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高中生物第2节 基因工程的基本操作程序第1课时学案及答案
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这是一份高中生物第2节 基因工程的基本操作程序第1课时学案及答案，共14页。
[学习目标] 1.简述PCR的原理、条件及过程。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。
一、目的基因的筛选与获取
1．培育转基因抗虫棉的四个步骤
(1)目的基因的筛选与获取。
(2)基因表达载体的构建。
(3)将目的基因导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定。
2．目的基因
(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
(2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。
(3)类型：与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，即Bt基因。
3．筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
4．获取目的基因的方法
(1)人工合成目的基因。
(2)常用PCR特异性地快速扩增目的基因。
(3)通过构建基因文库来获取目的基因。
5．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
(2)原理：DNA半保留复制。
(3)基本条件
①场所：在一定的缓冲液中进行，其中一般要添加Mg2＋。
②模板：DNA母链。
③原料：4种脱氧核苷酸。
④酶：耐高温的DNA聚合酶。
⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(4)过程
①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。
②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(5)上一轮循环的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。
(6)鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
判断正误
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应( )
(2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚( )
(3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温( )
(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高( )
答案 (1)× (2)× (3)√ (4)√
解析 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸，DNA聚合酶催化子链的延伸。(2)PCR扩增技术中，高温使双链DNA解聚。
任务一：PCR扩增技术
图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
1．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。
提示 不是；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
2．图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？
提示 第3轮；1/4。
3．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
提示 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
4．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
提示 第1组：引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物 Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。
5．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
提示 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
6．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
提示 共需消耗2n－1对引物。
PCR中的数量关系
1．(2023·山西太原高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是( )
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
答案 A
解析 目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。
2．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是( )
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
答案 D
解析 由题图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的分子是7个，即占7/8，D错误。
二、基因表达载体的构建
1．基因表达载体构建的目的
让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
(1)首先用一定的限制酶切割载体。
(2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)。
判断正误
(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取( )
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子( )
(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因( )
答案 (1)× (2)× (3)√
解析 (1)基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。
任务二：分析基因表达载体构建的目的和方法
1．获取Bt基因后不能直接将它导入受体细胞，是因为游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。因此，获取Bt基因后，还需要借助载体将其导入棉花细胞，才能使棉花植株获得抗虫特性。
2．构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？
提示 启动子下游和终止子上游；因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。
3．请结合图示，回答下列问题：
(1)构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？为什么？
提示 不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因。该基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
(2)与只使用EcRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
提示 可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。
1．区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子
启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
2．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Pst Ⅰ，而不选择Sma Ⅰ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中Pst Ⅰ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择Pst Ⅰ 和EcR Ⅰ 两种限制酶。
拓展延伸 真、原核细胞基因的结构和表达
(1)基因的结构
(2)基因表达遗传信息
①原核生物基因
②真核生物基因
3．下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是( )
A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸
B．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件
C．人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达
D．由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
答案 B
解析 启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等，B错误；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。
4．(2023·江苏苏州高二期末)某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析不正确的是( )
A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
答案 C
解析 限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点，用HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；AluⅠ的切割位点位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；不宜选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，因为质粒中的两个标记基因均会被破坏，且DNA会反向连接至载体上，C错误；构建重组DNA时，选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。
