人教版 (2019)选择性必修3基因工程的基本操作程序课时作业

这是一份人教版 (2019)选择性必修3基因工程的基本操作程序课时作业，共46页。试卷主要包含了目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定等内容，欢迎下载使用。

自主梳理
一、目的基因的筛选与获取
1.目的基因的概念
在基因工程的设计和操作中，用于 或获得 等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要指 的基因。
2.筛选合适的目的基因
从相关的已知 和 清晰的基因中筛选。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR的含义： 的缩写，是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的 进行大量复制的技术。
（2）条件： 、DNA模板、 、4种脱氧核苷酸等。
（3）PCR扩增的过程
①变性：当温度超过 ℃时，目的基因DNA受热变性后解聚为 。
②复性：当温度下降到 ℃左右时， 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到 ℃左右时，以 为模板，在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸,即将4种脱氧核苷酸加到 的3’端。
二、基因表达载体的构建
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中 ，并且可以 给下一代。
(2)使目的基因能够 和发挥作用。
2.基因表达载体的构成
基因表达载体是载体的一种，除 外，还必须有启动子、终止子等。
（1）启动子：一段有特殊序列结构的 片段，位于基因的 ，紧挨 ，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
（2）终止子：一段有特殊序列结构的 片段，位于基因的 ，使转录在所需要的地方停下来。
3．基因表达载体的构建
首先用一定的 切割载体，使它出现一个切口，然后用 限制酶或 的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用 将目的基因片段拼接到载体的切口处。
三、将目的基因导入受体细胞
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持 的过程。
2.转化方法
（1）导入植物细胞
常用方法：花粉管通道法、 （适用于双子叶植物或裸子植物）。
（2）导入动物细胞
①常用方法： 。
②常用受体细胞： 。
（3）导入微生物细胞
①方法：用 处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
②受体细胞： （使用最广泛的是大肠杆菌）。
③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
四、目的基因的检测与鉴定
预习检测（限时10分钟）
1．利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则（ ）
A．需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B．共需2n-2个引物参与子代DNA分子的合成
C．应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等
D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8
2．New Phytlgist杂志发表了我国科学家有关大豆对盐胁迫响应的分子调控机制，过程如图所示。研究发现，miR160a可通过切割GmARF16基因转录的mRNA使大豆具有耐盐性。下列叙述错误的是（ ）

A．大豆的不耐盐与耐盐这对性状受多对基因共同决定
B．若GmMYC2基因启动子甲基化程度增加可提高耐盐性
C．脯氨酸含量增加可增大根部细胞渗透压引起耐盐性增强
D．miR160a通过碱基互补配对原则识别mRNA并断裂氢键
3．干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，目前主要用于治疗慢性乙型、丙型肝炎等。我国科学家用基因工程的方法从大肠杆菌中获得了人干扰素，如图为科学家构建的人干扰素基因表达载体。下列叙述正确的是（ ）
A．基因表达载体上的启动子是 DNA 聚合酶识别和结合的部位
B．图中未标出终止子，其作用是使翻译过程在需要的地方停下来
C．用同种限制酶切割干扰素基因和载体的目的是产生相同的末端
D．构建基因表达载体时，T4DNA 连接酶可恢复被限制酶切开的氢键
4．科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计中，合理的是（ ）
A．基因表达载体中的启动子是DNA聚合酶识别和结合的位点
B．利用小鼠的成熟红细胞提取mRNA可获得β-珠蛋白基因的编码序列
C．常用Ca2＋处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞
D．用含有四环素的培养基筛选出的大肠杆菌一定含有β-珠蛋白基因
5．在基因工程的基本操作程序中，不进行碱基互补配对的是（ ）
A．人工合成目的基因
B．目的基因与运载体结合
C．将目的基因导入受体细胞
D．目的基因的检测和表达
6．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是（ ）
A．大肠杆菌—Ca2+
B．棉花细胞—花粉管通道法
C．羊高度分化的体细胞—显微注射法
D．番茄细胞—农杆菌转化法
7．如图表示利用现代生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器的流程图，目的是从转基因山羊的乳汁中获得人乳铁蛋白。已知细胞甲是来自雌山羊的胚胎成纤维细胞，下列相关叙述错误的是（ ）

A．完成图中①过程用到了质粒、限制酶和DNA连接酶等
B．筛选出的细胞乙是含有目的基因的胚胎成纤维细胞
C．该重构胚发育至囊胚时需要进行DNA分析以鉴定性别
D．图示流程中，②④⑤过程都用到了显微操作技术
8．科学家通过基因工程技术将编码天然蜘蛛丝蛋白的基因导入家蚕，使其表达出一种特殊的复合纤维蛋白，该复合纤维蛋白的韧性优于天然蚕丝蛋白。下列有关该复合纤维蛋白的叙述，正确的是（ ）
A．该蛋白的基本组成单位和空间结构与天然蜘蛛丝蛋白的不同
B．该蛋白合成过程是在家蚕核糖体中通过肽键和二硫键连接而成
C．该蛋白彻底水解的产物可与双缩脲试剂发生作用，产生紫色反应
D．可用复合纤维蛋白的抗体来检测该蛋白是否成功表达
9．科研人员通过PCR技术获得白蛋白基因启动子，将该启动子与Cre重组酶基因结合构建基因表达载体，培育出在肝细胞中特异性表达 Cre重组酶的转基因小鼠。下列叙述错误的是（ ）
A．常用受精卵作为目的基因的受体细胞，以培育转基因小鼠
B．基因表达载体中的标记基因用来筛选含目的基因的受体细胞
C．可通过PCR技术检测转基因小鼠是否转录出了目的mRNA
D．将发育到囊胚期或原肠胚期的胚胎移植给受体小鼠
10．下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是（ ）
A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出 mRNA
B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
►环节 基因工程的过程
【情景材料】
巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具有该基因的雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而达到减少该种蚊子的数量，抑制疾病传播的目的。
【问题探究】
1．该项研究的目的基因是什么？其作用是什么？
2.基因工程操作过程中，哪些步骤中具有碱基互补配对现象？
3.基因工程过程中的关键是什么？
4.PCR技术的原理是什么？
典例精讲
【例1】Ti质粒是根癌农杆菌拟核外的遗传物质，常作为植物基因工程的载体。下列关于Ti质粒的叙述，正确的是（ ）
A．每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连
B．Ti质粒复制时具有多起点和双向复制特点
C．用Ca2＋处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入
D．Ti质粒可随机整合到农杆菌的拟核DNA上
【例2】2011 年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：构建乳腺专一表达载体——表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）----核移植----重组细胞的体外培养及胚胎移植----检测。下列叙述错误的是（ ）
A．表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF） 为核供体细胞
B．需将重组细胞体外培养至早期囊胚再进行胚胎移植
C．高产赖氨酸转基因克隆奶牛的性状与受体母牛极为相似
D．可用DNA分子杂交技术检测克隆奶牛体内目的基因是否导入
【例3】HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列说法错误的是（ ）

A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的脱氧核苷酸等组分
B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入HindⅢ和EcRI的识别序列
C．利用PCR技术扩增目的基因时，退火温度偏低、引物特异性差均可导致产物中出现部分非目标序列
D．基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法
【例4】植物细胞壁中存在大量不能被动物消化的多聚糖类物质，研究人员通过生物工程技术培育出含多聚糖水解酶基因猪，主要流程如下图，①～⑤表示操作过程。下列有关说法错误的是（ ）

