人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序优质课课件ppt

这是一份人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序优质课课件ppt

第三章 基因工程第2节基因工程的基本操作程序学习目标掌握目的基因的筛选与获取方法（生命观念、科学思维）学会基因表达载体构建的方法和要求（科学探究）理解目的基因导入受体细胞的具体过程（科学探究）掌握目的基因检测与鉴定的方法（科学探究、社会责任）掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法（科学探究）1997年,我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年,我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗?培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤?转基因抗虫棉的机制是抗虫基因（Bt基因）来源于苏云金杆菌，Bt基因表达的蛋白质具有杀虫活性。当害虫食用转基因抗虫棉花的时候，同时摄入Bt基因表达产生的蛋白质，这种蛋白质在害虫肠道内被激活，造成肠道穿孔，导致害虫死亡。培育转基因抗虫棉的步骤有：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建（核心）将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定新课讲授1一、目的基因的筛选与获取筛选合适的目的基因（1）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。（2）筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。例如：培育转基因抗虫棉目的基因获取的方法（3）利用PCR技术扩增目的基因（4）化学方法直接人工合成（2）从基因文库中获取目的基因（1）从生物组织中直接获取（1）从供体细胞直接获取目的基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。（2）鸟枪法的具体做法：用限制酶将供体细胞中的 DNA 切成许多片段，将这些片段分别构建表达载体，然后通过载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的 DNA （外源 DNA ）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫作扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的细胞分离出来，如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用该方法获得。（3）用“鸟枪法”获取目的基因的缺点是工作量大，具有一定的盲目性。目的基因获取的方法（2）从基因文库中获取目的基因基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。②cDNA文库：某种生物基因组转录的全部 mRNA 经反转录产生的cDNA 片段与适当的载体连接后导入受体菌，这样包含着全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为cDNA文库。③用DNA探针从基因文库中准确提取目的基因根据目的基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。用这一探针探查基因文库中已经变性的DNA片段，如果有一个DNA 片段能和探针片段互补而结合成双链（分子杂交），这一片段即含有所需要的基因。①基因文库的种类基因组文库：包含一种生物的全部基因部分基因文库：包含一种生物的一部分基因（如cDNA文库）基因组文库与cDNA文库的比较大小某种生物的全部基因某种生物的部分基因部分基因可以 可以（4）人工合成目的基因a反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：目的基因的mRNA双链DNA（目的基因）b化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：蛋白质的氨基酸序列利用PCR获取和扩增目的基因（1）PCR：是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。（2）PCR的反应条件及其作用提供相应稳定的pH环境；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活作为合成DNA子链的原料作为DNA复制的模板催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸变性：使DNA片段双链解开复性：使解开的两条DNA单链分别与相应的引物结合（退火）延伸：DNA聚合酶催化子链合成（3）PCR扩增的过程条件（3）PCR扩增的过程第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、 DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸以及酶促反应所需的离子等） ，使双链 DNA 两条链之间的氢键打开，变成单链，分别作为聚合反应的模板。这个过程称为 。第二步：将反应体系降 ，使引物分别与模板DNA链3’端的相应序列互补配对，这个过程称为 。第三步：将反应体系 ，在DNA聚合酶的催化作用下，将与模板DNA互补的单个核苷酸加到引物所提供的3’- OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的单链DNA，这个过程称为 。 加热至90℃以上变性温至50℃左右复性升温至72℃左右延伸上述三步反应完成后，一个DNA片段就变成了两个DNA片段，随着重复次数的增多， DNA 的数量就以约2n的倍数增加。 PCR 的反应过程都是在PCR扩增仪（PCR 仪）中完成的。完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。新课讲授2二、基因表达载体的构建目的基因工程的核心是基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成一个基因表达载体的组成，除了有目的基因外，还必须有启动子、终止子、标记基因等。（1）目的基因：指外源DNA分子的有效片段（4）标记基因的作用：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为标记基因。（2）启动子：启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类所需的蛋白质。（3）终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段，是转录过程终止的信号。基因表达载体的构建过程同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割新课讲授3三、将目的基因导入受体细胞转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是将目的基因整合到受体细胞基因组中。将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法①农杆菌的特点：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；农杆菌细胞内含有的 Ti 质粒上的 T - DNA 可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染色体 DNA 上。②转化过程：（2）基因枪法单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。将目的基因吸附在微小的金粒或钨粒表面，然后将微粒用基因枪高速射入受体细胞或组织。这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。（3）花粉管通道法将目的基因导入动物细胞（1）常用方法：显微注射技术（2）常用受体细胞：受精卵（3）基本操作程序：将含有目的基因的表达载体提纯获得受精卵早期胚胎培养将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。（2）操作过程：对受体细胞的常用处理方法是氯化钙法。首先用Ca2+处理大肠杆菌细胞→感受态细胞→将重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。①将基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌的常用方法是 Ca2+处理法。 Ca2+（或 CaCl2 溶液）对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。②目的基因能否在植物细胞内稳定保存并表达的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体 DNA 上（原理是基因重组）。③不同种类的受体细胞：对于植物来说，受体细胞可以是受精卵和体细胞；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，受精卵具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点。新课讲授4四、目的基因的检测与鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道（1）分子水平的检测a.PCR等技术在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。b.抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。（2）个体生物学水平的检测饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）感染（抗病接种实验）未出现病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常DNA片段的扩增及电泳鉴定实验原理（1）DNA 片段的扩增①利用 PCR 可以在体外进行 DNA 片段的扩增。② PCR 利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制 DNA双链的解聚与结合。③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次 PCR一般要经历30次循环。（2）DNA 片段的电泳鉴定① DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。② PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、 DNA 分子的大小和构象等有关。凝胶中的 DNA 分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来。材料用具（1）仪器（2）用具PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等方法步骤（1）DNA片段的扩增用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分（2）DNA片段的电泳鉴定配制琼脂糖溶液1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。1.下列有关PCR技术的说法，错误的是（ ）A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B.PCR技术的原理是DNA分子半保留复制C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA基础检测D