题组一 目的基因的筛选与获取
1．(2023·陕西西安高二调研)基因工程操作“四步曲”的正确顺序是( )
①目的基因的筛选与获取 ②将目的基因导入受体细胞 ③基因表达载体的构建 ④目的基因的检测与鉴定
A．①②③④ B．④①③②
C．①③②④ D．③①②④
答案 C
2．下列关于PCR技术的叙述，正确的是( )
A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B．该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术应用DNA半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
答案 D
解析 PCR技术扩增的目的基因序列不一定完全是已知的，A错误；该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不是互补的，C错误。
3．用PCR扩增下面的DNA片段：
5′GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG3′
3′CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC5′
供选择的引物有：
①5′GACCTGTGGAAGC3′
②5′CATACGGGATTG3′
③5′GTATGCCCTAAC3′
④5′CAATCCCGTATG3′
共四种，应选择( )
A．①② B．②③ C．③④ D．①④
答案 D
解析 用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端至3′端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5′端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5′端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5′端的碱基序列是5′GACCTGTGGAAGC和5′CAATCCCGTATG，故对应的引物为①④，D正确。
4．(2023·河北邢台高二月考)用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，经四轮循环后产物中有五种不同的DNA分子。下列有关叙述错误的是( )
A．第一轮循环得到2个DNA分子，即①②各一个
B．第二轮循环得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C．第三轮循环得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个⑤
D．第四轮循环得到16个DNA分子，其中有4个⑤
答案 D
解析 第四轮循环得到的16个DNA分子中，两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段有24－2×4＝8(个)，即有8个⑤，D错误。
题组二 基因表达载体的构建
5．基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是( )
A．载体能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”
B．载体能协助目的基因在受体细胞中复制
C．载体含有启动子和终止子协助目的基因表达
D．载体具有标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞
答案 A
解析 载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”，A错误；载体在受体细胞中能够稳定存在，并且自我复制，使目的基因数量扩大，B正确；启动子是RNA聚合酶的识别和结合的位点，能启动转录过程；终止子控制着转录的结束，所以载体含有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确；载体具有标记基因，标记基因便于筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。
6．下列关于基因表达载体的说法，不正确的是( )
A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
B．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C．终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程
D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同
答案 C
解析 基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA片段，终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，B正确，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。
7．(2023·银川高二阶段考)科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是( )
A．为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因
B．构建基因表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达
C．启动子是DNA聚合酶的识别和结合部位，可以驱动遗传信息的转录
D．基因表达载体中的标记基因可以用来鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞
答案 C
解析 启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，C错误。
8．(2023·江苏南通高二期中)如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列有关叙述正确的是( )
注：AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。
A．可选择的限制酶组合是酶E和酶G
B．所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因
C．用含氨苄青霉素的培养基就能筛选出含重组质粒的受体菌
D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到3个条带
答案 B
解析 酶E会破坏两种标记基因，为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A错误；重组质粒上的四环素抗性基因被破坏，而重组质粒上的氨苄青霉素抗性基因能表达，用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入普通质粒的受体菌，C错误；据图可知，因酶E有两个作用位点，同时用三种限制酶处理图中质粒，能将质粒切割成4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D错误。
9．RT－PCR是以提取的RNA为模板，经逆转录获得与之互补的DNA(cDNA)序列，再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增，具体过程如图所示。下列有关RT－PCR的叙述，正确的是( )
A．过程1需要使用耐高温的DNA聚合酶
B．过程2中的引物B可与mRNA互补配对
C．游离的脱氧核苷酸只能加到引物的5′端
D．RT－PCR可用于对RNA病毒的检测与鉴定
答案 D
解析 过程1是由mRNA形成单链DNA的过程，为逆转录，该过程需要逆转录酶，A错误；过程2中的引物B可与cDNA互补配对，而mRNA与cDNA碱基互补配对，则引物B和mRNA除碱基T和U的区别外，其余序列相同，不能互补配对，B错误；游离的脱氧核苷酸只能加到引物的3′端，C错误；利用RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测，并可提高检测的灵敏度(因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量，因此便于检测)，D正确。
10．研究人员用如图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点)，将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。下列叙述不正确的是( )
A．构建重组质粒的过程应选用Bcl Ⅰ 和Hind Ⅲ 两种限制酶
B．使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组
C．能在添加四环素的培养基上生存的一定是含有重组质粒的大肠杆菌
D．利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙
答案 C
解析 选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的两种标记基因都被破坏，因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，A正确；酶切后的质粒和目的基因片段要用DNA连接酶连接，构建重组载体，B正确；能在添加四环素的培养基上生存的也可能是只含有质粒的大肠杆菌，C错误；PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙，D正确。
11．(2023·哈尔滨高二期末)下列有关PCR的叙述，错误的是( )
A．PCR的原理是DNA半保留复制，解旋和复制不是同时进行的
B．PCR的过程主要包括变性→延伸→复性，温度逐渐降低
C．PCR技术扩增时，一个DNA分子经过n轮复制共需引物2n－1对
D．常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
答案 B
解析 PCR的原理是DNA半保留复制，PCR技术是在较高温度条件下打开双链后进行扩增的，是先解旋后复制，A正确；PCR的过程主要包括高温变性→低温复性→中温延伸，可见该过程中温度不是逐渐降低，B错误。
