高中基因工程的基本操作程序教学课件ppt

这是一份高中基因工程的基本操作程序教学课件ppt，共60页。PPT课件主要包含了情境导入，课堂小结，探究新知，课堂练习等内容，欢迎下载使用。
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤?
一.目的基因的筛选与获取二.基因表达载体的构建
三.将目的基因导入受体细胞
四.目的基因的检测与鉴定
五.DNA片段的扩增及电泳鉴定
普通棉花（无抗虫特性）
1.目的基因的筛选与获取（前提）
2.基因表达载体的构建（核心）
3.将目的基因导入受体细胞（关键）
4.目的基因的检测与鉴定
培育转基因抗虫棉的简要过程
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达 产物等的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因。
一、目的基因的筛选和获取
补充知识：真核生物基因的结构（基因通常是有遗传效应的DNA片段）
（1）非编码区：位于编码区上游与编码区下游，不能转录 为相应的mRNA, 不能编码蛋白质。（2）编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码蛋白质的合成。
启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号。
终止子：终止RNA的合成
第一步：目的基因的筛选与获取
不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子
（1）外显子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。（2）内含子：：能转录相应的mRNA，但不能编码蛋白质的DNA序列。
补充知识：原核生物基因的结构
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
Bt基因的表达产物--Bt抗虫蛋白在起作用。
(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
明确了目的基因后，该怎么获得它?
(2)认识基因结构和功能的技术方法：
在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。
（2）利用PCR获取和扩增目的基因
【重温】DNA体内复制的过程及条件
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
1.PCR的进行需要的条件
无需解旋酶，用高温代替
DNA（目的基因）模板
4种脱氧核苷酸（dNTP)
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
引物（通常为小的单链DNA至少需要2种引物）
反应还需要其它条件，如控温系统、缓冲液（一般添加Mg2+）---能够调节PH，激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶。
A T C G A A T C G G T T
T A C C T T A G C C A A
2.DNA复制过程需要引物的原因：
1.定义：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）。
·细胞内通常以RNA单链为引物
·细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物
①DNA聚合酶不能从头合成子链。②使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
DNA复制时，子链延伸的方向是从5’→3’端。
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg 2+ 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg 2+ 。
四种脱氧核苷酸(dNTP)
分别与两条模板链结合的2种引物
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶作用下合成新DNA链。
注意：复性温度过高会破坏引物与模板碱基互补配对。过低，会造成引物与模板结合位点增加，导致非特异性产物增加。
复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，当长度相同，但G-C含量高，需更高温度。
思考:PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
1、PCR扩增时至少需要______种引物.
2、PCR扩增的前提是：
根据一段已知目的基因两端的核苷酸序列合成引物
3、设计引物时必须依据：
目的基因两端的核苷酸序列
4、设计引物的要求：（或引物失效的原因）
①同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：______________________________②2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：______________________________。
防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合
思考：1.用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
思考：2.如何对产物进行鉴定？
（3）从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因文库的种类
含有一种生物所有基因的文库
只含有一种生物部分基因的文库
目的：确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代； 使目的基因能够表达和发挥作用。
获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？
思考：各个元件有什么作用？
二.基因表达载体的构建(核心步骤)
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
复制原点：DNA复制的起始位点
终止子：位置：基因的下游功能：终止转录
标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。
目的基因插入到启动子和终止子之间
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
PCR （设计引物时，在5’端加上酶切位点）
