位点，若选择BamH，将破坏目的基因。若用两种酶切割目的基因的两端及质粒，应选用HindIII和SalI两种酶，好处是既可以防止破坏目的基因，又可以防止目的基因自连和质粒自连以及目的基因倒接，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率。
（3）①若受体菌在培养基A上能生长而在培养基B上不能生长，则质粒中抗氨苄青霉素基因完整而抗四环素基因被破坏，限制酶a的切点是图4中切点3或切点4或切点5；
②若受体菌在培养基B上能生长而在培养基A上不能生长，则质粒中抗氨苄青霉素基因被破坏而抗四环素基因完整，判断限制酶a的切点是切点1；
③若受体菌在培养基A和培养基B上都能生长，则质粒中抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因都未被破坏，判断限制酶a的切点是切点2
14．甜柿果肉鲜美，受消费者的喜爱。甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因（PDC）密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员进行了下列实验。回答下列问题。
(1)启动子位于基因的首端，存在着许多调控蛋白的结合位点直接影响基因的_______过程。
(2)PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在_______________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行PCR扩增，在扩增过程中使用的DNA聚合酶与体内的相比具有_______________的特点。
(3)AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，据此可利用与AD蛋白形成的融合蛋白来筛选待测蛋白。利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含__________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H；将从甜柿中提取的RNA逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点__________（填序号1～5）作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
(4)重组酵母Y1H与Y187能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有_________的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白。
【答案】(1)转录
(2) DNA连接酶 耐高温
(3) 尿嘧啶 2
(4)金担子素
【分析】1、基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体有质粒等。
【详解】（1）启动子位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，直接决定基因转录起始。
（2）该操作为目的基因和运载体的酶切和连接，限制酶切割后需要在DNA连接酶的作用下连接。由于PCR技术中温度能达到90°C以上，故在PCR扩增过程中使用的DNA聚合酶与体内的相比具有耐高温的特点。
（3）由质粒A的图谱可知，带有选择功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金担子素抗性基因两种，但是金担子素抗性基因无法启动，所以选择尿嘧啶合成基因作为选择依据，则用不含尿嘧啶的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H；
科研人员从甜柿中提取RNA，将逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，cDNA片段需要插入启动子和终止子之间，且不能破坏目的基因，故选择2作为cDNA的插入位点。
（4）依据题干和图丙，重组酵母Y187与Y1H接合子应同时含有质粒A、质粒G，则接合子有质粒A为含有PDC基因、金担子素抗性基因的质粒；质粒G为可正常表达AD蛋白、待测蛋白的质粒，接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，则AD蛋白携带的待测蛋白靠近PDC基因启动子，激活PDC基因的转录，并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性，能在含有金担子素的培养基中生存。
15．研究人员利用绿色荧光蛋白基因（）转染大丽轮枝菌，培育表达绿色荧光蛋白的转基因菌株。主要过程如下（图中a链和b链分别是相应基因转录的模板链）。回答下列问题：
(1)第①步：扩增基因。扩增的原理是___________；图中b链的碱基序列黏性末端（）为___________。
(2)第②步：目的基因与运载体结合。②需要的工具酶是___________，此时目的基因插入到___________启动子之后，目的是______________________。
(3)第③步：目的基因导入大丽轮枝菌。该过程需要先将目的基因导人农杆菌，而后将转化后的农杆菌放置于含有___________的培养基上，筛选出含有目的基因的农杆菌。将导入重组质粒的农杆菌加入大丽轮枝菌的孢子细胞悬液中，在适宜条件下完成转染后利用滤膜过滤得到孢子细胞，再在真菌培养基上培养获得菌落，最终通过检测______________________筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
【答案】(1) DNA双链复制 AGCT
(2) DNA连接酶 构巢曲霉 保证sGFP基因可以在大丽轮枝菌细胞中表达
(3) 潮霉素 （绿色）荧光（强度）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取；
（2）基因表达载体的构建；
（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）PCR扩增sGFP的原理是DNA双链复制，由于DNA的两条链反向平行，且DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5'→3’方向延伸，所以该过程需要根据sGFP两端（3’端）核苷酸（或碱基）序列设计特异性引物序列。为了保证sGFP正确插入质粒中，还需要在引物的5端添加限制酶识别序列，由于质粒大片段是利用HindⅢ和BamHI共同切割得到的质粒的长片段，所以b链5'端是利用HindⅢ切割形成的黏性末端，根据HindIⅢI识别的碱基序列可知，图中b链的黏性末端碱基序列（5'→3'）为AGCT。
（2）过程②为构建重组DNA，需要的工具酶是DNA连接酶。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子是使转录终止的序列，而目的基因不携带启动子和终止子，所以将sGFP插入构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是保证SGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达。
（3）过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80℃左右后，加入用无菌水配制的适宜浓度的潮霉素溶液，以防止杂菌污染。由于潮霉素在高温灭菌时结构会被破坏，不能发挥选择作用，所以潮霉素不能与培养基一同灭菌；转基因成功的标志是形成目的基因的产物，所以最终可通过检测大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度，以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
【点睛】本题主要考查基因工程相关知识，要求考生掌握基因工程的操作步骤，能准确识别图示的各个过程，理解基因表达载体的组成及其各组分的作用，理解PCR扩增的原理和过程。
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
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