生物选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序优质ppt课件

这是一份生物选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序优质ppt课件，共60页。PPT课件主要包含了Step03，不一定，如何判断，目的基因的检测与鉴定，Step04，PCR反应体系的配方，概念检测，拓展应用等内容，欢迎下载使用。
将目的基因导入受体细胞
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。
由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。
花粉管通道法、农杆菌转化法、基因枪法
Ca2+处理法(感受态细胞法)
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
我国科学家独创的一种方法
在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
农杆菌中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单生活在土壤子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
感染植物细胞后转入目的基因
T-DNA及其中的目的基因成功整合到植物染色体
猜测单子叶植物细胞为什么不适用农杆菌转化法？
可能损伤时无法分泌酚类物质。
伤口分泌酚类物质和糖类物质
吸引农杆菌向受伤组织集中
将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞染色体DNA上。
激活Vir区基因，导致T-DNA加工和转移
【特点】易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；受体细胞为_______
可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；受体细胞为_______
该过程经过__次拼接、__次导入
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
目的基因插入植物细胞染色体DNA中
将含有目的基因的表达载体采用显微注射仪显微注射到受精卵(卵细胞也还行)；受精后经胚胎早期培养，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。
雌性动物的输卵管或子宫内
用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。
重组 Ti质粒
基因工程得以实现的理论基础
不同生物的DNA分子的结构基本相同，都以4种脱氧核苷酸为基本组成单位，具有独特的双螺旋结构。
外源基因在受体细胞中能表达的原因
基因是控制生物性状的基本遗传单位，其表达具有一定的独立性，不同生物的基因在表达时都遵循“中心法则”，在受体细胞内定向表达。
所有生物共同一套遗传密码。
按前面导入进行了操作，
是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？
是否可以确定目的基因一定能够进行表达？
是否可以确定得到了新的性状？
在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译成蛋白质
基因是否插入染色体DNA（存在）
方法： PCR扩增或DNA分子杂交技术
① 首先取出转基因生物的基因组DNA。
② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针。
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带, 表明目的基因已插入染色体DNA中。
方法： PCR或DNA分子杂交技术
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA。
方法：抗原-抗体杂交技术
加入标记的二抗与一抗结合
提取蛋白 | 电泳分离
大肠杆菌-部分包括RP4
方法：抗虫鉴定、抗病鉴定
接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。
与天然产品的功能进行活性比较
DNA片段的扩增及电泳鉴定
①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环。
②PCR扩增DNA片段还利用______________的原理。
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是_____。
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定。
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关。
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
自动控温，实现DNA的扩增
实际上是进行PCR反应的场所
用于向微量离心管转移PCR配方中的液体
微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头
4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。(离心管)
电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
PCR反应体系的配方（见下页）
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
DNA片段的扩增 → PCR技术
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
① 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
PCR扩增不能随意加大试剂用量。
1. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
【1】研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）ap基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 ( )
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶 ( )
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。( )
【2】利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 ( )
PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP 和4种核糖核苷酸
【1】研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
提示: 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插人。大多数情况下，插人的位点难以做到定点插人;插人的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
【2】八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtI基因转人水稻，使水稻胚乳中富含B-胡萝卜素。由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将crtI和psy基因导人含pmi基因的质粒中，构建了质粒 pSYN12424。该项研究的目的基因是______________ ，标记基因是________，质粒pSYN12424的作用是_____________________。
crtI基因和psy基因
将目的基因送入水稻细胞
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列?为什么?
提示 不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。