A．在基因表达载体中构建诱导型启动子，可以利用诱导物激活多聚糖水解酶基因表达
B．从卵巢中采集的卵母细胞需培养到MⅡ期后用显微操作技术去除核膜包裹的细胞核
C．用蛋白酶合成抑制剂激活③过程形成的重构胚使其完成分裂和发育进程
D．④过程的实质是早期胚胎在相同生理环境下空间位置的转移
【例5】单个B细胞抗体技术可用于制备高亲和力、高特异性的单抗，其技术流程如下：①康复者单个B淋巴细胞的分离和筛选；②利用RT-PCR获取和扩增抗体基因；③构建基因表达载体；④将抗体基因导入动物细胞；⑤单抗的筛选和鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．操作①选用单个B淋巴细胞以保证最终获得纯度较高的单抗
B．操作②使用的PCR反应体系常添加Mg2+以激活DNA聚合酶
C．操作③常用两种限制酶切割抗体基因和载体以防止其自身环化
D．操作④前可用Ca2+处理受体细胞促使其主动吸收DNA分子
【例6】下图中的①②③表示培育番茄新品种的三种育种方法。下列有关说法错误的是（ ）
A．方法①和③的育种原理都是基因重组
B．方法②诱导单倍体的过程中细胞全能性的表达与植物激素密切相关
C．方法③中的抗病基因导入受体细胞常用细菌中的质粒做运载体
D．把目的基因与质粒相结合，只能用相同的限制酶分别处理目的基因和质粒
【例7】图甲表示真核细胞DNA复制的部分过程，其中一条链具有“不连续合成”的特点。图乙表示真核生物基因的遗传信息从DNA转移到RNA上之后，对有效遗传信息进行“剪断”与重新“拼接”的过程。下列说法错误的是（ ）
A．图甲中两条子链的合成方向都是由5'延伸到3'
B．图乙过程①需要DNA聚合酶的参与
C．图乙过程②有磷酸二酯键的断裂和合成
D．正常mRNA逆转录形成的cDNA与S基因不完全相同
【例8】科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组
B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶
C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞
D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜
【例9】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。下列关于基因表达载体及其构建的叙述，错误的是（ ）
A．用两种限制酶分别切割目的基因和质粒构建表达载体，比用一种限制酶效果更好
B．用两种限制酶切割目的基因和质粒之后，也要用两种酶即DNA连接酶、DNA聚合酶进行连接
C．构建基因表达载体时，插入目的基因不能破坏标记基因、启动子、终止子等结构的完整性
D．基因表达载体包括启动子、终止子、复制原点、标记基因、目的基因等组成部分
【例10】猴痘是一种由猴痘病毒感染所致的病毒性人畜共患病，人类感染猴痘病毒出现的症状与过去在天花患者身上所看到的症状相似。某科研团队欲研究猴痘病毒表面的抗原蛋白S以生产治疗猴痘的抗体，下列叙述错误的是（ ）
A．细胞A是从小鼠的脾中分离得到的B淋巴细胞
B．过程②需要逆转录酶，过程③需要限制酶和DNA连接酶
C．图中的X基因为S蛋白基因，结构甲上除X基因外还应含有标记基因
D．利用图示方法获得的抗体不具有生物学活性,不可以直接用于治疗猴痘病毒感染
要点归纳
1.目的基因获取方法的选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。
(3)如果只知道待扩增目的基因的两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可通过PCR技术扩增目的基因。
2．基因表达载体的构成
3．基因表达载体构建时有关限制酶的选择
选择限制酶时要考虑目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。
②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的酶切位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶与切割目的基因的限制酶一般相同，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶应不能切割质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，用于重组DNA的鉴定和选择。如图乙中质粒不能使用限制酶Sma Ⅰ切割，因为会破坏标记基因。
4．基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子。在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
5．启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
6．常用的转化方法
7.受体细胞的选择
(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。
(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。
(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。
8．目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
(1)图中a细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。
(2)图中b在进行细胞减数分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
[易错警示]
PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。
2．在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
3．微生物细胞作为受体细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。将基因表达载体(重组质粒)导入微生物细胞的常用方法是Ca2＋处理法(感受态细胞法)。
4．农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T­DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
1．下图分别表示某种质粒和含目的基因的DNA片段，利用相关工具酶将二者构建成基因表达载体并导入受体菌。几种可供使用的限制酶识别序列及其切割位点为EcRⅠ：-G↓AATTC-；BamHⅠ：-G↓GATCC-；BclⅠ：-T↓GATCA-；Sau3AⅠ：-↓GATC-；SmaⅠ：-CCC↓GGG-。

注：TetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
下列关于构建基因表达载体时限制酶的选择及其相关叙述，错误的是（ ）
A．若单独使用SmaI，则目的基因表达的产物可能不相同
B．若单独使用SmaⅠ，则含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长
C．若选择BamHⅠ和SmaI，能在四环素培养基中生长的受体菌一定含有目的基因
D．若用EcRI和BclⅠ切割质粒，则需用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA
2．SOD是一种广泛分布于各种细胞中的抗氧化酶，它能催化超氧阴离子自由基形成H2O2，增强植物的抗逆性。如图流程为培育能够产生SOD农作物新品种的一种方式，下列有关叙述正确的是（ ）
A．①过程中可用选择培养基筛选出含SOD基因的新细胞
B．②过程通常需要提供光照条件
C．与②过程对比，③过程培养基中激素的比例应保持不变
D．利用该过程产生的新植株属于有性繁殖
3．快速准确的检测对疫情防控起着至关重要的作用。病毒的检测方法有：①用“新冠病毒核酸检测试剂盒”，检测病毒的遗传物质RNA；②特异性抗原蛋白检测，即检测病毒表面的一种糖蛋白；③特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体。下列有关说法不正确的是（ ）
A．方法②③都需要用到抗原—抗体杂交的方法
B．方法①②③都需要从患者体内采集病毒样本
C．某人有可能①②为阳性③为阴性，也可能③为阳性①②为阴性
D．由于RNA比DNA稳定性差，核酸检测时往往需将病毒样本的RNA反转录成cDNA，扩增之后进行分段测序
4．研究发现，某农作物的品系N具有抗虫、高产等优良性状，但是甜度不高，而基因Z与农作物的甜度有关。科研人员以Ti质粒为载体，以品系N的叶片外植体为受体，培育转Z基因的新品系n。下列叙述错误的是（ ）
A．若只用一种限制酶切割目的基因和Ti质粒可能导致目的基因反向插入载体
B．培育转Z基因的新品系n的过程中利用了植物细胞的全能性
C．成功转入重组Ti质粒的叶片细胞培育成的植株即为新品系n
D．重组DNA技术可定向改变生物的性状
5．基因芯片技术是将待测DNA分子用放射性同位素或荧光物质标记，如果能与芯片上的单链DNA探针配对，它们就会结合起来，并出现“反应信号”。下列说法中错误的是（ ）
A．基因芯片的工作原理是碱基互补配对，碱基间会形成氢键
B．待测的DNA分子首先要解旋变为单链，才可用基因芯片检测
C．“反应信号”是由待测DNA分子与基因芯片上的放射性探针结合产生的
D．基因芯片技术可以用于亲缘关系鉴定、遗传病检测等
6．如图为转基因抗虫烟草的培育流程，下列叙述正确的是（ ）
A．培育过程①需要使用纤维素酶和果胶酶
B．培育过程②将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要使用CaCO3处理农杆菌
C．培育过程③④仅通过调节植物激素可诱导愈伤组织再生出新植株
D．可通过观察害虫吞食转基因烟草后的存活情况进行个体水平检测
7．利用农杆菌转化法将苏云金杆菌的Bt基因导入棉花细胞获得抗虫棉，可有效减少农药使用，提高棉花产量。下列相关叙述错误的是（ ）
A．农杆菌转化法和肺炎链球菌转化实验的原理相同
B．苏云金杆菌和棉花的基因都是有遗传效应的DNA片段
C．农杆菌转化法一般需要农杆菌的Ti质粒作为表达载体
D．由该种方法获得的转基因抗虫棉无法将抗虫基因遗传给子代
8．在细菌和病毒类疾病检测、遗传疾病诊断、肿瘤筛查和诊断中，都可采用PCR 技术。PCR反应由变性→复性→延伸三个基本反应步骤构成，PCR 完成以后常需要鉴定PCR的产物。下列叙述正确的是（ ）
A．变性：耐高温的 DNA 聚合酶将双链DNA 解链为单链
B．复性：两种引物与两条单链DNA结合不必控制温度
C．延伸：4 种脱氧核苷酸加到引物的5端
D．鉴定：DNA 聚合酶质量不好可能导致鉴定结果不仅有一条带
9．为实现高效降解厨余垃圾中纤维素的目的，科研人员将纤维素内切葡聚糖前基因 导入蕊酵母中，获得能高效表达EGⅢ基因的工程菌，图示中BamHT、EcRI、SalI为限制酶。下整列相关叙述错误的是（ ）
A．构建重组质粒需用到，BamHI、SalI和DNA连接酶.
B．筛选目的菌时，所用的培养基中应含有氨苄青霉素
C．培育该工程菌与培育三倍体充子西瓜所运用的原理相同
D．质粒中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位
10．在相对湿度为92%时，沃森和克里克对所得到的含 300个碱基对的双螺旋 DNA钠盐纤维进行分析发现，腺嘌呤占 20%，碱基对与中心轴垂直，相邻碱基对之间垂直距离为0．34 nm，螺旋一圈的垂直长度约为 3．4 nm。下列叙述正确的是（ ）
A．该 DNA碱基对之间共含有氢键390个
B．该 DNA 复制5 次需要消耗鸟嘌呤5680个
C．每圈螺旋约包含 10个碱基对
D．扩增DNA 时，通常破坏DNA的磷酸二酯键使其变性
11．科学家将抵御干旱胁迫反应中具有调控作用的 AhCMO 基因转入棉花细胞中，培育出了转基因抗旱棉花。下列相关叙述错误的是（ ）
A．将AhCMO基因导入棉花细胞可用农杆菌转化法
B．构建基因表达载体是培育转基因抗旱棉花的核心工作
C．AhCMO基因成功插入棉花细胞染色体上也未必能正常表达
D．PCR 扩增AhCMO 基因时需要设计两种碱基互补的引物
12．应用生物工程技术可获得人们需要的生物新品种或新产品，下图是制备单克隆抗体的过程，下列叙述错误的是（ ）