12．聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR引物的叙述，不正确的是( )
A．为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列
B．为了便于将扩增的DNA片段与载体连接，可在引物的3′端加上限制酶识别序列
C．在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化
D．复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关
答案 B
解析 引物自身不应存在互补序列，否则会出现引物与自身配对、引物跟引物配对情况，降低PCR的效率，A正确；引物引导子链合成的方向是5′端→3′端，因此为了便于扩增的DNA片段与载体连接，需要在引物的5′端加上限制酶识别序列，B错误；为了便于扩增的DNA片段与载体连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因能定向插入表达载体，避免目的基因自身环化，C正确；复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关，如引物中G与C含量高，需要设定更高的复性和延伸温度，D正确。
13．基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是______________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是____________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的_________。
(2)目前在PCR反应中不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_______________________。
(3)含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。含有某种限制酶的细胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的DNA，其原因可能有：①__________________________________________________
_________________________________；②____________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(4)利用PCR扩增目的基因的过程由高温变性(90 ℃以上)、低温复性(50 ℃左右)、适温延伸(72 ℃左右)三个步骤构成一个循环，为使得DNA聚合酶能够重复利用，选用的酶应在_______
__________处理后仍然具备催化活性。
答案 (1)解旋酶 加热至90 ℃以上 氢键 (2)大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 (3)①细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列 ②甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰 (4)90 ℃以上高温
14．(2023·江苏镇江高二联考)某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图1所示，请回答下列问题：
(1)将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状，这种新性状(变异性状)的来源属于____________________。
(2)如果将抗盐基因直接导入烟草细胞，一般情况下，烟草不会具有抗盐特性，原因是抗盐基因在烟草细胞中不能________，也不能______________________________________________。
(3)在构建重组质粒时，应选用__________________两种酶对质粒和含抗盐基因的DNA进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。
(4)如图2表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。
培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有____________、____________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是____________(填图2中的数字)菌落中的细菌。
答案 (1)基因重组 (2)复制 表达(或合成抗盐基因的mRNA) (3)SalⅠ和HindⅢ (4)氨苄青霉素 四环素(或氨苄青霉素和四环素) 4和6复制次数
1
2
3
n
DNA分子数
2
4
8
2n
含引物的DNA分子数
2
4
8
2n
含其中一种引物的DNA分子数
1＝21－1
3＝22－1
7＝23－1
2n－1
同时含两种引物的DNA分子数
0＝21－2
2＝22－2
6＝23－2
2n－2
共消耗引物的对数
1＝21－1
3＝22－1
7＝23－1
2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数
0＝21－2
0＝22－4
2＝23－6
2n－2n
[学习目标] 1.简述PCR的原理、条件及过程。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。
一、目的基因的筛选与获取
1．培育转基因抗虫棉的四个步骤
(1)目的基因的筛选与获取。
(2)基因表达载体的构建。
(3)将目的基因导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定。
2．目的基因
(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
(2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。
(3)类型：与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，即Bt基因。
3．筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
4．获取目的基因的方法
(1)人工合成目的基因。
(2)常用PCR特异性地快速扩增目的基因。
(3)通过构建基因文库来获取目的基因。
5．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
(2)原理：DNA半保留复制。
(3)基本条件
①场所：在一定的缓冲液中进行，其中一般要添加Mg2＋。
②模板：DNA母链。
③原料：4种脱氧核苷酸。
④酶：耐高温的DNA聚合酶。
⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(4)过程
①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。
②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(5)上一轮循环的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。
(6)鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
判断正误
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应( )
(2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚( )
(3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温( )
(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高( )
答案 (1)× (2)× (3)√ (4)√
解析 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸，DNA聚合酶催化子链的延伸。(2)PCR扩增技术中，高温使双链DNA解聚。
任务一：PCR扩增技术
图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
1．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。
提示 不是；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
2．图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？
提示 第3轮；1/4。
3．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
提示 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
4．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
提示 第1组：引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物 Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。
5．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
提示 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
6．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
提示 共需消耗2n－1对引物。
PCR中的数量关系
1．(2023·山西太原高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是( )
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
答案 A
解析 目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。
2．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是( )
