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高中第2节 基因工程的基本操作程序导学案
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这是一份高中第2节 基因工程的基本操作程序导学案，共16页。学案主要包含了理清主干知识，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定等内容，欢迎下载使用。
一、理清主干知识
基因工程的基本操作程序
eq \x(\a\al(目的基因的,筛选与获取))→eq \x(\a\al(基因表达载,体的构建))→eq \x(\a\al(将目的基因导,入受体细胞))→eq \x(\a\al(目的基因的,检测与鉴定))
一、目的基因的筛选与获取
1．目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因，它主要是指编码蛋白质的基因。
2．筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
3．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
(2)PCR反应的条件：一定的缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。
(3)PCR扩增的过程
(4)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
二、基因表达载体的构建
1．目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成及作用(连线)
三、将目的基因导入受体细胞
1．转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．将目的基因导入不同受体细胞的方法(连线)
四、目的基因的检测与鉴定(连线)
二、诊断自学效果
1．判断下列叙述的正误
(1)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均起始于启动子(×)
(2)目的基因导入双子叶植物细胞一般采用农杆菌转化法(√)
(3)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(×)
(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达(√)
(5)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原抗体杂交技术(×)
2．下列有关PCR的叙述，错误的是( )
A．PCR反应是一种酶促反应
B．PCR反应所需要的引物，化学本质为DNA或RNA片段
C．PCR反应所需要的DNA聚合酶与细胞内DNA复制所需的酶相同
D．PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行
解析：选C PCR反应需要DNA聚合酶催化，是一种酶促反应，A正确；PCR反应所需要的引物，化学本质为单链的DNA片段或RNA片段，B正确；PCR反应所需要的酶为耐高温的DNA聚合酶，以适应高温下的反应，与细胞内DNA复制所需的DNA聚合酶不同，C错误；为保证pH的稳定，PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，D正确。
3．下列关于基因表达载体的说法，错误的是( )
A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
B．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C．启动子位于目的基因的上游，能够启动翻译
D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同
解析：选C 基因表达载体使目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，是基因工程的核心步骤，A正确；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，B正确；启动子位于目的基因的上游，是驱动转录的一段DNA，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。
4．目的基因导入受体细胞后，是否可以维持稳定和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。下列不属于目的基因检测和鉴定的是( )
A．检测受体细胞是否有目的基因
B．检测受体细胞是否有致病基因
C．检测目的基因是否转录出mRNA
D．检测目的基因是否翻译成蛋白质
解析：选B 目的基因的检测包括：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，可以用PCR等技术；检测目的基因是否转录出mRNA，也可以用PCR等技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是进行抗原抗体杂交。
eq \a\vs4\al(新知探究一 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建)
[在探究中学明]
1．获取目的基因是实施基因工程的第一步，目前获取目的基因的常用方法有利用PCR获取和扩增目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因等。聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的。请结合已学过的DNA分子结构和复制的相关知识，回答下列问题：
(1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？
提示：所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。
(2)PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？
提示：不需要，只要知道目的基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。
(3)PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
提示：PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。
2．基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。填图并回答下列问题：
(1)完善基因表达载体构成图
(2)基因表达载体的构建需要限制酶和DNA连接酶。
(3)目的基因的插入位点是随意的吗？为什么？
提示：不是。基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原有的功能。
(4)启动子和终止子与起始密码子和终止密码子相同吗？
提示：不相同。启动子和终止子位于DNA上，是基因表达必需的部分；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
[在深化中提能]
1．聚合酶链式反应(PCR)
(1)PCR反应的过程
