还剩21页未读，
继续阅读
所属成套资源：高二生物同步练习(2019人教版 选择性必修第三册)
成套系列资料，整套一键下载
高中生物第2节 基因工程的基本操作程序同步训练题
展开
这是一份高中生物第2节 基因工程的基本操作程序同步训练题，共24页。试卷主要包含了目的基因，筛选目的基因，获取目的基因，1至0，基因工程第二步操作程序是，微生物常被用于基因工程中等内容，欢迎下载使用。
3.2 基因工程的基本操作程序
目标导航
教学目标
课程标准
目标解读
基因工程是一种重组DNA技术。
1. 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
1. 阐明基因工程的原理和基本操作程序。
2. 针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
3. 尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
教学重点
1. 基因工程基本操作程序的四个步骤。
2. DNA片段的扩增及电泳鉴定。
教学难点
1. 利用PCR获取和扩增目的基因。
2. DNA片段的扩增及电泳鉴定。
知识精讲
知识点01 第一步：目的基因的筛选与获取
1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。也指能够编码特定蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2.筛选目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一
3.获取目的基因：
（1）人工合成
（2）基因文库中获取目的基因
（3）利用PCR获取和扩增
①PCR：PCR全称为聚合酶链式反应，又叫做体外DNA扩增技术。根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。
②PCR利用的原理：DNA半保留复制
③DNA复制的基本条件：
④PCR的前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
⑤PCR的条件：
DNA模板（需含有目的基因）。
分别与模板DNA相结合的2种引物。
四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）。
稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
能严格控制温度的温控设备。
⑥PCR的过程：
⑦PCR的结果：以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）
⑧鉴定PCR的产物：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物
知识点02 第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体的组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子
基因表达载体构建过程：一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶将两者连接。
知识点03 第三步：将目的基因导入受体细胞
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内稳定存在和表达的过程。
2.将目的基因导入受体细胞的方法：
（1） 花粉管通道法：
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
（2）农杆菌转化法：
①农杆菌的特点：
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。
②农杆菌转化法的原理：根据农杆菌的特点，将目的基因插入Ti质粒上的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入细胞。
③农杆菌转化法适用于那些植物：农杆菌转化法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
3.方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
知识点04 第四步：目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
(1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中：DNA分子杂交或PCR等技术。
基因探针：简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂）、且顺序已知的、与目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。
用放射性同位素标记的含有目的基因的单链DNA片段制成基因探针。将转基因生物的基因组DNA提取出来，和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。
(2)检测目的基因是否转录：分子杂交或PCR技术。
将转基因生物提取出来的mRNA和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经转录。
(3)检测目的基因是否翻译出蛋白质：抗原—抗体杂交技术。
从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。
2.个体水平的鉴定
(1) 抗虫或抗病的接种实验。
(2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较。
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
知识点05 DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA片段扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
3.PCR 产物的鉴定：一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
能力拓展
考点01 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的获取
除了PCR（利用PCR技术扩增目的基因）和人工合成（如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。）外，也可从基因文库中获取。
基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例如cDNA文库，首先得到mRNA，再反转录得cDNA，形成文库。cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。
二、 基因表达载体的构建
基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核苷酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（重组质粒）的。然而，由于外源DNA片段和载体的黏性末端均相同，因而在连接反应中外源DNA片段和质粒DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入大肠杆菌（E. coli）受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
也可用两种不同的限制酶切割产生非互补的黏性末端。一般情况下,常用质粒均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源DNA片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
三、 将目的基因导入受体细胞