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
答案 D
解析 由题图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的分子是7个，即占7/8，D错误。
二、基因表达载体的构建
1．基因表达载体构建的目的
让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
(1)首先用一定的限制酶切割载体。
(2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)。
判断正误
(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取( )
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子( )
(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因( )
答案 (1)× (2)× (3)√
解析 (1)基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。
任务二：分析基因表达载体构建的目的和方法
1．获取Bt基因后不能直接将它导入受体细胞，是因为游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。因此，获取Bt基因后，还需要借助载体将其导入棉花细胞，才能使棉花植株获得抗虫特性。
2．构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？
提示 启动子下游和终止子上游；因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。
3．请结合图示，回答下列问题：
(1)构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？为什么？
提示 不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因。该基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
(2)与只使用EcRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
提示 可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。
1．区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子
启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
2．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Pst Ⅰ，而不选择Sma Ⅰ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中Pst Ⅰ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择Pst Ⅰ 和EcR Ⅰ 两种限制酶。
拓展延伸 真、原核细胞基因的结构和表达
(1)基因的结构
(2)基因表达遗传信息
①原核生物基因
②真核生物基因
3．下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是( )
A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸
B．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件
C．人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达
D．由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
答案 B
解析 启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等，B错误；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。
4．(2023·江苏苏州高二期末)某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析不正确的是( )
A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
答案 C
解析 限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点，用HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；AluⅠ的切割位点位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；不宜选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，因为质粒中的两个标记基因均会被破坏，且DNA会反向连接至载体上，C错误；构建重组DNA时，选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。
题组一 目的基因的筛选与获取
1．(2023·陕西西安高二调研)基因工程操作“四步曲”的正确顺序是( )
①目的基因的筛选与获取 ②将目的基因导入受体细胞 ③基因表达载体的构建 ④目的基因的检测与鉴定
A．①②③④ B．④①③②
C．①③②④ D．③①②④
答案 C
2．下列关于PCR技术的叙述，正确的是( )
A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B．该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术应用DNA半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
答案 D
解析 PCR技术扩增的目的基因序列不一定完全是已知的，A错误；该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不是互补的，C错误。
3．用PCR扩增下面的DNA片段：
5′GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG3′
3′CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC5′
供选择的引物有：
①5′GACCTGTGGAAGC3′
②5′CATACGGGATTG3′
③5′GTATGCCCTAAC3′
④5′CAATCCCGTATG3′
共四种，应选择( )
A．①② B．②③ C．③④ D．①④
答案 D
解析 用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端至3′端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5′端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5′端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5′端的碱基序列是5′GACCTGTGGAAGC和5′CAATCCCGTATG，故对应的引物为①④，D正确。
4．(2023·河北邢台高二月考)用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，经四轮循环后产物中有五种不同的DNA分子。下列有关叙述错误的是( )
A．第一轮循环得到2个DNA分子，即①②各一个
B．第二轮循环得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C．第三轮循环得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个⑤
D．第四轮循环得到16个DNA分子，其中有4个⑤
答案 D
解析 第四轮循环得到的16个DNA分子中，两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段有24－2×4＝8(个)，即有8个⑤，D错误。
题组二 基因表达载体的构建
5．基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是( )
A．载体能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”
B．载体能协助目的基因在受体细胞中复制
C．载体含有启动子和终止子协助目的基因表达
D．载体具有标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞
答案 A
解析 载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”，A错误；载体在受体细胞中能够稳定存在，并且自我复制，使目的基因数量扩大，B正确；启动子是RNA聚合酶的识别和结合的位点，能启动转录过程；终止子控制着转录的结束，所以载体含有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确；载体具有标记基因，标记基因便于筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。
6．下列关于基因表达载体的说法，不正确的是( )
A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
B．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C．终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程
D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同
答案 C
解析 基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA片段，终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，B正确，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。
7．(2023·银川高二阶段考)科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是( )