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
①变性：当温度超过到90 ℃时，双链DNA解聚为单链。
②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(2)PCR反应的结果
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，耐高温的DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数式扩增。
2．生物体内DNA复制与PCR反应的比较
3．构建基因表达载体的过程
目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。其过程大体为用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子(重组质粒)(如图)。
eq \a\vs4\al([典例]) 如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列说法错误的是( )
A．图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶
B．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
C．构建基因表达载体时需要用到限制酶SmaⅠ
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
[解析] 为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段及质粒自身连接成环状，图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶，A正确；抗卡那霉素基因作为标记基因，主要作用是筛选含有目的基因的受体细胞，B正确；限制酶SmaⅠ的识别序列和切割位点位于目的基因上，因此构建基因表达载体时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcRⅠ，C错误；基因表达载体一般包括目的基因(抗原基因)、标记基因(抗卡那霉素基因)、启动子和终止子等，D正确。
[答案] C
eq \a\vs4\al([方法规律])
构建基因表达载体时限制酶的选择
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免含目的基因的外源DNA片段和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶；但要确保质粒上也有这两种酶的切点。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。
[在应用中落实]
1．在基因表达载体的构建中，下列叙述错误的是( )
A．基因表达载体的构建方法不完全相同
B．有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
C．终止子的作用是终止翻译过程
D．基因表达载体的结构包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等
解析：选C 因为受体细胞有植物、动物、微生物细胞之分，且目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建方法是不完全相同的；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质；终止子的作用是使转录在所需要的地方停止，终止密码子的作用是使翻译在所需要的地方停止；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等。
2．(2020·济南期末)PCR是将某一特定DNA片段在体外酶的作用下，复制出许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段。 它的基本过程如下：
注：图中“”表示每次扩增过程中需要的引物。每个引物含20个脱氧核苷酸，并分别与DNA片段两端碱基互补，其作用是引导合成DNA子链。
请据图分析回答下列问题：
(1)PCR的原理是模拟生物体内__________的过程。
(2)PCR扩增过程中对DNA片段进行高温加热处理，其目的是________________________，其作用相当于细胞内________酶的作用。
(3)在③适温延伸过程中，必须加入一种特定的DNA聚合酶，从图示中可判断，该酶与一般人体细胞中的DNA聚合酶相比，最主要的特点是________。
(4)假如引物都用3H标记，从理论上计算，DNA片段经3次扩增所得的8个DNA分子中，含有3H标记的DNA分子占________%。
(5)假如DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，从理论上计算，除需要引物14个外，还需要游离的脱氧核苷酸________个。
解析：(1)PCR是指在体外模拟生物体内DNA分子复制的过程，因此其原理是DNA复制。(2)PCR扩增过程中对DNA片段进行高温加热处理，其目的是使DNA分子的双螺旋结构打开，形成单链DNA分子，而在生物体内DNA分子解旋形成单链是在解旋酶的作用下完成的。(3)在③适温延伸过程中，必须加入一种特定的DNA聚合酶，从图示中可判断，该酶与一般人体细胞中的DNA聚合酶相比，最主要的特点是耐高温。(4)DNA分子的复制方式为半保留复制，如果引物都用3H标记，从理论上计算，所得所有DNA分子中都含有3H标记。(5)DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，形成了8个DNA分子，其中只有两条DNA单链上没有引物，因此该过程中需要的游离脱氧核苷酸数是200×2×(8－1)－14×20＝2 520(个)。
答案：(1)DNA复制 (2)使DNA双链解开成为单链 解旋 (3)耐高温 (4)100 (5)2 520
eq \a\vs4\al(新知探究二 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定)
[在探究中学明]
1．将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。结合图1、图2、图3，根据教材相关内容完成下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法等，其中由我国科学家独创的一种方法是花粉管通道法，适用于双子叶植物和裸子植物的是农杆菌转化法。
(2)农杆菌转化法利用了农杆菌的什么特性？
提示：农杆菌中Ti质粒上的TDNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。
(3)为什么植物基因工程常用的受体细胞可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？
提示：植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。
(4)从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？
提示：不可以。因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。