1.导入植物细胞：
（1）花粉管通道法
花粉管通道法是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。这一技术原理可以应用于任何开花植物。
（2） 基因枪法
基因枪法，又叫粒子轰击细胞法或微弹技术。基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（如：将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，形成粘有DNA 的细微金粉、金粒或钨粒），以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用较低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。
（3）农杆菌转化法
农杆菌是指生活在植物根表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源目的基因向植物细胞的转移和整合，再通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。
2.导入动物细胞：显微注射法
显微注射法是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源目的基因直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。
将从胚胎提供者的输卵管中取得的受精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管固定住，之后注射针则依序穿过透明带、卵黄膜及雄原核膜（malepronuleus membrane），将重组 DNA 注入受精卵的原核中，可以见到原核膨大。操作时，如果显微注射针尖太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。（注：专有名词翻译有待进一步确定）
3.导入微生物：感受态细胞法
①将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。
细胞壁通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
②将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
③将转化后的细胞在选择培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
四、 目的基因的检测与鉴定
1.DNA分子杂交法（DNA探针法）
DNA分子杂交的基础：具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分子解旋成为单链，这个过程称为变性。然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链用同位素进行标记。如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区。由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出。
2.分子杂交
分子杂交其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。
3.抗原-抗体杂交
Western杂交，即蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
【典例1】基因工程步骤不包括（）
A. 对染色体进行改造 B. 目的基因与运载体结合
C. 将目的基因导入受体细胞 D. 目的基因的检测与鉴定
【典例2】在基因工程技术中，限制酶主要用于（ ）
A. 目的基因的提取和导入 B. 目的基因的导入和检测
C. 目的基因与运载体结合和导入 D. 目的基因的提取和与运载体结合
【典例3】下图表示通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中与棉花的DNA分子结合起来而发挥作用的过程示意图。正确的是( )
A. 该技术的核心内容是构建基因表达载体
B. 目的基因在抗虫棉中的遗传要遵循基因的分离定律
C. 图中Ⅰ常直接从大肠杆菌中获取
D. 剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因会影响抗虫基因的表达
【典例4】为获得抗病的马铃薯往往采用转基因技术，将相关抗病基因转移到马铃薯体内．其过程大致如图所示．下列相关叙述，正确的是（ ）
A. 图中①过程涉及两种工具酶，目的基因插入的位置为T-DNA所在的区段
B. 图中②过程，农杆菌需经镁离子溶液处理，处理后的细胞处于感受态
C. 图中③④过程，所用培养基中应添加两种激素，添加顺序对细胞的分化方向无影响
D. 检测相关抗病基因是否在受体细胞内转录，可采用抗原-抗体杂交法
考点02 PCR的基本原理
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
PCR是利用DNA在体外95°C高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪是一个温控设备，能在变性温度、复性温度、延伸温度之间很好地进行控制。一般循环25 ～ 30次，就能将目的基因扩增放大几百万倍。但循环数并不是无限增加的。一般循环数30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加。
PCR反应时需要的条件有：
（1）引物：PCR引物有两条，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。细胞内DNA复制的引物为一段RNA链。
（2）酶：TaqDNA聚合酶
（3）dNTP：四种脱氧核苷酸
（4）模板：PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。
（5）缓冲液：需要Mg2+。
PCR反应扩增出了高的拷贝数后要进行检测。琼脂糖凝胶电泳是最常用的检测手段。
琼脂糖凝胶电泳的原理：
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
琼脂糖凝胶电泳中，影响DNA分子迁移率的因素有：DNA的大小及构型、琼脂糖浓度、DNA的构象、电源电压、嵌入染料的存在、离子强度影响等。
【典例1】多聚酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如右图所示。下列关于PCR技术叙述不正确的是（）
A. PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术
B. 反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
C. PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D. 应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变
分层提分
题组A 基础过关练
单项选择题
1.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（ ）
A. 人工合成基因 B. 目的基因与运载体结合
C. 将目的基因导入受体细胞 D. 目的基因的检测和表达
2.下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A. 目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B. 限制性内切酶只在获得目的基因时才用
C. 重组质粒的形成只能在细胞内完成
D. 质粒分子上的抗性基因有利于目的基因的表达
3. 有关基因工程操作的基本步骤，正确的是（ ）。
①目的基因的检测与鉴定
②获取目的基因
③构建基因表达载体
④将目的基因导入受体细胞