① 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。
② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③ 将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。
（1）构建基因表达载体时，能否用 Sma Ⅰ 限制酶切割质粒？为什么？
不能；因为 SmaⅠ 切割会破坏质粒的抗生素抗性基因（抗生素抗性基因是质粒上的标记基因，若被破坏，无法进一步筛选重组 DNA 分子）。
（2）若只用 EcR Ⅰ 限制酶切质粒和外源 DNA，则构建基因表达载体时会出现哪些结果？
目的基因多拷贝与质粒连接
（3）为避免出现上述情况可以选择什么限制酶对质粒和外源 DNA 进行切割？
使用 BamHⅠ和 Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA。
优点：①避免质粒自身环化；②有利于载体与目的基因正向连接，避免反向连接。
将目的基因导入受体细胞的方法，因为受体细胞的不同而有所区别。
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
1.目的基因导入植物细胞
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 实质是基因重组。
2.目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：（2）受体细胞:
①体积大，易操作。②易表现出全能性。
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
原核细胞（常选择大肠杆菌）
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
3.目的基因导入微生物细胞
原核生物作为受体细胞产生真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要进一步加工。
思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？
抗原 — 抗体杂交技术
（1）检测目的基因是否导入
—— 通过 PCR 等技术检测
如：检测棉花的染色体 DNA 上是否插入了 Bt 基因
利用 Bt 基因的核苷酸序列设计引物
（2）检测目的基因是否转录
如：检测 Bt 基因是否转录出 mRNA
提取棉花细胞 mRNA
10个 PCR 阳性棉花植株中，有四株 Bt 基因发生转录
1.原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
利用基因探针来检测目的基因是否导入或者转录
2.原理：碱基互补配对原则
（3）检测目的基因是否翻译
—— 通过抗原-抗体杂交检测
如：检测 Bt 基因是否翻译成 Bt 抗虫蛋白
（1）DNA 片段的扩增
PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过调节温度来控制 DNA 双链的解聚与结合。一次 PCR 一般要经历 30 次循环。
（2）DNA 片段的电泳鉴定
DNA 在一定的 pH 下会带上电荷，带电的 DNA 会在电场的作用下向所带电荷相反的电极移动，即电泳。PCR 产物一般用琼脂糖凝胶电泳鉴定，其在凝胶中的迁移速率与凝胶浓度、DNA 分子大小和构象（如链状和环状）等有关。凝胶中的 DNA 通过染色，可在 300 nm 紫外灯下被检测出来。
五.DNA 片段的扩增及电泳
PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
3.实验步骤（PCR）
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
Ⅰ.预变性的目的？Ⅱ.最后一个循环结束后通常还需在 72℃维持几分钟，目的是？
使模板 DNA 充分变性
4、实验步骤（电泳鉴定）
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
5. 结果分析与评价：
（1）你是否成功扩增出 DNA 片段的断依据是什么？
在紫外灯下直接观察 DNA 条带的分布及粗细程度（条带的分布代表扩增产物的类型；条带的粗细代表扩增产物量的多少）。
（2）通过电泳条带能否确定扩增产物一定是所需的 DNA 片段？为什么
不能；因为电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度，不能显示精准的 DNA 碱基数量，也不能呈现碱基序列。
（1）未出现扩增条带的主要原因① Taq DNA 聚合酶失活。② 引物出现质量问题。③ Mg2＋浓度过低。④ 变性时的温度低，变性时间短。（2）出现非特异性扩增条带的主要原因① 模板 DNA 出现污染。② 引物特异性不强或形成引物二聚体。③ Mg2＋浓度过高。 ④ 复性时的温度过低等。
1.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，下列关于基因表达载体的叙述，正确的是(　　)A．基因表达载体上需要有启动子，启动子就是转录的起始位点B．终止子位于RNA上，是转录结束的信号C．切割目的基因和载体的酶必须是同一种限制酶D．一般还需要对重组成功的DNA分子进行筛选
2.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题：
(1)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为______________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在___________酶作用下，形成重组质粒P3。
(2)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2为甲、乙、丙 3条引物在正常重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp 片段，原因是____________________。
3.NK603是能耐草甘膦(一种除草剂)的转基因玉米，这种玉米因导入了抗草甘膦基因，对草甘膦具有抗药性。请回答下列问题：(1)基因工程的操作程序主要包括四个步骤，其核心步骤是_______________ _________；PCR可以特异性地快速扩增抗草甘膦基因，扩增抗草甘膦基因时，需要用到从嗜热菌中提取出的_____________________________________，还要合成一小段能与抗草甘膦基因碱基互补配对的片段，即________。
耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)