A．I细胞为已具有特定免疫的浆细胞，成功转入prG使其具备分裂的能力
B．图中I至Ⅱ过程是检测筛选出既能无限增殖，又能产生特异性抗体的细胞
C．该过程涉及转基因技术，动物细胞融合技术；以及动物细胞培养等技术
D．获取目的基因方法有多种，常用PCR特异性的快速扩增目的基因
13．（多选）蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中14表示A上引物可能结合的位置，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述正确的是（ ）
A．若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，会破坏4个磷酸二酯键
B．若用PCR技术获取目的基因，则图中的2、3分别是2种引物结合的位置
C．若受体细胞为大肠杆菌，则需先用Ca2+处理，更利于实现转化
D．在PCR扩增仪中根据选定的引物至少需经过6次循环才可获得32个两条链等长的目的基因片段
14．（多选）科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（LPG），可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（ ）

A．转入的LPG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性
B．LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段
C．标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
D．可以利用PCR技术筛选含有LPG基因的受体细胞
15．I请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因时，需经过变性、复性、延伸等阶段。设计PCR过程所需引物的主要依据是 。复性时，引物与模板链发生 ，其温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但 的引物需要设定更高的复性温度。若PCR反应得不到任何扩增产物，原因可能有 （填序号）。
①变性温度过低②复性温度过低③缓冲液中Mg2+浓度过低
(2)据图1分析，BamHⅠ切割形成的黏性末端是 。
II下图甲为获取的含有目的基因的DNA片段，Sau3AⅠ、EcRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图。回答下列问题：
(3)为了使目的基因与质粒定向连接，切割图甲所示DNA片段的最佳方案是选用 酶。
(4)PCR技术的原理是 ，基因工程的基本原理是 ，在PCR反应体系中，除了加入目的基因和引物外，还需要添加的物质有 （至少答出两种）。
(5)与只使用一种限制酶处理质粒和目的基因相比较，使用两种限制酶同时处理质粒和目的基因的优点在于可以防止 。
(6)基因工程中载体DNA必须满足的条件是 （至少写出两项）。
16．猕猴桃溃疡病是一种严重影响猕猴桃产量的细菌性病害。为获得抗猕猴桃溃疡病的转基因猕猴桃，科研人员以猕猴桃的愈伤组织（对卡那霉素敏感）为转基因受体，通过农杆菌转化法将抗菌肽基因导入猕猴桃。图1表示抗菌肽基因和卡那霉素抗性基因（nptⅡ基因）及其上限制酶酶切位点的分布情况，图2表示Ti质粒及其上限制酶酶切位点的分布情况。回答下列问题：

(1)限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断裂。限制酶主要来源于原核生物，但不会切割原核生物自身的DNA分子，推测原因是 。目的基因可随T-DNA整合到目的细胞的染色体DNA上，这体现了 的生物学变异原理。
(2)若只用EcRI切割目的基因和Ti质粒，会产生多种连接产物。为筛选出含有目的基因正向连接的重组Ti质粒的菌株，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到了①②③三类菌落，其生长情况如下表，“+”表示生长，“-”表示不生长。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填表中序号），菌落②的导入情况是 。
(3)若既要避免上述多种连接情况的发生，又要使目的基因最终能整合到猕猴桃愈伤组织细胞的染色体DNA上，最好选择限制酶 对目的基因和Ti质粒进行切割。
17．过度饮酒可能会导致人体的健康问题，据此科研人员展开了相应的研究。
(1)肝脏是酒精的主要代谢场所，酒精的代谢途径如图所示：
在缺少糖原的条件下， 菌也可发生上图的代谢过程。服用头孢类药物后饮酒会造成乙醛中毒，推测这是因为头孢类分子可抑制 活性。
(2)最近研究人员构建了一种含hADH1B基因(乙醇脱氢酶基因)的工程益生菌，服用益生菌可加速肠道内的酒精分解。该基因工程益生菌构建过程如图甲：
①分析表、图甲，应选用 酶切割质粒和hADH1B基因片段。
②依据图乙中的原理，用碱性磷酸单酯酶处理酶切后的质粒(使﹣P变成﹣OH)，这样可防止质粒的 。
③若将上述处理后的质粒与酶切后的hADH1B基因片段连接，由于﹣OH与﹣OH不能连接而形成2个切口的重组DNA。设计合理的引物进行PCR，至少扩增 轮后，再通过DNA连接酶处理可获得无切口的环状重组DNA(基因表达载体)。
④但上述实验不能避免目的基因的反向连接，请补充下面的实验方案，确定出目的基因的连接方向。
实验方案：先将基因表达载体进行EcR Ⅰ的单酶切，然后通过 电泳分离鉴定。
预期结果：若出现 bp的条带和 bp的条带，则目的基因反向连接；若出现 bp的条带和 bp的条带，则目的基因连接正确。
3.2 基因工程的基本操作程序
Part1目标任务：对接课标，了解目标
Part2预习导学：自主梳理+预习检测，掌握基本知识点
Part3探究提升：代入情景+典例精讲，深入学习知识要点
基因工程的过程
Part4网络梳理：建立知识间的联系
Part5强化训练：必刷经典试题，能力提升
内容
导航
自主梳理
一、目的基因的筛选与获取
1.目的基因的概念
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要指编码蛋白质的基因。
2.筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR的含义：聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
（2）条件：引物、DNA模板、耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸等。
（3）PCR扩增的过程
①变性：当温度超过90 ℃时，目的基因DNA受热变性后解聚为单链。
②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，以单链DNA为模板，在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸,即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端。
二、基因表达载体的构建
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体的构成
基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。
（1）启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
（2）终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游，使转录在所需要的地方停下来。
3．基因表达载体的构建
首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
三、将目的基因导入受体细胞
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.转化方法
（1）导入植物细胞
常用方法：花粉管通道法、农杆菌转化法（适用于双子叶植物或裸子植物）。
（2）导入动物细胞
①常用方法：显微注射技术。
②常用受体细胞：受精卵。
（3）导入微生物细胞
①方法：用Ca+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
②受体细胞：原核生物（使用最广泛的是大肠杆菌）。
③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
四、目的基因的检测与鉴定
预习检测（限时10分钟）
1．利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则（ ）
A．需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B．共需2n-2个引物参与子代DNA分子的合成
C．应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等
D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8
【答案】D
【详解】A、只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错误；
B、扩增循环n次，需一种引物的数量为2n-1，常规PCR共需两种引物的数量为2×（2n-1）=2n＋1-2，B错误；
C、不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；
D、理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占（24-2）/16=7/8，D正确。
故选D。
2．New Phytlgist杂志发表了我国科学家有关大豆对盐胁迫响应的分子调控机制，过程如图所示。研究发现，miR160a可通过切割GmARF16基因转录的mRNA使大豆具有耐盐性。下列叙述错误的是（ ）

A．大豆的不耐盐与耐盐这对性状受多对基因共同决定
B．若GmMYC2基因启动子甲基化程度增加可提高耐盐性
C．脯氨酸含量增加可增大根部细胞渗透压引起耐盐性增强
D．miR160a通过碱基互补配对原则识别mRNA并断裂氢键
【答案】D
【详解】A、大豆的不耐盐与耐盐受GmARF16基因、GmMYC2基因等多对基因共同决定，A正确；
B、若GmMYC2基因启动子甲基化程度增加，会抑制bHLH转录因子的产生，故脯氨酸合成增加，大豆耐盐性增加，B正确；
C、脯氨酸含量增加可增大根部细胞渗透压，如果外部环境含盐量一定程度的增加，细胞依然可以吸收水分，故大豆耐盐性增强，C正确；
D、miR160a可通过切割GmARF16基因转录的mRNA，故miR160a通过碱基互补配对原则识别mRNA并断裂磷酸二酯键，D错误。
故选D。
3．干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，目前主要用于治疗慢性乙型、丙型肝炎等。我国科学家用基因工程的方法从大肠杆菌中获得了人干扰素，如图为科学家构建的人干扰素基因表达载体。下列叙述正确的是（ ）
A．基因表达载体上的启动子是 DNA 聚合酶识别和结合的部位
B．图中未标出终止子，其作用是使翻译过程在需要的地方停下来
C．用同种限制酶切割干扰素基因和载体的目的是产生相同的末端
D．构建基因表达载体时，T4DNA 连接酶可恢复被限制酶切开的氢键
【答案】C
【详解】A、基因表达载体上的启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因的转录，A错误；
B、图中未标出终止子，其作用是使转录过程在需要的地方停下来，B错误；
C、用同种限制酶切割干扰素基因和载体的目的是产生相同的末端，便于基因表达载体的构建，C正确；
D、构建基因表达载体时，T4DNA 连接酶可恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，D错误。
故选C。
4．科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计中，合理的是（ ）
A．基因表达载体中的启动子是DNA聚合酶识别和结合的位点
B．利用小鼠的成熟红细胞提取mRNA可获得β-珠蛋白基因的编码序列
C．常用Ca2＋处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞
D．用含有四环素的培养基筛选出的大肠杆菌一定含有β-珠蛋白基因
【答案】C
【详解】A、基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可用于驱动基因的转录，A错误；
B、哺乳动物的成熟红细胞中没有细胞核和核糖体等结构，所以不能利用小鼠的成熟红细胞提取mRNA，B错误；
C、将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法，常用常用Ca2＋处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞，C正确；
D、标记基因的作用是筛选含有目的基因的受体细胞，用含有四环素的培养基筛选出已经导入β-珠蛋白编码序列的大肠杆菌，不一定能产生 β-珠蛋白，D错误。
故选C。
5．在基因工程的基本操作程序中，不进行碱基互补配对的是（ ）
A．人工合成目的基因
B．目的基因与运载体结合
C．将目的基因导入受体细胞
D．目的基因的检测和表达
【答案】C
【详解】A、人工合成基因形成双链时，需要进行碱基互补配对，A错误；
B、目的基因与运载体结合时，黏性末端之间的连接进行碱基互补配对，B错误；
C、将目的基因导入受体细胞时不进行碱基互补配对，C正确；
D、检测目的基因时需要用到基因探针，进行碱基互补配对；目的基因的表达包括转录和翻译，进行碱基互补配对，D错误。
故选C。
6．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是（ ）
A．大肠杆菌—Ca2+
B．棉花细胞—花粉管通道法
C．羊高度分化的体细胞—显微注射法
D．番茄细胞—农杆菌转化法
【答案】C
【详解】A、用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于感受态，容易吸收外来DNA分子，A正确；
B、当以棉花受精卵为受体细胞时，常用花粉管通道法，B正确；
C、将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，常用动物受精卵为受体细胞，C错误；
D、番茄为双子叶植物植物细胞，可以用农杆菌转化法，D正确。
故选C。
7．如图表示利用现代生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器的流程图，目的是从转基因山羊的乳汁中获得人乳铁蛋白。已知细胞甲是来自雌山羊的胚胎成纤维细胞，下列相关叙述错误的是（ ）