A. ②④①③ B. ②③④① C. ②①③④ D. ①②④③
4.拟利用番茄表达人类凝血因子Ⅸ，操作步骤排序正确的是（ ）
①制备工程农杆菌 ②构建植物表达载体
③获取人类凝血因子Ⅸ基因 ④番茄植株中凝血因子Ⅸ基因的检测
⑤用农杆菌转化番茄植株并筛选 ⑥提取凝血因子Ⅸ并检测活性
A. ③①②⑤⑥④ B. ⑥③①②⑤④ C. ④③②①⑤⑥ D. ③②①⑤④⑥
5.基因工程第二步操作程序是（）
A. 基因表达载体的构建 B. 将目的基因导入受体细胞
C. 获取目的基因 D. 目的基因的检测与鉴定
6.科学家利用基因工程技术将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高。在培育转基因番茄的过程中，下列叙述不正确的是（）
A. 可用PCR技术或逆转录法获得抗冻蛋白基因
B. 在番茄细胞中检测到抗冻蛋白基因即证明转基因技术成功
C. 将抗冻蛋白基因与相应载体连接构建基因表达载体
D. 利用农杆菌转化法将基因表达载体导入番茄体细胞
7.利用农杆菌转化法可将抗虫基因导入大豆细胞获得抗虫植株。下列说法正确的是( )
A. 若对已知序列的抗虫基因进行大量扩增，应用PCR技术
B. 将重组的农杆菌Ti质粒喷洒到大豆伤口上，可成功转化
C. 利用害虫接种实验可从分子水平检测目的基因是否进入了大豆细胞
D. 将抗虫基因导入细胞质不可避免通过花粉传播进入其他植物
8.微生物常被用于基因工程中。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 从耐热的细菌中获取PCR所需的DNA连接酶
B. 大肠杆菌、酵母菌等是基因工程常用的载体
C. 作为载体的DNA分子需具有合成抗生素的基因
D. 常利用土壤农杆菌将目的基因导入植物细胞
9.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是 ( )
A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体
B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
C. 只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达
D. 选用的细菌为重组质粒受体细胞，是因为质粒易进入细菌细胞且繁殖快
10.下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是（ ）
A. 分子杂交技术 B. 抗原-抗体杂交
C. 抗虫或抗病的接种 D. 基因枪法
11.利用PCR技术将某小段DNA分子扩增n代，需（ ）
A. 测定DNA片段的核苷酸序列，以便设计引物对
B. 2n-1对引物参与子代DNA分子的合成
C. 向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等
D. 保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行
题组B 能力提升练
一、单项选择题
1.下列有关基因工程的叙述，正确的是（ ）
A. DNA重组技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和运载体
B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
C. 质粒是常用的运载体，存在于许多细菌以及酵母菌等生物的细胞中，是能够自主复制的很小的链状DNA分子
D. 操作的步骤包括：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
2.为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是( )
A. 用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B. 用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C. 在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D. 用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
3.基因工程为花卉育种提供了新的技术保障。如图为花卉育种的过程（字母代表相应的物质或结构，数字代表过程或方法）。下列说法正确的是（）
A. ①过程需要的酶有限制酶和DNA聚合酶
B. ②过程常用的方法是农杆菌转化法
C. ③、④过程为分化和再分化，该过程体现了植物细胞的全能性
D. 转基因生物DNA上是否插入目的基因，可用抗原—抗体杂交技术进行检测
4.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是（ ）
A. 若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B. 图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切
C. 若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用感受态的大肠杆菌
D. 在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
5.科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶主要蛋白。以下有关基因工程的叙述错误的是（）
A. 在基因工程中，PCR技术可用于任何目的基因的获取，且能迅速获得大量目的基因
B. 启动子对于目的基因在块茎中的表达是不可缺少的
C. 应用DNA探针技术，可以检测转基因马铃薯植株中目的基因的存在及其转录产物
D. 用同一种限制酶，分别处理质粒和含目的基因的DNA，可用DNA连接酶连接形成重组DNA分子
6.科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计中，不合理的是（ ）
A. 用-珠蛋白编码序列加启动子、抗四环素基因等元件来构建基因表达载体
B. 利用小鼠DNA分子通过PCR克隆出-珠蛋白基因的编码序列
C. 用含有四环素的培养基筛选出已经导入-珠蛋白编码序列的大肠杆菌
D. 用处理大肠杆菌后，将表达载体导入具有四环素抗性的大肠杆菌中
7. 番茄叶片受害虫的损伤后，叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂，抑制害虫的消化作用。人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导人玉米，以对付猎獗的玉米螟。下图为培育转基因抗虫玉米的流程图，下列叙述正确的是（）
A. 用限制性核酸内切酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因
B. 用氯化钙处理玉米受体细胞，有利于含目的基因的重组质粒导入
C. 重组Ti质粒应有DNA聚合酶识别和结合的部位，以启动蛋白酶抑制剂基因的转录
D. 若将目的基因导入二倍体玉米的花粉细胞，通过花药离体培养，再用秋水仙素处理单倍体植株，可获得稳定遗传的转基因玉米
8.下图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，有关叙述中错误的是（ ）
A. 基因工程的核心是基因表达载体的构建
B. 可以利用人的皮肤细胞来完成①过程
C. 过程②必需的酶是逆转录酶，过程③不需要用解旋酶
D. 在利用A、B获得C的过程中，可用相同的限制性核酸内切酶切割A和B，使它们产生相同的黏性末端
9.新冠疫情的快速控制，离不开政府的科学决策和我国对新冠病毒（RNA病毒）的快速检测能力。荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图）。Ct值（循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是（）