2．目的基因导入受体细胞后，是否可以维持稳定和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否成功的一步。结合相关内容，回答下列问题：
(1)目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键是什么？如何检测？
提示：目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上，这是其能否在真核生物中稳定遗传的关键。可以用DNA分子杂交、PCR等技术进行检测。
(2)检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
提示：用叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。如果棉铃虫死亡，说明抗虫基因已经表达；否则，抗虫基因没有表达。
[在深化中提能]
1．目的基因导入不同受体细胞的过程
2．目的基因的检测与鉴定的方法
eq \a\vs4\al([典例]) 下列关于目的基因检测与鉴定的叙述，错误的是( )
A．可以根据受体细胞是否具有某种抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因
B．受体细胞必须表现出目的基因控制的特定性状，才能说明目的基因完成了表达过程
C．目的基因检测的第一步是检测目的基因是否插入到转基因生物的(染色体)DNA上
D．检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作成功
[解析] 目的基因成功导入受体细胞只是基因工程操作成功的必要一步，基因工程操作成功的标志是目的基因在受体细胞中成功表达。
[答案] D
[在应用中落实]
1．在将目的基因导入受体细胞的相关操作中，叙述正确的是( )
A．导入植物细胞时均采用农杆菌转化法
B．转基因动物的获得多数运用基因枪法
C．大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca2＋处理
D．导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成转基因动物
解析：选C 将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法；显微注射法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法；大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca2＋处理，使其成为感受态细胞；导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成早期胚胎，再经胚胎移植进入母体子宫内，其在母体子宫内发育成转基因动物。
2．(2020·济宁期末)2019年6月17日，新华社发布《屠呦呦团队放“大招”：“青蒿素抗药性”等研究获新突破》，屠呦呦团队近期提出应对“青蒿素抗药性”难题的切实可行治疗方案，并在“青蒿素治疗红斑狼疮等适应症”方面取得新进展。某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，让青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程图如下：
结合图示回答下列问题：
(1)酶1是________。利用PCR扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解旋为单链的条件是加热至90～95 ℃，目的是破坏DNA分子中的________键。
(2)在构建重组Ti质粒的过程中，需将目的基因插入Ti质粒的________中。
(3)检验目的基因是否整合到青蒿基因组中，可以将放射性同位素标记的________________________做成分子探针与青蒿基因组DNA杂交。理论上，与野生型相比，该探针与转基因青蒿DNA形成的杂交带的量________(填“较多”或“较少”)。
(4)判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的____________。
解析：(1)据图示可知，酶1催化逆转录的过程，故为逆转录酶；利用PCR扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解旋为单链的条件是加热超过90℃，目的是破坏DNA分子中的氢键，使DNA解旋为单链。(2)在构建重组Ti质粒的过程中，需将目的基因插入Ti质粒的TDNA中，以使目的基因转移到受体细胞的染色体DNA上。(3)检验目的基因是否整合到青蒿基因组中，可用DNA分子杂交法，即将fps基因、fps基因的mRNA做成分子探针与青蒿基因组DNA杂交。由于青蒿素产量增高，故与野生型相比，该探针与转基因青蒿DNA形成的杂交带的量较多。(4)判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的青蒿素产量，若产量增高，则说明达到了目的。
答案：(1)逆转录酶 氢 (2)TDNA (3)fps基因、fps基因的mRNA 较多 (4)青蒿素产量
eq \a\vs4\al(新知探究三 DNA片段的扩增及电泳鉴定)
[在探究中学明]
1．实验原理
(1)PCR反应的原理
PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合， PCR仪实质上就是一台能够自动控制温度的仪器。
(2)电泳鉴定的原理
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。
2．实验操作
[在深化中提能]
1．PCR过程中用到的重要仪器
(1)PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
(2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行PCR反应的场所。
(3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定戴好一次性手套。
eq \a\vs4\al([例1]) 下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
[解析] 在冰箱中放置的缓冲液和酶，取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。
[答案] C
eq \a\vs4\al([例2]) (2020·扬州一模)二倍体新疆野生油菜(P1)具有低芥酸、抗病虫等特性，为了改良二倍体甘蓝型油菜(P2)，研究人员将两种植物的体细胞进行融合获得了属间杂种F1，然后加入1对引物进行PCR鉴定，电泳结果如图所示。下列叙述错误的是( )
A．杂种F1的形成依赖细胞膜的流动性和细胞的全能性
B．杂种F1含4个染色体组
C．引物能与DNA上多个不同位点结合
D．电泳结果表明F11具有P1、P2的全部遗传信息
[解析] 植物体细胞的融合依赖细胞膜的流动性，形成新的植株依赖细胞的全能性，A正确；杂种F1为二倍体与二倍体的体细胞杂交体，因此F1含4个染色体组，B正确；从图中的电泳结果可以看出，电泳结果图上出现了多种DNA片段，这表明引物能与DNA上多个不同位点结合，C正确；从电泳图结果能够看到F11只具有P1、P2的部分遗传信息，D错误。
[答案] D
[在应用中落实]
1．获取目的基因的方法有多种，其中利用PCR可特异性地扩增目的基因，以下对PCR操作过程的叙述，正确的是( )