A．完成图中①过程用到了质粒、限制酶和DNA连接酶等
B．筛选出的细胞乙是含有目的基因的胚胎成纤维细胞
C．该重构胚发育至囊胚时需要进行DNA分析以鉴定性别
D．图示流程中，②④⑤过程都用到了显微操作技术
【答案】C
【详解】A、完成图中①过程需要构建基因表达载体，用到了质粒、限制酶和DNA连接酶等，A正确；
B、将目的基因导入雌山羊的胚胎成纤维细胞，再筛选出含有目的基因的胚胎成纤维细胞，B正确；
C、图中的供体细胞细胞核来自雌性山羊，则胚胎移植后生出的小羊性别为雌性，因此并不需要进行性别鉴别，C错误；
D、图示流程中，②将重组质粒导入动物细胞用显微操作技术，④需要在显微镜下去核，⑤需要在显微镜下进行注入操作技术，D正确。
故选C。
8．科学家通过基因工程技术将编码天然蜘蛛丝蛋白的基因导入家蚕，使其表达出一种特殊的复合纤维蛋白，该复合纤维蛋白的韧性优于天然蚕丝蛋白。下列有关该复合纤维蛋白的叙述，正确的是（ ）
A．该蛋白的基本组成单位和空间结构与天然蜘蛛丝蛋白的不同
B．该蛋白合成过程是在家蚕核糖体中通过肽键和二硫键连接而成
C．该蛋白彻底水解的产物可与双缩脲试剂发生作用，产生紫色反应
D．可用复合纤维蛋白的抗体来检测该蛋白是否成功表达
【答案】D
【详解】A、蛋白的基本组成单位是氨基酸，复合纤维蛋白与天然蜘蛛丝蛋白的基本单位相同，A错误；
B、氨基酸是组成蛋白质的基本单位，合成蛋白质的场所是核糖体，复合纤维蛋白的肽链由氨基酸经过脱水缩合反应通过肽键连接而成，场所在家蚕核糖体上，B错误；
C、复合纤维蛋白彻底水解的产物为氨基酸，不能与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应，C错误；
D、基因的表达包括转录和翻译，转录的产物是RNA，翻译的产物是蛋白质，检测蛋白质是否成功表达，可用抗体-抗原杂交，复合纤维蛋白属于抗原，故可用复合纤维蛋白的抗体来检测该蛋白是否成功表达，D正确。
故选D。
9．科研人员通过PCR技术获得白蛋白基因启动子，将该启动子与Cre重组酶基因结合构建基因表达载体，培育出在肝细胞中特异性表达 Cre重组酶的转基因小鼠。下列叙述错误的是（ ）
A．常用受精卵作为目的基因的受体细胞，以培育转基因小鼠
B．基因表达载体中的标记基因用来筛选含目的基因的受体细胞
C．可通过PCR技术检测转基因小鼠是否转录出了目的mRNA
D．将发育到囊胚期或原肠胚期的胚胎移植给受体小鼠
【答案】D
【详解】A、常用受精卵作为目的基因的受体细胞，以培育转基因小鼠，A正确；
B、基因表达载体中的标记基因便于重组DNA分子的筛选，故可用来筛选含目的基因的受体细胞，B正确；
C、可通过PCR技术检测转基因小鼠是否转录出了目的mRNA，C正确；
D、胚胎移植需要胚胎发育至桑葚胚或囊胚阶段，D错误。
故选D。
10．下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是（ ）
A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出 mRNA
B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
【答案】C
【详解】A、检测到受体细胞含有目的基因的表达产物才能标志基因工程操作的成功，A错误；
B、目的基因是否转录和翻译的检测方法依次是分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术，B错误；
C、可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质，C正确；
D、抗虫、抗病鉴定可用于确定转基因生物是否具备相关性状，属于个体水平的检测，D错误。
故选C。
►环节 基因工程的过程
【情景材料】
巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具有该基因的雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而达到减少该种蚊子的数量，抑制疾病传播的目的。
【问题探究】
1．该项研究的目的基因是什么？其作用是什么？
2.基因工程操作过程中，哪些步骤中具有碱基互补配对现象？
3.基因工程过程中的关键是什么？
4.PCR技术的原理是什么？
【答案】
植入雄性致倦库蚊体内的一种特殊基因是该项研究的目的基因。该基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少该种蚊子的数量，抑制疾病传播。
2.基因工程操作过程中第一、二、四步中均有碱基互补配对现象，而只有第三步没有。
3.基因工程第二步基因表达载体的构建。
4.DNA半保留复制。
典例精讲
【例1】Ti质粒是根癌农杆菌拟核外的遗传物质，常作为植物基因工程的载体。下列关于Ti质粒的叙述，正确的是（ ）
A．每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连
B．Ti质粒复制时具有多起点和双向复制特点
C．用Ca2＋处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入
D．Ti质粒可随机整合到农杆菌的拟核DNA上
【答案】A
【详解】A、Ti质粒是双链环状DNA分子，每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连，A正确；
B、Ti质粒通常具有单起点复制特性，在宿主细胞中，质粒能够自主复制，一般只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子,B错误；
C、用Ca2＋处理农杆菌有利于重组Ti质粒的导入，C错误；
D、Ti质粒可随机整合到受体细胞染色体的DNA上，D错误。
故选A。
【例2】2011 年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：构建乳腺专一表达载体——表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）----核移植----重组细胞的体外培养及胚胎移植----检测。下列叙述错误的是（ ）
A．表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF） 为核供体细胞
B．需将重组细胞体外培养至早期囊胚再进行胚胎移植
C．高产赖氨酸转基因克隆奶牛的性状与受体母牛极为相似
D．可用DNA分子杂交技术检测克隆奶牛体内目的基因是否导入
【答案】C
【详解】A、将含有目的基因的表达载体导入牛胚胎成纤维细胞（BEF） 作为核供体细胞，A正确;
B、胚胎移植的胚胎应是具有全能性的胚胎，因此需要将重组细胞体外培养至早期囊胚再进行胚胎移植，B正确;
C、高产赖氨酸转基因克隆奶牛的核物质来自核供体奶牛，因此性状与核供体牛极为相似，C错误;
D、克隆奶牛体内是否导入目的基因，可用DNA分子杂交技术检测，D正确。
故选C。
【例3】HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列说法错误的是（ ）

A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的脱氧核苷酸等组分
B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入HindⅢ和EcRI的识别序列
C．利用PCR技术扩增目的基因时，退火温度偏低、引物特异性差均可导致产物中出现部分非目标序列
D．基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法
【答案】B
【详解】A、图中①以禽流感病毒RNA形成目的基因DNA过程，为逆转录过程，需要的酶是逆转录酶，逆转录合成的是DNA，需要4种脱氧核苷酸作为原料，A正确；
B、目的基因两端引入HindⅢ和EcRI的识别序列，进而使目的基因能够与鸡卵清蛋白基因启动子、载体正确连接，构建基因表达载体，B错误；
C、PCR技术扩增目的基因时，若退火温度偏低、则可能导致引物与非目的基因序列部分配对，进而扩增出非目的基因，引物特异性差也会导致和非目的基因序列部分配对，导致产物中出现部分非目标序列，C正确；
D、受体细胞为动物细胞时通常采用显微注射法，因此基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法，D正确。
故选B。
【例4】植物细胞壁中存在大量不能被动物消化的多聚糖类物质，研究人员通过生物工程技术培育出含多聚糖水解酶基因猪，主要流程如下图，①～⑤表示操作过程。下列有关说法错误的是（ ）