A. 检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNA
B. PCR每个循环包括变性、退火（引物和模板结合）、延伸3个阶段
C. Ct值就越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
D. 若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性
二、填空题
10.烟草是有重要经济价值双子叶植物，易受TMV（烟草花叶病毒）感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV烟草，操作流程如图。
（1）①表示遗传信息流动中的____过程，所需原料为_____。过程③所需要的工具酶是______________。
（2）大量扩增目的基因可以使用PCR技术，该技术包括变性、复性、延伸三个步骤，变性这一步骤的目的是___________________，复性的目的是________________。
（3）过程④最常用的方法是________，过程⑤用到的细胞工程技术是________。
（4）过程⑥还需要进行基因工程操作步骤中的__________，其中，在个体水平上检验获得的烟草能否抗TMV的方法是_______________________。
题组C 培优拔尖练
一、 单项选择题
1.甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二者杂交后得到F1，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种。以下对相关操作及结果的叙述，错误的是（ ）
A. 将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞
B. 通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定
C. 调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株
D. 经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体
2.在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（ ）
A. 用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞
B. 用选择培养基筛选导入目的基因的细胞
C. 用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生质体融合
D. 用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽
3.下列有关病毒在生物学和医学领域应用的叙述，错误的是（ ）
A. 灭活的病毒可用于诱导动物细胞融合
B. 用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体
C. 基因工程中常用噬菌体转化植物细胞
D. 经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防
4.用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（ ）
A. 图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B. 图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C. 泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D. 图中被酶切的DNA片段是单链DNA
5.下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A. 若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B. 抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C. 抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D. 已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
6.关于DNA的实验，叙述正确的是（ ）
A. 用兔的成熟红细胞可提取DNA
B. PCR的每个循环一般依次经过变性-延伸-复性三步
C. DNA溶液与二苯胺试剂混合，沸水浴后生成蓝色产物
D. 用甲基绿对人的口腔上皮细胞染色，细胞核呈绿色，细胞质呈红色
7.如图表示利用细菌中抗虫基因培育抗虫玉米的过程，其中①～⑧表示操作步骤，a、b表示相关分子，c～e表示培养过程，其中d过程表示细菌与玉米细胞混合培养。下列有关叙述正确的是（ ）
A. 图中需要用到限制酶的是步骤①②③
B. 图中导入目的基因的是步骤④
C. 步骤⑤的主要目的是扩增目的基因
D. 脱分化和再分化的步骤分别是⑦和⑧
8.基因工程的基本操作步骤如图所示，其中甲、乙、丙表示结构，①表示过程。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 甲、乙分别表示含有抗性基因的质粒、受体细胞
B. ①过程表示用有抗生素的培养基筛选含目的基因的受体细胞
C. 丙可以是单细胞、器官、植物或动物等
D. 若要使丙表达人的蛋白质，则乙是能分裂的人体细胞
9.如图是利用基因工程技术生产可使用疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列有关说法正确的是（ ）
A. 图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶均来自原核生物
B. 图示中构建基因表达载体时，需用到一种限制性核酸内切酶
C. 一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列
D. 抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
10.下列有关基因工程操作的叙述中，正确的是（ ）
A. 用同种限制酶切割载体与目的基因可获得相同的粘性末端
B. 检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功
C. 以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同
D. 用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接
11.质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置（插入点a、b、c），请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（）
细菌在含氨苄青霉素培养基上生长情况
细菌在含四环素
培养基上生长情况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
A. ①是c；②是b；③是c B. ①是a和b；②是a；③是b
C. ①是a和b;②是b；③是a D. ①是c；②是a；③是b
12.PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。具体过程见下图。下列对 PCR的相关叙述，正确的是（）
A. 由于PCR过程需要高温处理，因此所加解旋酶也需要耐高温
B. DNA在胞内复制时所用的引物与PCR过程中所加的引物应该相同
C. 若要得到两条链等长的DNA片段，则至少需要完成3轮复制
D. 在基因工程中，可用PCR手段对重组质粒进行大量扩增
二、填空题
13.嗜热土壤芽胞杆菌产生的β-葡萄糖苷酶（BglB）是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：