A．PCR扩增DNA时必须使用解旋酶和Taq DNA聚合酶
B．PCR过程中引物的作用是保证新链的合成方向为3′端→5′端
C．在95 ℃、55 ℃和72 ℃的温度下，Taq DNA聚合酶都有活性
D．高压灭菌的微量移液器枪头每吸取一种试剂后不需要更换
解析：选C PCR中通过高温解旋，因此不需要解旋酶；新链合成的方向是5′端→3′端；Taq DNA聚合酶耐高温，所以在上述三个温度下该酶均有活性；微量移液器枪头每吸取一种试剂后都需要更换。
2．用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱。其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是( )
A．PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B．3号样品为不含目的基因的载体DNA
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号确定反应体系等对结果没有干扰
解析：选B PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上都应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号为蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D正确。
[课堂巩固落实]
1．下列对基因工程的叙述，正确的是( )
A．基因工程必须使用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和RNA聚合酶
B．基因工程的核心步骤是将目的基因导入受体细胞
C．载体上的标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞
D．目的基因是否表达可通过PCR来检测
解析：选C 基因工程使用的工具酶是限制酶和DNA连接酶，其核心步骤是基因表达载体的构建；标记基因的作用是鉴别和筛选含目的基因的细胞；目的基因是否表达可通过PCR和抗原抗体杂交来检测，因为基因表达包括转录和翻译两个过程。
2．下列有关PCR的叙述，错误的是( )
A．变性过程破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C．延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶和四种核糖核苷酸等
D．利用DNA双链复制的原理
解析：选C 变性过程破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，A正确；引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列，B正确；延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸等，C错误；PCR的原理是DNA双链复制，D正确。
3．如图为科学家利用耐盐碱植物中的耐盐基因培育耐盐水稻新品系的过程。下列相关说法错误的是( )
A．阶段Ⅰ、Ⅱ应用的技术分别是重组DNA技术、植物组织培养技术
B．对耐盐基因表达产物的检测可采用抗原抗体杂交技术
C．可用抗生素抗性基因作为探针来检测受体细胞中是否导入了目的基因
D．可用PCR检测受体细胞中的耐盐基因是否转录出mRNA
解析：选C 阶段Ⅰ将目的基因导入水稻细胞需要采用重组DNA技术，阶段Ⅱ将水稻细胞培养成完整植株需要采用植物组织培养技术，A正确；耐盐基因表达产物是蛋白质，可用抗原抗体杂交技术检测，B正确；可以用含有耐盐基因的DNA探针检测细胞中是否插入了目的基因，而不能用抗生素抗性基因作为探针来检测目的基因，C错误；可用PCR检测受体细胞中的耐盐基因是否转录出mRNA，D正确。
4．(2019·全国卷Ⅰ，节选)基因工程中可以通过PCR扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(2)目前在PCR反应中使用Taq酶(耐高温的DNA聚合酶)而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，通过解旋酶解开DNA双链。在体外利用PCR扩增目的基因时，通过高温(超过90 ℃)使反应体系中的模板DNA解聚为单链。上述两个解链过程的共同点是破坏了双链DNA分子中的氢键。(2)大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，故在PCR反应中要用能耐高温的Taq酶。
答案：(1)解旋酶 加热超过90 ℃ 氢键 (2)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
学有目标——新课程标准必明
记在平时——核心语句必背
1.阐明基因工程的基本操作程序主要包括哪些步骤。
2．阐述基因工程每个操作步骤涉及的技术和方法。
3．利用聚合酶链式反应扩增DNA片段并完成电泳鉴定。
1.PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。
2．基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3．目的基因导入植物细胞常用花粉管通道法和农杆菌转化法，导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。
4．检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA常用PCR等技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原抗体杂交技术。
比较项目
体内DNA复制
PCR反应
解旋
在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开
90 ℃以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶
酶
解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
耐高温的DNA聚合酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接
分别从两条链的引物的3′端开始延伸，都是连续合成
过程
循环次数
受生物体自身控制
30多次
产物
完整DNA
两个引物之间的DNA片段
相同点
都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则
项目
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
类型
检测内容
方法
结果显示
分子水平检测
目的基因是否插入转基因生物的DNA上
DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)或PCR等
是否成功
显示出杂交带
目的基因是否转录出mRNA
核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)或PCR等
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间)
个体生物
学水平
鉴定
是否具有抗性及抗性程度
对转基因生物进行抗性的接种实验