A．在基因表达载体中构建诱导型启动子，可以利用诱导物激活多聚糖水解酶基因表达
B．从卵巢中采集的卵母细胞需培养到MⅡ期后用显微操作技术去除核膜包裹的细胞核
C．用蛋白酶合成抑制剂激活③过程形成的重构胚使其完成分裂和发育进程
D．④过程的实质是早期胚胎在相同生理环境下空间位置的转移
【答案】B
【详解】A、启动子（RNA聚合酶与之结合启动转录的片段）具有特异性，在基因表达载体中构建诱导型启动子，可以利用诱导物激活多聚糖水解酶基因表达，A正确；
B、常用显微操作法去除由卵母细胞纺锤体—染色体复合物，而非去除核膜包裹的细胞核，B错误；
C、用蛋白酶合成抑制剂（电刺激、Ca2＋载体等）激活③过程形成的重构胚使其完成分裂和发育进程，C正确；
D、④为胚胎移植，④过程的实质是早期胚胎在相同生理环境下空间位置的转移，D正确。
故选B。
【例5】单个B细胞抗体技术可用于制备高亲和力、高特异性的单抗，其技术流程如下：①康复者单个B淋巴细胞的分离和筛选；②利用RT-PCR获取和扩增抗体基因；③构建基因表达载体；④将抗体基因导入动物细胞；⑤单抗的筛选和鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．操作①选用单个B淋巴细胞以保证最终获得纯度较高的单抗
B．操作②使用的PCR反应体系常添加Mg2+以激活DNA聚合酶
C．操作③常用两种限制酶切割抗体基因和载体以防止其自身环化
D．操作④前可用Ca2+处理受体细胞促使其主动吸收DNA分子
【答案】D
【详解】A、不同的效应B细胞分泌的抗体不同，操作①选用单个B淋巴细胞可以保证最终获得纯度较高的单抗，A正确；
B、PCR反应体系中，常加入Mg2+以激活DNA聚合酶，促进PCR延伸中子链的合成，B正确；
C、为了防止目的基因和载体自身环化或反向连接，常用两种不同的限制酶去同时切割目的基因和载体，C正确；
D、用Ca2+处理细胞，该受体细胞是微生物，需要用Ca2+处理微生物细胞，使其处于感受态，D错误。
故选D。
【例6】下图中的①②③表示培育番茄新品种的三种育种方法。下列有关说法错误的是（ ）
A．方法①和③的育种原理都是基因重组
B．方法②诱导单倍体的过程中细胞全能性的表达与植物激素密切相关
C．方法③中的抗病基因导入受体细胞常用细菌中的质粒做运载体
D．把目的基因与质粒相结合，只能用相同的限制酶分别处理目的基因和质粒
【答案】D
【详解】A、方法①和③分别是杂交育种和基因工程育种，其育种原理都是基因重组，A正确；
B、方法②是单倍体育种，诱导单倍体的过程是利用了植物组织培养，细胞全能性的表达与植物激素密切相关，B正确；
C、方法③为基因工程育种，将抗病基因导入受体细胞常用细菌中的质粒做运载体，C正确；
D、不同的限制酶切割质粒和目的基因若能产生相同的黏性末端，也可以将目的基因与质粒连接构建基因表达载体，D错误。
故选D。
【例7】图甲表示真核细胞DNA复制的部分过程，其中一条链具有“不连续合成”的特点。图乙表示真核生物基因的遗传信息从DNA转移到RNA上之后，对有效遗传信息进行“剪断”与重新“拼接”的过程。下列说法错误的是（ ）
A．图甲中两条子链的合成方向都是由5'延伸到3'
B．图乙过程①需要DNA聚合酶的参与
C．图乙过程②有磷酸二酯键的断裂和合成
D．正常mRNA逆转录形成的cDNA与S基因不完全相同
【答案】B
【详解】A、因为DNA聚合酶只能按照5′端往3′端的方向进行延伸合成新DNA链，所以两条子链的合成方向都是由5'延伸到3'，A正确；
B、图乙过程①表示转录需要RNA聚合酶参与，B错误；
C、图乙过程②为RNA的加工，剪接体对有效遗传信息的“剪断”与重新“拼接”，其作用是催化磷酸二酯键的断裂和形成，有磷酸二酯键的断裂和合成，C正确；
D、S基因转录形成的mRNA经过了加工（剪接），因此正常mRNA逆转录形成的cDNA与S基因不完全相同，D正确。
故选B。
【例8】科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组
B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶
C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞
D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜
【答案】C
【详解】A、农杆菌的拟核DNA不会与番木瓜基因发生重组，和番木瓜基因发生重组的是其质粒上的基因，A错误；
B、构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；
C、可利用 PCR 技术扩增目的基因，进而筛选出含有抗病毒蛋白基因C的受体细胞，C正确；
D、因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T-DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病番木瓜不含有卡那霉素抗性基因，故不具有卡那霉素抗性，D错误。
故选C。
【例9】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。下列关于基因表达载体及其构建的叙述，错误的是（ ）
A．用两种限制酶分别切割目的基因和质粒构建表达载体，比用一种限制酶效果更好
B．用两种限制酶切割目的基因和质粒之后，也要用两种酶即DNA连接酶、DNA聚合酶进行连接
C．构建基因表达载体时，插入目的基因不能破坏标记基因、启动子、终止子等结构的完整性
D．基因表达载体包括启动子、终止子、复制原点、标记基因、目的基因等组成部分
【答案】B
【详解】A、用两种限制酶分别切割目的基因和质粒构建基因表达载体，不会出现质粒自身环化、目的基因自身环化、目的基因与质粒反向连接，用一种限制酶分别切割目的基因和质粒构建基因表达载体，会出现质粒自身环化、目的基因自身环化、目的基因与质粒反向连接，A正确；
B、连接切割后的质粒和目的基因的酶是DNA连接酶，B错误；
C、构建基因表达载体时，如果目的基因插入标记基因、启动子、终止子之间，就会使标记基因、启动子、终止子遭到破坏而失去作用，C正确；
D、基因表达载体包括启动子、终止子、复制原点、标记基因、目的基因等组成部分，D正确。
故选B。
【例10】猴痘是一种由猴痘病毒感染所致的病毒性人畜共患病，人类感染猴痘病毒出现的症状与过去在天花患者身上所看到的症状相似。某科研团队欲研究猴痘病毒表面的抗原蛋白S以生产治疗猴痘的抗体，下列叙述错误的是（ ）
A．细胞A是从小鼠的脾中分离得到的B淋巴细胞
B．过程②需要逆转录酶，过程③需要限制酶和DNA连接酶
C．图中的X基因为S蛋白基因，结构甲上除X基因外还应含有标记基因
D．利用图示方法获得的抗体不具有生物学活性,不可以直接用于治疗猴痘病毒感染
【答案】C
【详解】A、细胞A是经S蛋白处理后从小鼠体内分离得到的，是从小鼠的脾中分离得到的B淋巴细胞，A正确；
B、过程②为逆转录，需要逆转录酶，过程③为基因表达载体的构建，需要限制酶和DNA连接酶，B正确；
C、抗原与抗体的结合具有特异性，结合题意可知，欲研究猴痘病毒表面的抗原蛋白S以生产治疗猴痘的抗体，故题图中的X基因为S蛋白抗体基因，C错误；
D、大肠杆菌为原核生物，不具有复杂的细胞器，无法对蛋白质进行加工，因此图示方法获得的抗体不具有生物学活性，不可以直接用于治疗猴痘病毒感染，D正确。
故选C。
要点归纳
1.目的基因获取方法的选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。
(3)如果只知道待扩增目的基因的两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可通过PCR技术扩增目的基因。
2．基因表达载体的构成
3．基因表达载体构建时有关限制酶的选择
选择限制酶时要考虑目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。
②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的酶切位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶与切割目的基因的限制酶一般相同，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶应不能切割质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，用于重组DNA的鉴定和选择。如图乙中质粒不能使用限制酶Sma Ⅰ切割，因为会破坏标记基因。
4．基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子。在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
5．启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
6．常用的转化方法
7.受体细胞的选择
(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。
(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。
(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。
8．目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
(1)图中a细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。
(2)图中b在进行细胞减数分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
[易错警示]
PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。
2．在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
3．微生物细胞作为受体细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。将基因表达载体(重组质粒)导入微生物细胞的常用方法是Ca2＋处理法(感受态细胞法)。
4．农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T­DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
1．下图分别表示某种质粒和含目的基因的DNA片段，利用相关工具酶将二者构建成基因表达载体并导入受体菌。几种可供使用的限制酶识别序列及其切割位点为EcRⅠ：-G↓AATTC-；BamHⅠ：-G↓GATCC-；BclⅠ：-T↓GATCA-；Sau3AⅠ：-↓GATC-；SmaⅠ：-CCC↓GGG-。