A．为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因
B．构建基因表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达
C．启动子是DNA聚合酶的识别和结合部位，可以驱动遗传信息的转录
D．基因表达载体中的标记基因可以用来鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞
答案 C
解析 启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，C错误。
8．(2023·江苏南通高二期中)如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列有关叙述正确的是( )
注：AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。
A．可选择的限制酶组合是酶E和酶G
B．所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因
C．用含氨苄青霉素的培养基就能筛选出含重组质粒的受体菌
D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到3个条带
答案 B
解析 酶E会破坏两种标记基因，为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A错误；重组质粒上的四环素抗性基因被破坏，而重组质粒上的氨苄青霉素抗性基因能表达，用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入普通质粒的受体菌，C错误；据图可知，因酶E有两个作用位点，同时用三种限制酶处理图中质粒，能将质粒切割成4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D错误。
9．RT－PCR是以提取的RNA为模板，经逆转录获得与之互补的DNA(cDNA)序列，再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增，具体过程如图所示。下列有关RT－PCR的叙述，正确的是( )
A．过程1需要使用耐高温的DNA聚合酶
B．过程2中的引物B可与mRNA互补配对
C．游离的脱氧核苷酸只能加到引物的5′端
D．RT－PCR可用于对RNA病毒的检测与鉴定
答案 D
解析 过程1是由mRNA形成单链DNA的过程，为逆转录，该过程需要逆转录酶，A错误；过程2中的引物B可与cDNA互补配对，而mRNA与cDNA碱基互补配对，则引物B和mRNA除碱基T和U的区别外，其余序列相同，不能互补配对，B错误；游离的脱氧核苷酸只能加到引物的3′端，C错误；利用RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测，并可提高检测的灵敏度(因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量，因此便于检测)，D正确。
10．研究人员用如图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点)，将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。下列叙述不正确的是( )
A．构建重组质粒的过程应选用Bcl Ⅰ 和Hind Ⅲ 两种限制酶
B．使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组
C．能在添加四环素的培养基上生存的一定是含有重组质粒的大肠杆菌
D．利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙
答案 C
解析 选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的两种标记基因都被破坏，因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，A正确；酶切后的质粒和目的基因片段要用DNA连接酶连接，构建重组载体，B正确；能在添加四环素的培养基上生存的也可能是只含有质粒的大肠杆菌，C错误；PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙，D正确。
11．(2023·哈尔滨高二期末)下列有关PCR的叙述，错误的是( )
A．PCR的原理是DNA半保留复制，解旋和复制不是同时进行的
B．PCR的过程主要包括变性→延伸→复性，温度逐渐降低
C．PCR技术扩增时，一个DNA分子经过n轮复制共需引物2n－1对
D．常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
答案 B
解析 PCR的原理是DNA半保留复制，PCR技术是在较高温度条件下打开双链后进行扩增的，是先解旋后复制，A正确；PCR的过程主要包括高温变性→低温复性→中温延伸，可见该过程中温度不是逐渐降低，B错误。
12．聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR引物的叙述，不正确的是( )
A．为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列
B．为了便于将扩增的DNA片段与载体连接，可在引物的3′端加上限制酶识别序列
C．在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化
D．复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关
答案 B
解析 引物自身不应存在互补序列，否则会出现引物与自身配对、引物跟引物配对情况，降低PCR的效率，A正确；引物引导子链合成的方向是5′端→3′端，因此为了便于扩增的DNA片段与载体连接，需要在引物的5′端加上限制酶识别序列，B错误；为了便于扩增的DNA片段与载体连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因能定向插入表达载体，避免目的基因自身环化，C正确；复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关，如引物中G与C含量高，需要设定更高的复性和延伸温度，D正确。
13．基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是______________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是____________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的_________。
(2)目前在PCR反应中不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_______________________。
(3)含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。含有某种限制酶的细胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的DNA，其原因可能有：①__________________________________________________
_________________________________；②____________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(4)利用PCR扩增目的基因的过程由高温变性(90 ℃以上)、低温复性(50 ℃左右)、适温延伸(72 ℃左右)三个步骤构成一个循环，为使得DNA聚合酶能够重复利用，选用的酶应在_______
__________处理后仍然具备催化活性。
答案 (1)解旋酶 加热至90 ℃以上 氢键 (2)大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 (3)①细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列 ②甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰 (4)90 ℃以上高温
14．(2023·江苏镇江高二联考)某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图1所示，请回答下列问题：
(1)将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状，这种新性状(变异性状)的来源属于____________________。
(2)如果将抗盐基因直接导入烟草细胞，一般情况下，烟草不会具有抗盐特性，原因是抗盐基因在烟草细胞中不能________，也不能______________________________________________。
(3)在构建重组质粒时，应选用__________________两种酶对质粒和含抗盐基因的DNA进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。
(4)如图2表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。
培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有____________、____________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是____________(填图2中的数字)菌落中的细菌。
答案 (1)基因重组 (2)复制 表达(或合成抗盐基因的mRNA) (3)SalⅠ和HindⅢ (4)氨苄青霉素 四环素(或氨苄青霉素和四环素) 4和6复制次数
1
2
3
n
DNA分子数
2
4
8
2n
含引物的DNA分子数
2
4
8
2n
含其中一种引物的DNA分子数
1＝21－1
3＝22－1
7＝23－1
2n－1
同时含两种引物的DNA分子数
0＝21－2
2＝22－2
6＝23－2
2n－2
共消耗引物的对数
1＝21－1
3＝22－1
7＝23－1
2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数
0＝21－2
0＝22－4
2＝23－6
2n－2n
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