是否赋予了
预期抗性或
蛋白质活性
基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同
比较基因工程产品与天然产品的功能活性
一、理清主干知识
基因工程的基本操作程序
eq \x(\a\al(目的基因的,筛选与获取))→eq \x(\a\al(基因表达载,体的构建))→eq \x(\a\al(将目的基因导,入受体细胞))→eq \x(\a\al(目的基因的,检测与鉴定))
一、目的基因的筛选与获取
1．目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因，它主要是指编码蛋白质的基因。
2．筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
3．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
(2)PCR反应的条件：一定的缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。
(3)PCR扩增的过程
(4)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
二、基因表达载体的构建
1．目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成及作用(连线)
三、将目的基因导入受体细胞
1．转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．将目的基因导入不同受体细胞的方法(连线)
四、目的基因的检测与鉴定(连线)
二、诊断自学效果
1．判断下列叙述的正误
(1)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均起始于启动子(×)
(2)目的基因导入双子叶植物细胞一般采用农杆菌转化法(√)
(3)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(×)
(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达(√)
(5)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原抗体杂交技术(×)
2．下列有关PCR的叙述，错误的是( )
A．PCR反应是一种酶促反应
B．PCR反应所需要的引物，化学本质为DNA或RNA片段
C．PCR反应所需要的DNA聚合酶与细胞内DNA复制所需的酶相同
D．PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行
解析：选C PCR反应需要DNA聚合酶催化，是一种酶促反应，A正确；PCR反应所需要的引物，化学本质为单链的DNA片段或RNA片段，B正确；PCR反应所需要的酶为耐高温的DNA聚合酶，以适应高温下的反应，与细胞内DNA复制所需的DNA聚合酶不同，C错误；为保证pH的稳定，PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，D正确。
3．下列关于基因表达载体的说法，错误的是( )
A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
B．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C．启动子位于目的基因的上游，能够启动翻译
D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同
解析：选C 基因表达载体使目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，是基因工程的核心步骤，A正确；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，B正确；启动子位于目的基因的上游，是驱动转录的一段DNA，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。
4．目的基因导入受体细胞后，是否可以维持稳定和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。下列不属于目的基因检测和鉴定的是( )
A．检测受体细胞是否有目的基因
B．检测受体细胞是否有致病基因
C．检测目的基因是否转录出mRNA
D．检测目的基因是否翻译成蛋白质
解析：选B 目的基因的检测包括：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，可以用PCR等技术；检测目的基因是否转录出mRNA，也可以用PCR等技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是进行抗原抗体杂交。
eq \a\vs4\al(新知探究一 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建)
[在探究中学明]
1．获取目的基因是实施基因工程的第一步，目前获取目的基因的常用方法有利用PCR获取和扩增目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因等。聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的。请结合已学过的DNA分子结构和复制的相关知识，回答下列问题：
(1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？
提示：所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。
(2)PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？
提示：不需要，只要知道目的基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。
(3)PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
提示：PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。
2．基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。填图并回答下列问题：
(1)完善基因表达载体构成图
(2)基因表达载体的构建需要限制酶和DNA连接酶。
(3)目的基因的插入位点是随意的吗？为什么？
提示：不是。基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原有的功能。
(4)启动子和终止子与起始密码子和终止密码子相同吗？
提示：不相同。启动子和终止子位于DNA上，是基因表达必需的部分；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
[在深化中提能]
1．聚合酶链式反应(PCR)
(1)PCR反应的过程
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
①变性：当温度超过到90 ℃时，双链DNA解聚为单链。
②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(2)PCR反应的结果