注：TetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
下列关于构建基因表达载体时限制酶的选择及其相关叙述，错误的是（ ）
A．若单独使用SmaI，则目的基因表达的产物可能不相同
B．若单独使用SmaⅠ，则含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长
C．若选择BamHⅠ和SmaI，能在四环素培养基中生长的受体菌一定含有目的基因
D．若用EcRI和BclⅠ切割质粒，则需用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA
【答案】C
【详解】A、用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段后，目的基因可能会反向连接到质粒上，因此目的基因表达的产物可能不相同，A正确；
B、若单独使用SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长，B正确；
C、若选择BamHⅠ和SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，重组质粒上含有正常的四环素抗性基因：能在四环素培养基中生长的受体菌有可能获得了重组质粒，也有可能获得的是普通质粒，C错误；
D、含目的基因的DNA片段上没有BclⅠ的识别序列，不能使用BclⅠ切割含目的基因的DNA片段，但Sau3AⅠ切割DNA后产生的黏性末端与BclⅠ相同，故若用EcRⅠ和BclⅠ切割质粒，则需用EcRⅠ和Sau3AI切割含目的基因的DNA片段，D正确。
故选C。
2．SOD是一种广泛分布于各种细胞中的抗氧化酶，它能催化超氧阴离子自由基形成H2O2，增强植物的抗逆性。如图流程为培育能够产生SOD农作物新品种的一种方式，下列有关叙述正确的是（ ）
A．①过程中可用选择培养基筛选出含SOD基因的新细胞
B．②过程通常需要提供光照条件
C．与②过程对比，③过程培养基中激素的比例应保持不变
D．利用该过程产生的新植株属于有性繁殖
【答案】A
【详解】A、在基因工程中将目的基因导入受体细胞后，可以通过相应的选择培养基或其他方式进行初步的筛选出含SOD基因的新细胞， A正确；
B、②过程形成愈伤组织，因此表示脱分化，脱分化需要避光培养，B错误；
C、③过程是再分化，所用激素的比例与脱分化时所用的比例不一样，C错误；
D、利用该过程产生的新植株未经两性细胞的结合，属于无性繁殖，D错误。
故选A。
3．快速准确的检测对疫情防控起着至关重要的作用。病毒的检测方法有：①用“新冠病毒核酸检测试剂盒”，检测病毒的遗传物质RNA；②特异性抗原蛋白检测，即检测病毒表面的一种糖蛋白；③特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体。下列有关说法不正确的是（ ）
A．方法②③都需要用到抗原—抗体杂交的方法
B．方法①②③都需要从患者体内采集病毒样本
C．某人有可能①②为阳性③为阴性，也可能③为阳性①②为阴性
D．由于RNA比DNA稳定性差，核酸检测时往往需将病毒样本的RNA反转录成cDNA，扩增之后进行分段测序
【答案】B
【详解】A、方法②③都是检测蛋白质，都需要用到抗原―抗体杂交的方法，A正确；
B、新冠病毒为RNA病毒，具有RNA聚合酶基因，无逆转录基因，其RNA首先侵入机体，然后经过复制过程并指导相关蛋白质合成，进而完成病毒自身的增殖过程，同时机体产生相应的抗体，抗体的产生的快慢可能会因人而异，据此推测：RNA检测和抗原蛋白检测需要从患者体内采集病毒样本，而检测抗体不需要采集病毒样本，B错误；
C、某人有可能①②为阳性③为阴性，即感染了新冠病毒但还未产生抗体，也可能③为阳性①②为阴性，即抗体阳性，可能感染该病毒但痊愈或注射疫苗产生了抗体，C正确；
D、由于RNA相比DNA稳定性差，往往将病毒样本的RNA反转录成cDNA，D正确。
故选B。
4．研究发现，某农作物的品系N具有抗虫、高产等优良性状，但是甜度不高，而基因Z与农作物的甜度有关。科研人员以Ti质粒为载体，以品系N的叶片外植体为受体，培育转Z基因的新品系n。下列叙述错误的是（ ）
A．若只用一种限制酶切割目的基因和Ti质粒可能导致目的基因反向插入载体
B．培育转Z基因的新品系n的过程中利用了植物细胞的全能性
C．成功转入重组Ti质粒的叶片细胞培育成的植株即为新品系n
D．重组DNA技术可定向改变生物的性状
【答案】C
【详解】A、若只用一种限制酶切割目的基因和Ti质粒，会产生相同的末端而导致反向连接，A正确；
B、培育转Z基因的新品系n的过程利用了叶片作为外植体培育成植株，利用了植物细胞的全能性，B正确；
C、成功转入重组Ti质粒的叶片细胞培育成的植株中基因Z不一定能稳定遗传和表达，还要进行进一步的筛选，C错误；
D、重组DNA技将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术，可定向改变生物的性状，D正确。
故选C。
5．基因芯片技术是将待测DNA分子用放射性同位素或荧光物质标记，如果能与芯片上的单链DNA探针配对，它们就会结合起来，并出现“反应信号”。下列说法中错误的是（ ）
A．基因芯片的工作原理是碱基互补配对，碱基间会形成氢键
B．待测的DNA分子首先要解旋变为单链，才可用基因芯片检测
C．“反应信号”是由待测DNA分子与基因芯片上的放射性探针结合产生的
D．基因芯片技术可以用于亲缘关系鉴定、遗传病检测等
【答案】C
【详解】A、根据题干信息“如果能与芯片上的单链DNA探针配对，它们就会结合起来，并出现反应信号”可知基因芯片的工作原理是碱基互补配对，碱基间会形成氢键，A正确；
B、探针是已知的单链DNA分子，因此待测的DNA分子首先要解旋变为单链，才可用基因芯片测序，B正确；
C、由于将待测DNA分子用放射性同位素或荧光物质标记，所以“反应信号”是由放射性标记的待测DNA分子与单链DNA探针结合产生的，C错误；
D、基因芯片技术可以检测未知DNA碱基序列，可以用于亲缘关系鉴定、遗传病检测等，D正确。
故选C。
6．如图为转基因抗虫烟草的培育流程，下列叙述正确的是（ ）
A．培育过程①需要使用纤维素酶和果胶酶
B．培育过程②将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要使用CaCO3处理农杆菌
C．培育过程③④仅通过调节植物激素可诱导愈伤组织再生出新植株
D．可通过观察害虫吞食转基因烟草后的存活情况进行个体水平检测
【答案】D
【详解】A、过程①表示基因表达载体的构建过程，即形成重组Ti质粒的过程，需要使用限制酶和DNA连接酶，不需要纤维素酶和果胶酶，A错误；
B、过程②是将目的基因导入受体细胞的过程，在将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要先使用CaCl2处理农杆菌，B错误；
C、过程③④为再分化形成植株的过程，该过程中需要通过调节营养物质和植物激素的配比，从而实现由愈伤组织诱导出芽和根的顶端分生组织的目的，并由此再生出新植株，C错误；
D、可通过进行个体水平的检测判断转基因抗虫烟草是否培育成功，即让害虫吞食转基因烟草，观察害虫的存活情况进行判断，D正确。
故选D。
7．利用农杆菌转化法将苏云金杆菌的Bt基因导入棉花细胞获得抗虫棉，可有效减少农药使用，提高棉花产量。下列相关叙述错误的是（ ）
A．农杆菌转化法和肺炎链球菌转化实验的原理相同
B．苏云金杆菌和棉花的基因都是有遗传效应的DNA片段
C．农杆菌转化法一般需要农杆菌的Ti质粒作为表达载体
D．由该种方法获得的转基因抗虫棉无法将抗虫基因遗传给子代
【答案】D
【详解】A、农杆菌转化法和肺炎链球菌转化实验的原理相同，均是基因重组，A正确；
B、苏云金杆菌和棉花的遗传物质均是DNA，故苏云金杆菌和棉花的基因都是有遗传效应的DNA片段，B正确；
C、农杆菌转化法一般需要农杆菌的Ti质粒作为表达载体，Ti质粒上的T-DNA可以将目的基因转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，C正确；
D、农杆菌转化法将Bt基因插入到转基因抗虫棉的染色体DNA中，所以转基因抗虫棉体内的Bt抗虫基因可以通过有性生殖遗传给子代，D错误。
故选D。
8．在细菌和病毒类疾病检测、遗传疾病诊断、肿瘤筛查和诊断中，都可采用PCR 技术。PCR反应由变性→复性→延伸三个基本反应步骤构成，PCR 完成以后常需要鉴定PCR的产物。下列叙述正确的是（ ）
A．变性：耐高温的 DNA 聚合酶将双链DNA 解链为单链
B．复性：两种引物与两条单链DNA结合不必控制温度
C．延伸：4 种脱氧核苷酸加到引物的5端
D．鉴定：DNA 聚合酶质量不好可能导致鉴定结果不仅有一条带
【答案】D
【详解】A、变性过程中DNA双链解开是温度作用的结果，不是耐高温DNA聚合酶的作用，A错误；
B、两种引物与两条单链DNA结合需要适宜的温度，B错误；
C、DNA的合成方向总是从子链的5′端向3'端延伸的，4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，C错误；
D、DNA聚合酶质量不好可能导致实验鉴定失败，出现不仅一条带，D正确。
故选D。
9．为实现高效降解厨余垃圾中纤维素的目的，科研人员将纤维素内切葡聚糖前基因 导入蕊酵母中，获得能高效表达EGⅢ基因的工程菌，图示中BamHT、EcRI、SalI为限制酶。下整列相关叙述错误的是（ ）
A．构建重组质粒需用到，BamHI、SalI和DNA连接酶.
B．筛选目的菌时，所用的培养基中应含有氨苄青霉素
C．培育该工程菌与培育三倍体充子西瓜所运用的原理相同
D．质粒中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位
【答案】C
【详解】A、据图可知，EcRI会破坏目的基因，因此构建重组质粒需用到BamHI、SalI，然后用DNA连接酶进行拼接，A正确；
B、SalI会破坏卡那霉素抗性基因，筛选出目的菌时，所用培养基中应含有氨苄青霉素，B正确；
C、培育该工程菌运用的原理是基因重组，培育三倍体无子西瓜所运用的原理是染色体数目变异，C错误；
D、质粒中的启动子是一段特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D正确。
故选C。
10．在相对湿度为92%时，沃森和克里克对所得到的含 300个碱基对的双螺旋 DNA钠盐纤维进行分析发现，腺嘌呤占 20%，碱基对与中心轴垂直，相邻碱基对之间垂直距离为0．34 nm，螺旋一圈的垂直长度约为 3．4 nm。下列叙述正确的是（ ）
A．该 DNA碱基对之间共含有氢键390个
B．该 DNA 复制5 次需要消耗鸟嘌呤5680个
C．每圈螺旋约包含 10个碱基对
D．扩增DNA 时，通常破坏DNA的磷酸二酯键使其变性
【答案】C
【详解】A、300个碱基对中腺嘌呤占 20%，可求得A和T的数量为120，G和C的数量为180，则DNA碱基对之间共含有氢键为120×2＋180×3=780个，A错误；
B、该 DNA 复制5 次需要消耗鸟嘌呤180×（25-1）=5580个，B错误；
C、DNA双螺旋结构盘旋一周的上下垂直距离为3.4 nm，而相邻碱基对之间的垂直距离为0.34 nm，那么DNA分子盘旋一周应有10个碱基对，C正确；
D、DNA变性破坏的是DNA分子中碱基对之间的氢键，D错误。
故选C。
11．科学家将抵御干旱胁迫反应中具有调控作用的 AhCMO 基因转入棉花细胞中，培育出了转基因抗旱棉花。下列相关叙述错误的是（ ）
A．将AhCMO基因导入棉花细胞可用农杆菌转化法
B．构建基因表达载体是培育转基因抗旱棉花的核心工作
C．AhCMO基因成功插入棉花细胞染色体上也未必能正常表达
D．PCR 扩增AhCMO 基因时需要设计两种碱基互补的引物
【答案】D
【详解】A、将AhCMO基因导入棉花细胞可用农杆菌转化法，因为农杆菌中的Ti质粒能将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，A正确；
B、构建基因表达载体是培育转基因抗旱棉花的核心工作，即基因表达载体的构建是基因工程的核心，B正确；
C、AhCMO基因成功插入棉花细胞染色体上也未必能正常表达，因为基因的表达包括转录和翻译两个步骤，因此还需要对转基因棉花进行进一步的检测和鉴定，C正确；
D、PCR 扩增AhCMO 基因时需要设计两种引物，这两种引物之间不能发生碱基互补配对，否则无法实现DNA体外扩增，D错误。
故选D。
12．应用生物工程技术可获得人们需要的生物新品种或新产品，下图是制备单克隆抗体的过程，下列叙述错误的是（ ）