Ⅰ．利用大肠杆菌表达BglB酶
（1）PCR扩增bglB基因时，选用______基因组DNA作模板。
（2）图1为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入______和______不同限制酶的识别序列。
（3）大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为______．
Ⅱ．温度对BglB酶活性的影响
（4）据图2、3可知，80℃保温30分钟后，BglB酶会______；为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在______（单选）．
A.50℃B.60℃C.70℃D.80℃
Ⅲ．利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性
在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率。经过筛选，可获得能表达出热稳定性高的BglB酶的基因。
（5）与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽胞杆菌相比，上述育种技术获得热稳定性高的BglB酶基因的效率更高，其原因是在PCR过程中______（多选）．
A．仅针对bglB基因进行诱变 B．bglB基因产生了定向突变
C．bglB基因可快速累积突变 D．bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变．
14.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为______末端。
（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为______的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在______酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“-”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是______（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______、______。
A
B
C
无抗生素
+
+
+
氨苄青霉素
+
+
-
四环素
+
-
-
氨苄青霉素+四环素
+
-
-
（ 4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是______。
3.2 基因工程的基本操作程序
目标导航
教学目标
课程标准
目标解读
基因工程是一种重组DNA技术。
1. 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
1. 阐明基因工程的原理和基本操作程序。
2. 针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
3. 尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
教学重点
1. 基因工程基本操作程序的四个步骤。
2. DNA片段的扩增及电泳鉴定。
教学难点
1. 利用PCR获取和扩增目的基因。
2. DNA片段的扩增及电泳鉴定。
知识精讲
知识点01 第一步：目的基因的筛选与获取
1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。也指能够编码特定蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2.筛选目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一
3.获取目的基因：
（1）人工合成
（2）基因文库中获取目的基因
（3）利用PCR获取和扩增
①PCR：PCR全称为聚合酶链式反应，又叫做体外DNA扩增技术。根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。
②PCR利用的原理：DNA半保留复制
③DNA复制的基本条件：
④PCR的前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
⑤PCR的条件：
DNA模板（需含有目的基因）。
分别与模板DNA相结合的2种引物。
四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）。
稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
能严格控制温度的温控设备。
⑥PCR的过程：
⑦PCR的结果：以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）
⑧鉴定PCR的产物：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物
知识点02 第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体的组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子
基因表达载体构建过程：一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶将两者连接。
知识点03 第三步：将目的基因导入受体细胞
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内稳定存在和表达的过程。
2.将目的基因导入受体细胞的方法：
（1） 花粉管通道法：
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
（2）农杆菌转化法：
①农杆菌的特点：
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。
②农杆菌转化法的原理：根据农杆菌的特点，将目的基因插入Ti质粒上的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入细胞。
③农杆菌转化法适用于那些植物：农杆菌转化法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
3.方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
知识点04 第四步：目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
(1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中：DNA分子杂交或PCR等技术。
基因探针：简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂）、且顺序已知的、与目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。
用放射性同位素标记的含有目的基因的单链DNA片段制成基因探针。将转基因生物的基因组DNA提取出来，和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。
(2)检测目的基因是否转录：分子杂交或PCR技术。
将转基因生物提取出来的mRNA和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经转录。
(3)检测目的基因是否翻译出蛋白质：抗原—抗体杂交技术。
从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。
2.个体水平的鉴定
(1) 抗虫或抗病的接种实验。
(2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较。
