人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序精品课件ppt

这是一份人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序精品课件ppt，共60页。PPT课件主要包含了学习目标，目的基因的筛选与获取，Step01，穆利斯，基因表达载体的构建，Step02，当堂巩固等内容，欢迎下载使用。
基于PCR技术，运用结构与功能观等理解PCR技术的过程、原理、条件等内容。
基于抗虫棉的培育实例，采用文字和图示的方式说明基因工程的基本操作程序。
尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
基因工程的基本操作程序
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉
2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药使用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
抗虫基因 （Bt抗虫蛋白基因）
1.目的基因的筛选与获取（前提）
2.基因表达载体的构建（核心）
3.将目的基因导入受体细胞（关键）
普通棉花 （无抗虫特性）
抗虫基因已插入染色体DNA中
棉花细胞（含抗虫基因）
4.目的基因的检测与鉴定（保证）
培育转基因抗虫棉的简要过程
1、目的基因的筛选与获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
【思考】假如想通过新冠基因组的特定基因研究核酸检测，如何筛选和获取目的基因呢？
外显子：转录后翻译，编码蛋白质的合成
内含子：转录后被切除，不翻译
原核生物：无内含子，其编码区是连续的真核生物：有内含子，其编码区是间断的、不连续的。
非编码序列：不能编码蛋白质的片段，包括非编码区和内含子 编码序列 ：能编码蛋白质的片段，即外显子
破坏鳞翅目昆虫的消化系统
目的基因—Bt抗虫蛋白基因（简称Bt基因）
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
2.筛选目的基因的技术手段
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
（如GenBank）
01 / 从基因文库中获取
02 / 通过DNA合成仪直接合成
03 / 利用PCR获取和扩增目的基因
含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体
部分基因文库（主要是cDNA文库）
含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子
cDNA文库中的基因不含以上结构
cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成
与载体连接导入受体菌群
mRNA （某一发育时期）
双链cDNA（cDNA）
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
PCR—聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR发明者、美国生物化学家穆利斯
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
Kary Banks Mullis
THE NOBEL PRICE IN CHEMISTRY 1993
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献
PCR从畅想到实现，真的就是穆里斯一个人的功劳吗？其实这里也有中国人的贡献。1972年，穆里斯在加州大学伯克利分校获得有机合成专业博士学位。1979年，他进入“西特斯”（Cetus)生物技术公司任职，负责合成供实验用的寡核苷酸（短链的DNA分子）。1983年8月，他首次在公司里做了有关PCR原理的报告，但大家反应冷淡，认为这个原理太简单了，如果可行，早就有人做了。1986年5月，穆里斯经公司主管向沃森推荐，第一次受邀在一次“人类分子生物学”专题研讨会上做了PCR原理及实验应用的报告，这形成了先入为主的印象，即PCR是穆里斯一人发明的，为此，1993年穆里斯获得诺贝尔化学奖。然而，将PCR变成真正成熟技术的“临门一脚”，则是由中国科学家钱嘉韵完成的，是她发现并分离
了耐高温的DNA聚合酶。钱嘉韵是我国台湾的科学家，她是第一个报道分离耐高温DNA聚合酶工作的人。1973年，钱嘉韵就读于美国俄亥俄州辛辛那提大学生物系，她的导师对在黄石国家公园热泉中发现的嗜热菌十分好奇，他让钱嘉韵以该菌作为研究对象。钱嘉韵不负师望，从该菌中成功地分离了耐高温的DNA聚合酶，并于1976年在《细菌学杂志》上以第一作者身份发表了相关论文。这篇论文在科学界被广泛引用。 “西特斯”公司的工作人员正是按照钱嘉韵等人发明的操作步骤，才成功地分离了这种DNA聚合酶，并将其用于PCR。该酶不但专里斯一人发明的，为此，1993年穆里斯获得一性和活性优于之前使用的DNA聚合酶，而且它使PCR变得十分简捷，大大降低了成本。自此，PCR被逐渐推广应用。
知道目的基因的两端核苷酸序列，基因又比较大
结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？
体内DNA复制要点回顾
游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C）
DNA解旋酶、DNA聚合酶等
碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）
稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸（dNTP）
耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始台成子链，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。
3. PCR反应的过程
当温度上升到_____以上时，______ 断裂，双链DNA解聚为两条________。
【思考】变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
当温度下降到50℃左右时，两种_______通过____________与两条单链DNA结合。
【思考】复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。
① 模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。② 加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【1】为什么温度要上升至72℃？
【2】Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
小结 | PCR重复多次后,DNA分子呈指数形式扩增（约为2n）
PCR反应过程示意图
PCR技术与细胞内DNA复制的比较（区别）
解旋酶催化，边解旋边复制
解旋酶、DNA聚合酶等
高温变性解旋，全部解旋后再复制
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
在不同温度(较高)下进行
扩增特定的DNA片段或基因
PCR技术与细胞内DNA复制的比较（联系）
① 模板 均需要脱氧核苷酸双链作为模板
③ 原料 均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
② 酶 均需DNA聚合酶
④ 引物 都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链
不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
获得目的基因后直接转入受体吗？
构建基因表达载体的目的
使目的基因可以遗传给下一代
使目的基因在受体细胞中稳定存在
使目的基因能够表达和发挥作用
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作
让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代。
一段特殊DNA序列，位于基因的上游，终止转录。
一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。
（1）基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了________ 。
（2）目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入________________________ ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
基因表达载体构建的流程
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程
用限制酶切割载体，使它出现一个缺口
用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因
用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子（基因表达载体、重组质粒）。
产生相同的黏性末端，以便进行连接
（2）DNA连接酶处理后会出现几种产物：
目的基因与目的基因连接
质粒重新环化、目的基因自身环化、质粒与目的基因反向连接
如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？
防止目的基因与载体的反向连接
防止目的基因和载体的自身环化
【1】PCR技术扩增DNA，需要的条件是（　　）
④mRNA   ⑤DNA聚合酶等   ⑥核糖体
①目的基因   ②引物   ③四种脱氧核苷酸  
【2】下列有关PCR的叙述，错误的是（       ）
PCR扩增过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
用于PCR扩增的DNA聚合酶是一种耐高温的酶
延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
【3】下列有关基因表达载体的叙述，错误的是（      ）
具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增
具有启动子，作为翻译多肽链的起始信号
具有标记基因，有利于目的基因的检测和筛选
具有目的基因，以获得特定的基因表达产物