A．I细胞为已具有特定免疫的浆细胞，成功转入prG使其具备分裂的能力
B．图中I至Ⅱ过程是检测筛选出既能无限增殖，又能产生特异性抗体的细胞
C．该过程涉及转基因技术，动物细胞融合技术；以及动物细胞培养等技术
D．获取目的基因方法有多种，常用PCR特异性的快速扩增目的基因
【答案】C
【详解】A、通过转基因技术获得可以无限增殖的已免疫的B淋巴细胞，转入的prG使其具备分裂的能力，A正确；
B、图中I至Ⅱ过程是检测筛选出既能无限增殖，又可以产生特异性抗体，进而体外培养获得单克隆抗体，B正确；
C、该过程并未涉及动物细胞融合技术，C错误；
D、快速扩增目的基因常用的方法是PCR扩增，D正确。
故选C。
13．（多选）蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中14表示A上引物可能结合的位置，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述正确的是（ ）
A．若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，会破坏4个磷酸二酯键
B．若用PCR技术获取目的基因，则图中的2、3分别是2种引物结合的位置
C．若受体细胞为大肠杆菌，则需先用Ca2+处理，更利于实现转化
D．在PCR扩增仪中根据选定的引物至少需经过6次循环才可获得32个两条链等长的目的基因片段
【答案】ABCD
【详解】A、若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，DNA每条链上会破坏2个磷酸二酯键，共会破坏4个磷酸二酯键，A正确；
B、由于DNA聚合酶只能从5′→3′延伸子链，图中的磷酸基团为5'端，羟基为3′端，由引物3′端延伸子链，子链和模板链反向平行，因此根据引物的延伸方向可知图中与引物结合的部位是2、3，B正确；
C、以大肠杆菌作为受体细胞，先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中，C正确；
D、根据PCR扩增的特点，到第三次循环才能获得2个两条链等长的目的基因片段，第四次循环能获得8个两条链等长的目的基因片段，第五次循环能获得22个两条链等长的目的基因片段，第六次循环能获得52个两条链等长的目的基因片段，所以至少需要6次循环可获得32个符合要求的目的基因，D正确。
故选ABCD。
14．（多选）科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（LPG），可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（ ）

A．转入的LPG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性
B．LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段
C．标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
D．可以利用PCR技术筛选含有LPG基因的受体细胞
【答案】ABD
【详解】A、目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存和活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确；
B、LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段，即相同的黏性末端，B正确；
C、标记基因Ampr可筛选含有目的基因的受体细胞，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，C错误；
D、PCR技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L-PG基因的受体细胞，D正确。
故选ABD。
15．I请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因时，需经过变性、复性、延伸等阶段。设计PCR过程所需引物的主要依据是 。复性时，引物与模板链发生 ，其温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但 的引物需要设定更高的复性温度。若PCR反应得不到任何扩增产物，原因可能有 （填序号）。
①变性温度过低②复性温度过低③缓冲液中Mg2+浓度过低
(2)据图1分析，BamHⅠ切割形成的黏性末端是 。
II下图甲为获取的含有目的基因的DNA片段，Sau3AⅠ、EcRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图。回答下列问题：
(3)为了使目的基因与质粒定向连接，切割图甲所示DNA片段的最佳方案是选用 酶。
(4)PCR技术的原理是 ，基因工程的基本原理是 ，在PCR反应体系中，除了加入目的基因和引物外，还需要添加的物质有 （至少答出两种）。
(5)与只使用一种限制酶处理质粒和目的基因相比较，使用两种限制酶同时处理质粒和目的基因的优点在于可以防止 。
(6)基因工程中载体DNA必须满足的条件是 （至少写出两项）。
【答案】(1) 目的基因两端的部分核苷酸序列 碱基互补配对 GC含量高 ①③
(2)CTAG或GATC
(3)BamH I和EcR I
(4) DNA半保留复制 基因重组 4种脱氧核苷酸、Taq酶、含Mg2+缓冲液
(5)质粒和目的基因片段自身环化
(6)载体DNA必需有一个至多个限制酶的切割位点；载体DNA必需具备自我复制的能力（或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA进行同步复制）；载体DNA必需带有标记基因。
【详解】（1）PCR过程所需引物本质是与目的基因两端序列互补的一小段单链DNA，所以，设计PCR过程所需引物的主要依据就是目的基因两端的部分核苷酸序列。根据PCR的过程可知，低温复性时，引物结合到互补链DNA上，所以引物与模板链发生碱基互补配对。引物与模板复性所需要的温度取决于引物的长度、碱基组成，长度相同但引物中GC的含量越高（GC含量高的DNA结构更稳定），所需的复性温度越高。变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，若变性温度过低就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动，PCR反应得不到任何扩增产物；Mg2+是DNA聚合酶的必需激活剂，若缓冲液中Mg2+浓度越低，聚合酶活性越低，扩增效率也就越低，产物就越少，甚至使PCR扩增失败而没有产物。所以若PCR反应得不到任何扩增产物，原因可能有①变性温度过低和③缓冲液中Mg2+浓度过低。
（2）根据图1分析可知，BamHⅠ的识别序列为-GGATCC-且切点在G与G之间，故BamHⅠ切割形成的黏性末端是CTAG或GATC。
（3）根据图乙分析可知，Sau3AⅠ、EcRⅠ、BamHⅠ三种限制酶，产生相同黏性末端的是BamHⅠ和Sau3AⅠ，其粘性末端为（-GATC-），为了防止目的基因和质粒的自我环化、目的基因在质粒上的连接方向不确定等情况，应该选择不同的限制酶切割目的基因的两侧以及质粒，结合图甲分析，Sau3AⅠ会破坏目的基因，应该选择BamH I和EcR I切割图甲所示DNA片段。
（4）PCR技术是一种体外复制的技术，PCR技术的原理是DNA半保留复制，基因工程的基本原理是基因重组。在PCR反应体系中，除了加入目的基因和引物外，还需要添加的物质有4种脱氧核苷酸、Taq酶、含Mg2+缓冲液。
（5）一般需要选择2种不同的限制酶切割目的基因和质粒并产生不同的粘性末端，与只使用一种限制酶处理质粒和目的基因相比较，使用两种限制酶同时处理质粒和目的基因的优点在于可以防止质粒和目的基因片段自身环化。
（6）基因工程中载体将目的基因运输到受体细胞中去，基因工程中载体DNA必须满足的条件是载体DNA必需有一个至多个限制酶的切割位点；载体DNA必需具备自我复制的能力，载体DNA必需带有标记基因等。
16．猕猴桃溃疡病是一种严重影响猕猴桃产量的细菌性病害。为获得抗猕猴桃溃疡病的转基因猕猴桃，科研人员以猕猴桃的愈伤组织（对卡那霉素敏感）为转基因受体，通过农杆菌转化法将抗菌肽基因导入猕猴桃。图1表示抗菌肽基因和卡那霉素抗性基因（nptⅡ基因）及其上限制酶酶切位点的分布情况，图2表示Ti质粒及其上限制酶酶切位点的分布情况。回答下列问题：