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，耐高温的DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数式扩增。
2．生物体内DNA复制与PCR反应的比较
3．构建基因表达载体的过程
目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。其过程大体为用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子(重组质粒)(如图)。
eq \a\vs4\al([典例]) 如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列说法错误的是( )
A．图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶
B．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
C．构建基因表达载体时需要用到限制酶SmaⅠ
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
[解析] 为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段及质粒自身连接成环状，图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶，A正确；抗卡那霉素基因作为标记基因，主要作用是筛选含有目的基因的受体细胞，B正确；限制酶SmaⅠ的识别序列和切割位点位于目的基因上，因此构建基因表达载体时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcRⅠ，C错误；基因表达载体一般包括目的基因(抗原基因)、标记基因(抗卡那霉素基因)、启动子和终止子等，D正确。
[答案] C
eq \a\vs4\al([方法规律])
构建基因表达载体时限制酶的选择
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免含目的基因的外源DNA片段和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶；但要确保质粒上也有这两种酶的切点。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。
[在应用中落实]
1．在基因表达载体的构建中，下列叙述错误的是( )
A．基因表达载体的构建方法不完全相同
B．有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
C．终止子的作用是终止翻译过程
D．基因表达载体的结构包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等
解析：选C 因为受体细胞有植物、动物、微生物细胞之分，且目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建方法是不完全相同的；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质；终止子的作用是使转录在所需要的地方停止，终止密码子的作用是使翻译在所需要的地方停止；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等。
2．(2020·济南期末)PCR是将某一特定DNA片段在体外酶的作用下，复制出许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段。 它的基本过程如下：
注：图中“”表示每次扩增过程中需要的引物。每个引物含20个脱氧核苷酸，并分别与DNA片段两端碱基互补，其作用是引导合成DNA子链。
请据图分析回答下列问题：
(1)PCR的原理是模拟生物体内__________的过程。
(2)PCR扩增过程中对DNA片段进行高温加热处理，其目的是________________________，其作用相当于细胞内________酶的作用。
(3)在③适温延伸过程中，必须加入一种特定的DNA聚合酶，从图示中可判断，该酶与一般人体细胞中的DNA聚合酶相比，最主要的特点是________。
(4)假如引物都用3H标记，从理论上计算，DNA片段经3次扩增所得的8个DNA分子中，含有3H标记的DNA分子占________%。
(5)假如DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，从理论上计算，除需要引物14个外，还需要游离的脱氧核苷酸________个。
解析：(1)PCR是指在体外模拟生物体内DNA分子复制的过程，因此其原理是DNA复制。(2)PCR扩增过程中对DNA片段进行高温加热处理，其目的是使DNA分子的双螺旋结构打开，形成单链DNA分子，而在生物体内DNA分子解旋形成单链是在解旋酶的作用下完成的。(3)在③适温延伸过程中，必须加入一种特定的DNA聚合酶，从图示中可判断，该酶与一般人体细胞中的DNA聚合酶相比，最主要的特点是耐高温。(4)DNA分子的复制方式为半保留复制，如果引物都用3H标记，从理论上计算，所得所有DNA分子中都含有3H标记。(5)DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，形成了8个DNA分子，其中只有两条DNA单链上没有引物，因此该过程中需要的游离脱氧核苷酸数是200×2×(8－1)－14×20＝2 520(个)。
答案：(1)DNA复制 (2)使DNA双链解开成为单链 解旋 (3)耐高温 (4)100 (5)2 520
eq \a\vs4\al(新知探究二 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定)
[在探究中学明]
1．将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。结合图1、图2、图3，根据教材相关内容完成下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法等，其中由我国科学家独创的一种方法是花粉管通道法，适用于双子叶植物和裸子植物的是农杆菌转化法。
(2)农杆菌转化法利用了农杆菌的什么特性？
提示：农杆菌中Ti质粒上的TDNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。
(3)为什么植物基因工程常用的受体细胞可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？
提示：植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。
(4)从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？
提示：不可以。因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。
2．目的基因导入受体细胞后，是否可以维持稳定和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否成功的一步。结合相关内容，回答下列问题：
(1)目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键是什么？如何检测？
