生物选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序课文ppt课件

这是一份生物选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序课文ppt课件，共42页。PPT课件主要包含了DNA半保留复制，穆里斯，提供DNA复制的模板，合成DNA子链的原料，N0∙2n，基因组文库，单链互补DNA，双链DNA片段，基因表达载体，cDNA文库等内容，欢迎下载使用。
3.2 基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的筛选与获取目的基因：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关基因
苏云金杆菌的通过产生产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。这个杀虫基因就是培育转基因抗虫棉用到的目的基因---Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。
那么，如何筛选目的基因呢？
第一步：目的基因的筛选与获取1.筛选合适的目的基因：（1）方法：
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
实例：苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害；苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关；科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白也有较为深入的了解。因此，筛选Bt基因作为培育转基因抗虫棉的目的基因。
②随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。
第一步：目的基因的筛选与获取2.利用PCR获取和扩增目的基因：----获取目的基因的方法有多种 ，如利用PCR获取和扩增法目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因等。现在，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。
（1）PCR的概念：P77
是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
注意：①原理：②发明者：③反应条件：
P77表3-1+P77文字
打开DNA双链（断开氢键）
（将单个核苷酸）催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
P77相关信息 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物为人工合成的DNA单链，长度通常为20~30个核苷酸。（体内复制的引物为RNA单链）
2.利用PCR获取和扩增目的基因：③反应条件：P77表3-1 DNA复制所需的基本条件
2.利用PCR获取和扩增目的基因：（1）概念③反应条件：P77表3-1+P77文字
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
P77相关信息 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。
第一步：目的基因的筛选与获取2.利用PCR获取和扩增目的基因：（2）扩增过程：P77文字+P78图3-5
目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3，端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。
（2）扩增过程：P78图3-5
①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。
②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。
第一步：目的基因的筛选与获取2.利用PCR获取和扩增目的基因：（2）扩增过程：P77文字+P78图3-5 上述过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，才采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
注意：PCR扩增的计算（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为————个。（2）若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为————————个。
注意：PCR反应过程中
1. 缓冲溶液需要为PCR反应提供的物质有：
DNA模板，4种脱氧核苷酸，分别与两条模板链相结合的两种引物，耐高温的DNA聚合酶。一般还要添加Mg2+。
2. DNA聚合酶的特性：
耐高温，且不能从头合成DNA，只有当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶才能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸
3. PCR和细胞内复制的不同点：
PCR过程需要的引物不是RNA单链，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸
P79 思考：用PCR可以扩增mRNA吗？
不可以直接扩增。因为mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
（1）基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
①基因组文库：含有一种生物的全部基因。
提取某种生物的全部DNA
用适当的 限制酶酶切
将DNA片段与载体连接
②部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
第一步：目的基因的筛选与获取3.＊通过构建基因文库来获取目的基因：P82
第二步：基因表达载体的构建（核心）1.目的：就是要让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因+标记基因+启动子+终止子+复制原点
（1）目的基因：如Bt基因。
（2）标记基因 ①作用：便于重组DNA分子的筛选 ②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
第二步：基因表达载体的构建（核心）2.组成：目的基因+标记基因+启动子+终止子+复制原点
（3）启动子：（4）终止子：
是一段有特殊序列结构的DNA片断，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
使转录在所需要的地方停下来，位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片断，。
（5）复制原点：基因表达载体自我复制起始的一段序列
载体≠表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
第二步：基因表达载体的构建（核心）3.构建：P80图3-6
DNA分子（含目的基因）
带有相同黏性末端的目的基因片段
同一种 限制酶 或能产生相同 末端的限制酶
重组DNA分子（重组质粒）
将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有：
故实际应用中往往选择2种不同的限制酶分别切割，减少自连情况出现；还应用标记基因对重组DNA进行筛选。
目的基因与目的基因连接
第三步：将目的基因导入受体细胞1.导入植物细胞
（1）花粉管通道法多种操作方式：例如，可以用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
（2）农杆菌转化法：常用的方法。①转化：②农杆菌特点：
是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
农杆菌细胞Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
第三步：将目的基因导入受体细胞1.导入植物细胞（2）农杆菌转化法③过程：P81图
构建 表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入 农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入 植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
第三步：将目的基因导入受体细胞2.＊导入动物受精卵：显微注射
提纯含目的基因表达载体
表达载体与感受态细胞混合
用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性。
第三步：将目的基因导入受体细胞3.＊导入原核生物：Ca2+处理
三.将目的基因导入受体细胞
小结：第三步 将目的基因导入受体细胞
第四步 目的基因的检测与鉴定
2.个体生物水平的鉴定
练习与应用：P83一1.（1）（ ） （2）（ ） （3）（ ） 2.（ ）二、1.
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
（1）crtⅠ基因和psy基因 pmi基因 将目的基因送入水稻细胞。
练习与应用：P83二2.
（2）不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
（3）维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。 β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，便其胚乳中富含β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。
探究.实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
（一）、实验原理1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。
（一）、实验原理2.DNA片段电泳鉴定的原理：
（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理。2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
(三)、材料用具：P84 1.用具:（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）；（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）；（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）；（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）；（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
2.反应条件：（1）4种脱氧核苷酸的等量混合液；（2）2种引物；（3）TaqDNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）；（4）模板DNA；（5）扩增缓冲液（Mg2+等)
3.试剂：（1）无菌水；（2）电泳缓冲液（P117 附录3 表1）；（3）凝胶载样缓冲液（P117 附录3 表2 内含指示剂——溴酚蓝）；（4）琼脂糖和核酸染料等（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
4.PCR反应体系的配方：
注：模板DNA的用量为1pg~1ug。
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
2.DNA片段的电泳鉴定
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
(六)、结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
1.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等
1.下列属于PCR技术所需条件的是（ ）①单链的核苷酸序列引物　②目的基因所在的DNA片段 ③脱氧核苷酸　④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　⑥DNA聚合酶　⑦限制酶A.①②③⑤B.①②③⑥ C.①②③⑤⑦ D.①②④⑤⑦2.质粒上的抗性基因在基因工程中的主要作用是( )A.使目的基因在受体细胞内易于表达B.使受体细胞具有抗药性C.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测D.促进目的基因与导入的外源基因相连接，提高转基因操作的成功率
3.科学家已能运用基因工程技术，让羊合成并由乳腺分泌抗体，相关叙述中正确的是( )①该技术将导致定向变异；②DNA连接酶能把目的基因与载体黏性末端的碱基对连接起来；③将目的基因导入受体细胞时采用显微注射技术；④受精卵是理想的受体。A.①②④ B.①③④ C.②③④ D.①②③④
4.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（ ）①将毒素蛋白注射到棉受精卵中；②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养；④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。A.①② B.③④ C.②③ D.①④
5.利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。下列说法不正确的是( )A.cDNA文库的构建需要用到逆转录酶B.图中的菌落是通过稀释涂布平板法获得的C.核酸分子杂交的原理是碱基互补配对D.从该文库中可以筛选到胰高血糖素基因