(1)限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断裂。限制酶主要来源于原核生物，但不会切割原核生物自身的DNA分子，推测原因是 。目的基因可随T-DNA整合到目的细胞的染色体DNA上，这体现了 的生物学变异原理。
(2)若只用EcRI切割目的基因和Ti质粒，会产生多种连接产物。为筛选出含有目的基因正向连接的重组Ti质粒的菌株，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到了①②③三类菌落，其生长情况如下表，“+”表示生长，“-”表示不生长。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填表中序号），菌落②的导入情况是 。
(3)若既要避免上述多种连接情况的发生，又要使目的基因最终能整合到猕猴桃愈伤组织细胞的染色体DNA上，最好选择限制酶 对目的基因和Ti质粒进行切割。
【答案】(1) 磷酸二酯键 原核生物的DNA分子上没有该限制酶的识别序列(或识别序列被修饰，使限制酶不能将其切开) 基因重组
(2) ③ 导入不含目的基因的Ti质粒(自身环化的Ti质粒)(或导入目的基因反向连接的重组Ti质粒)
(3)KpnI和PstI
【详解】（1）限制酶能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。由于限制酶来源于原核生物，可能 原核生物的DNA分子上没有该限制酶的识别序列(或识别序列被修饰，使限制酶不能将其切开)，所以限制酶不能将原核生物的DNA切开。目的基因可随T-DNA整合到目的细胞的染色体DNA上，这属于基因重组。
（2）从图1和图2看出，用EcRI切割目的基因和Ti质粒，目的基因上有卡那霉素抗性基因，质粒上有氨苄青霉素抗性基因，二者重组后，对氨苄青霉素和卡拉霉素都有抗性，所以应该选择③，菌落②对卡拉霉素不具抗性，但抗氨苄青霉素，应该导入不含目的基因的Ti质粒。
（3）为避免质粒或目的基因自身连接，根据质粒和目的基因的限制酶分布情况，可以选择KpnI和PstI（二者形成的粘性末端不同，且在质粒和目的基因上都有该酶的酶切位点）。
17．过度饮酒可能会导致人体的健康问题，据此科研人员展开了相应的研究。
(1)肝脏是酒精的主要代谢场所，酒精的代谢途径如图所示：
在缺少糖原的条件下， 菌也可发生上图的代谢过程。服用头孢类药物后饮酒会造成乙醛中毒，推测这是因为头孢类分子可抑制 活性。
(2)最近研究人员构建了一种含hADH1B基因(乙醇脱氢酶基因)的工程益生菌，服用益生菌可加速肠道内的酒精分解。该基因工程益生菌构建过程如图甲：
①分析表、图甲，应选用 酶切割质粒和hADH1B基因片段。
②依据图乙中的原理，用碱性磷酸单酯酶处理酶切后的质粒(使﹣P变成﹣OH)，这样可防止质粒的 。
③若将上述处理后的质粒与酶切后的hADH1B基因片段连接，由于﹣OH与﹣OH不能连接而形成2个切口的重组DNA。设计合理的引物进行PCR，至少扩增 轮后，再通过DNA连接酶处理可获得无切口的环状重组DNA(基因表达载体)。
④但上述实验不能避免目的基因的反向连接，请补充下面的实验方案，确定出目的基因的连接方向。
实验方案：先将基因表达载体进行EcR Ⅰ的单酶切，然后通过 电泳分离鉴定。
预期结果：若出现 bp的条带和 bp的条带，则目的基因反向连接；若出现 bp的条带和 bp的条带，则目的基因连接正确。
【答案】(1) 醋酸 乙醛脱氢酶
(2) SmaⅠ 自身环化 2 琼脂糖凝胶 220 1700 420 1500
【详解】（1）在缺少糖原的条件下，醋酸菌也可代谢产乙酸。据图所示，当乙醛脱氢酶活性受到抑制时，会造成乙醛中毒，所以可推测头孢类分子抑制了乙醛脱氢酶的活性。
（2）①BamHⅠ会切割质粒的标记基因，EcRⅠ会切割目的基因，故使用SmaⅠ切割。
②碱性磷酸单酯酶处理酶切后的质粒的末端5′−OH与正常存在的3′−OH不能连接，故可以防止质粒自身环化。
③当PCR进行2轮后，可得到双链都为5′−P的双链DNA，通过DNA连接酶处理可获得无切口的环状重组DNA。
④通过图甲可推导出，正向连接会酶切出420bp和1500bp大小的条带，反向连接会酶切出220bp和1700bp大小的条带，所以若将。基因表达载体进行EcR Ⅰ的单酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳电泳，若出现420bp和1500bp大小的条带，则为正向连接，反之，若出现220bp和1700bp大小的条带，则为反向连接。
新课程标准
学习目标
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建等步骤。
1.阐明基因工程的基本操作程序。
2.描述获取目的基因的方法及基因表达载体的构建。
3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
检测水平
检测方法
分子水平检测
通过 等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，检测目的基因是否转录出了 .
检测目的基因是否翻译出蛋白质，采用 .
个体生物学水平鉴定
如做抗虫或抗病接种实验等
项目
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
化学
成分
DNA片段
DNA片段
mRNA上三
个相邻碱基
mRNA上三
个相邻碱基
位置
目的基因首端
目的基因
尾端
mRNA首端
mRNA尾端
作用
RNA聚合酶识别和结合的部分，驱动基因转录出mRNA
决定转录
的结束
翻译的起
始信号
决定翻译
过程的结束
受体
细胞
类型
方法
说明
特点
植
物
细
胞
农杆
菌转
化法
将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T­DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达
经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物
基因
枪法
将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中→目的基因整合并表达
成本较高，常用于单子叶植物
花粉
管通
道法
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达
简便、经济，我国科学家独创的一种方法
动物细胞
显微注射技术
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物
将目的基因导入动物细胞最为有效的方法
微生物细胞
Ca2＋处理法(感受态细胞法)
用Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子
简便、经济、有效
项目
①
②
③
无抗生素
+
+
+
卡那霉素
-
-
+
氨苄青霉素
-
+
+
卡那霉素+氨苄青霉素
-
-
+
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamH Ⅰ
G↓GATCC
EcR Ⅰ
C↓AATTC
Sma Ⅰ
CCC↓GGG
新课程标准
学习目标
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建等步骤。
1.阐明基因工程的基本操作程序。
2.描述获取目的基因的方法及基因表达载体的构建。
3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
检测水平
检测方法
分子水平检测
通过PCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，检测目的基因是否转录出了mRNA.
检测目的基因是否翻译出蛋白质，采用抗原—抗体杂交法.
个体生物学水平鉴定
如做抗虫或抗病接种实验等
项目
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
化学
成分
DNA片段
DNA片段
mRNA上三
个相邻碱基
mRNA上三
个相邻碱基
位置
目的基因首端
目的基因
尾端
mRNA首端
mRNA尾端
作用
RNA聚合酶识别和结合的部分，驱动基因转录出mRNA
决定转录
的结束
翻译的起
始信号
决定翻译
过程的结束
受体
细胞
类型
方法
说明
特点
植
物
细
胞
农杆
菌转
化法
将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T­DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达
经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物
基因
枪法
将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中→目的基因整合并表达
成本较高，常用于单子叶植物
花粉
管通
道法
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达
简便、经济，我国科学家独创的一种方法
动物细胞
显微注射技术
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物
将目的基因导入动物细胞最为有效的方法
微生物细胞
Ca2＋处理法(感受态细胞法)
用Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子
简便、经济、有效
项目
①
②
③
无抗生素
+
+
+
卡那霉素
-
-
+
氨苄青霉素
-
+
+
卡那霉素+氨苄青霉素
-
-
+
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamH Ⅰ
G↓GATCC
EcR Ⅰ
C↓AATTC
Sma Ⅰ
CCC↓GGG