提示：目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上，这是其能否在真核生物中稳定遗传的关键。可以用DNA分子杂交、PCR等技术进行检测。
(2)检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
提示：用叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。如果棉铃虫死亡，说明抗虫基因已经表达；否则，抗虫基因没有表达。
[在深化中提能]
1．目的基因导入不同受体细胞的过程
2．目的基因的检测与鉴定的方法
eq \a\vs4\al([典例]) 下列关于目的基因检测与鉴定的叙述，错误的是( )
A．可以根据受体细胞是否具有某种抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因
B．受体细胞必须表现出目的基因控制的特定性状，才能说明目的基因完成了表达过程
C．目的基因检测的第一步是检测目的基因是否插入到转基因生物的(染色体)DNA上
D．检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作成功
[解析] 目的基因成功导入受体细胞只是基因工程操作成功的必要一步，基因工程操作成功的标志是目的基因在受体细胞中成功表达。
[答案] D
[在应用中落实]
1．在将目的基因导入受体细胞的相关操作中，叙述正确的是( )
A．导入植物细胞时均采用农杆菌转化法
B．转基因动物的获得多数运用基因枪法
C．大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca2＋处理
D．导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成转基因动物
解析：选C 将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法；显微注射法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法；大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca2＋处理，使其成为感受态细胞；导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成早期胚胎，再经胚胎移植进入母体子宫内，其在母体子宫内发育成转基因动物。
2．(2020·济宁期末)2019年6月17日，新华社发布《屠呦呦团队放“大招”：“青蒿素抗药性”等研究获新突破》，屠呦呦团队近期提出应对“青蒿素抗药性”难题的切实可行治疗方案，并在“青蒿素治疗红斑狼疮等适应症”方面取得新进展。某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，让青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程图如下：
结合图示回答下列问题：
(1)酶1是________。利用PCR扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解旋为单链的条件是加热至90～95 ℃，目的是破坏DNA分子中的________键。
(2)在构建重组Ti质粒的过程中，需将目的基因插入Ti质粒的________中。
(3)检验目的基因是否整合到青蒿基因组中，可以将放射性同位素标记的________________________做成分子探针与青蒿基因组DNA杂交。理论上，与野生型相比，该探针与转基因青蒿DNA形成的杂交带的量________(填“较多”或“较少”)。
(4)判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的____________。
解析：(1)据图示可知，酶1催化逆转录的过程，故为逆转录酶；利用PCR扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解旋为单链的条件是加热超过90℃，目的是破坏DNA分子中的氢键，使DNA解旋为单链。(2)在构建重组Ti质粒的过程中，需将目的基因插入Ti质粒的TDNA中，以使目的基因转移到受体细胞的染色体DNA上。(3)检验目的基因是否整合到青蒿基因组中，可用DNA分子杂交法，即将fps基因、fps基因的mRNA做成分子探针与青蒿基因组DNA杂交。由于青蒿素产量增高，故与野生型相比，该探针与转基因青蒿DNA形成的杂交带的量较多。(4)判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的青蒿素产量，若产量增高，则说明达到了目的。
答案：(1)逆转录酶 氢 (2)TDNA (3)fps基因、fps基因的mRNA 较多 (4)青蒿素产量
eq \a\vs4\al(新知探究三 DNA片段的扩增及电泳鉴定)
[在探究中学明]
1．实验原理
(1)PCR反应的原理
PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合， PCR仪实质上就是一台能够自动控制温度的仪器。
(2)电泳鉴定的原理
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。
2．实验操作
[在深化中提能]
1．PCR过程中用到的重要仪器
(1)PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
(2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行PCR反应的场所。
(3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定戴好一次性手套。
eq \a\vs4\al([例1]) 下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
[解析] 在冰箱中放置的缓冲液和酶，取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。
[答案] C
eq \a\vs4\al([例2]) (2020·扬州一模)二倍体新疆野生油菜(P1)具有低芥酸、抗病虫等特性，为了改良二倍体甘蓝型油菜(P2)，研究人员将两种植物的体细胞进行融合获得了属间杂种F1，然后加入1对引物进行PCR鉴定，电泳结果如图所示。下列叙述错误的是( )
A．杂种F1的形成依赖细胞膜的流动性和细胞的全能性
B．杂种F1含4个染色体组
C．引物能与DNA上多个不同位点结合
D．电泳结果表明F11具有P1、P2的全部遗传信息
[解析] 植物体细胞的融合依赖细胞膜的流动性，形成新的植株依赖细胞的全能性，A正确；杂种F1为二倍体与二倍体的体细胞杂交体，因此F1含4个染色体组，B正确；从图中的电泳结果可以看出，电泳结果图上出现了多种DNA片段，这表明引物能与DNA上多个不同位点结合，C正确；从电泳图结果能够看到F11只具有P1、P2的部分遗传信息，D错误。
[答案] D
[在应用中落实]
1．获取目的基因的方法有多种，其中利用PCR可特异性地扩增目的基因，以下对PCR操作过程的叙述，正确的是( )
A．PCR扩增DNA时必须使用解旋酶和Taq DNA聚合酶
B．PCR过程中引物的作用是保证新链的合成方向为3′端→5′端
C．在95 ℃、55 ℃和72 ℃的温度下，Taq DNA聚合酶都有活性
D．高压灭菌的微量移液器枪头每吸取一种试剂后不需要更换
解析：选C PCR中通过高温解旋，因此不需要解旋酶；新链合成的方向是5′端→3′端；Taq DNA聚合酶耐高温，所以在上述三个温度下该酶均有活性；微量移液器枪头每吸取一种试剂后都需要更换。
2．用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱。其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是( )
A．PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B．3号样品为不含目的基因的载体DNA
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号确定反应体系等对结果没有干扰
解析：选B PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上都应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号为蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D正确。
[课堂巩固落实]
1．下列对基因工程的叙述，正确的是( )
A．基因工程必须使用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和RNA聚合酶
B．基因工程的核心步骤是将目的基因导入受体细胞
C．载体上的标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞
D．目的基因是否表达可通过PCR来检测
解析：选C 基因工程使用的工具酶是限制酶和DNA连接酶，其核心步骤是基因表达载体的构建；标记基因的作用是鉴别和筛选含目的基因的细胞；目的基因是否表达可通过PCR和抗原抗体杂交来检测，因为基因表达包括转录和翻译两个过程。
2．下列有关PCR的叙述，错误的是( )
A．变性过程破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C．延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶和四种核糖核苷酸等
D．利用DNA双链复制的原理
解析：选C 变性过程破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，A正确；引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列，B正确；延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸等，C错误；PCR的原理是DNA双链复制，D正确。
3．如图为科学家利用耐盐碱植物中的耐盐基因培育耐盐水稻新品系的过程。下列相关说法错误的是( )
A．阶段Ⅰ、Ⅱ应用的技术分别是重组DNA技术、植物组织培养技术
B．对耐盐基因表达产物的检测可采用抗原抗体杂交技术
C．可用抗生素抗性基因作为探针来检测受体细胞中是否导入了目的基因
D．可用PCR检测受体细胞中的耐盐基因是否转录出mRNA
解析：选C 阶段Ⅰ将目的基因导入水稻细胞需要采用重组DNA技术，阶段Ⅱ将水稻细胞培养成完整植株需要采用植物组织培养技术，A正确；耐盐基因表达产物是蛋白质，可用抗原抗体杂交技术检测，B正确；可以用含有耐盐基因的DNA探针检测细胞中是否插入了目的基因，而不能用抗生素抗性基因作为探针来检测目的基因，C错误；可用PCR检测受体细胞中的耐盐基因是否转录出mRNA，D正确。
4．(2019·全国卷Ⅰ，节选)基因工程中可以通过PCR扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(2)目前在PCR反应中使用Taq酶(耐高温的DNA聚合酶)而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，通过解旋酶解开DNA双链。在体外利用PCR扩增目的基因时，通过高温(超过90 ℃)使反应体系中的模板DNA解聚为单链。上述两个解链过程的共同点是破坏了双链DNA分子中的氢键。(2)大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，故在PCR反应中要用能耐高温的Taq酶。
答案：(1)解旋酶 加热超过90 ℃ 氢键 (2)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
学有目标——新课程标准必明
记在平时——核心语句必背
1.阐明基因工程的基本操作程序主要包括哪些步骤。
2．阐述基因工程每个操作步骤涉及的技术和方法。
3．利用聚合酶链式反应扩增DNA片段并完成电泳鉴定。
1.PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。
2．基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3．目的基因导入植物细胞常用花粉管通道法和农杆菌转化法，导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。
4．检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA常用PCR等技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原抗体杂交技术。
比较项目
体内DNA复制
PCR反应
解旋
在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开
90 ℃以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶
酶
解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
耐高温的DNA聚合酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接
分别从两条链的引物的3′端开始延伸，都是连续合成
过程
循环次数
受生物体自身控制
30多次
产物
完整DNA
两个引物之间的DNA片段
相同点
都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则
项目
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
类型
检测内容
方法
结果显示
分子水平检测
目的基因是否插入转基因生物的DNA上
DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)或PCR等
是否成功
显示出杂交带
目的基因是否转录出mRNA
核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)或PCR等
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间)
个体生物
学水平
鉴定
是否具有抗性及抗性程度
对转基因生物进行抗性的接种实验
是否赋予了
预期抗性或
蛋白质活性
基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同
比较基因工程产品与天然产品的功能活性
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