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
知识点05 DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA片段扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
3.PCR 产物的鉴定：一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
能力拓展
考点01 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的获取
除了PCR（利用PCR技术扩增目的基因）和人工合成（如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。）外，也可从基因文库中获取。
基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例如cDNA文库，首先得到mRNA，再反转录得cDNA，形成文库。cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。
二、 基因表达载体的构建
基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核苷酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（重组质粒）的。然而，由于外源DNA片段和载体的黏性末端均相同，因而在连接反应中外源DNA片段和质粒DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入大肠杆菌（E. coli）受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
也可用两种不同的限制酶切割产生非互补的黏性末端。一般情况下,常用质粒均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源DNA片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
三、 将目的基因导入受体细胞
1.导入植物细胞：
（1）花粉管通道法
花粉管通道法是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。这一技术原理可以应用于任何开花植物。
（2） 基因枪法
基因枪法，又叫粒子轰击细胞法或微弹技术。基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（如：将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，形成粘有DNA 的细微金粉、金粒或钨粒），以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用较低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。
（3）农杆菌转化法
农杆菌是指生活在植物根表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源目的基因向植物细胞的转移和整合，再通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。
2.导入动物细胞：显微注射法
显微注射法是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源目的基因直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。
将从胚胎提供者的输卵管中取得的受精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管固定住，之后注射针则依序穿过透明带、卵黄膜及雄原核膜（malepronuleus membrane），将重组 DNA 注入受精卵的原核中，可以见到原核膨大。操作时，如果显微注射针尖太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。（注：专有名词翻译有待进一步确定）
3.导入微生物：感受态细胞法
①将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。
细胞壁通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
②将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
③将转化后的细胞在选择培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
四、 目的基因的检测与鉴定
1.DNA分子杂交法（DNA探针法）
DNA分子杂交的基础：具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分子解旋成为单链，这个过程称为变性。然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链用同位素进行标记。如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区。由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出。
2.分子杂交
分子杂交其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。
3.抗原-抗体杂交
Western杂交，即蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
【典例1】基因工程步骤不包括（）
A. 对染色体进行改造 B. 目的基因与运载体结合
C. 将目的基因导入受体细胞 D. 目的基因的检测与鉴定
【典例2】在基因工程技术中，限制酶主要用于（ ）
A. 目的基因的提取和导入 B. 目的基因的导入和检测
C. 目的基因与运载体结合和导入 D. 目的基因的提取和与运载体结合
【典例3】下图表示通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中与棉花的DNA分子结合起来而发挥作用的过程示意图。正确的是( )
A. 该技术的核心内容是构建基因表达载体
B. 目的基因在抗虫棉中的遗传要遵循基因的分离定律
C. 图中Ⅰ常直接从大肠杆菌中获取
D. 剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因会影响抗虫基因的表达
【典例4】为获得抗病的马铃薯往往采用转基因技术，将相关抗病基因转移到马铃薯体内．其过程大致如图所示．下列相关叙述，正确的是（ ）
A. 图中①过程涉及两种工具酶，目的基因插入的位置为T-DNA所在的区段
B. 图中②过程，农杆菌需经镁离子溶液处理，处理后的细胞处于感受态
C. 图中③④过程，所用培养基中应添加两种激素，添加顺序对细胞的分化方向无影响
D. 检测相关抗病基因是否在受体细胞内转录，可采用抗原-抗体杂交法
考点02 PCR的基本原理
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
PCR是利用DNA在体外95°C高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪是一个温控设备，能在变性温度、复性温度、延伸温度之间很好地进行控制。一般循环25 ～ 30次，就能将目的基因扩增放大几百万倍。但循环数并不是无限增加的。一般循环数30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加。
PCR反应时需要的条件有：
（1）引物：PCR引物有两条，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。细胞内DNA复制的引物为一段RNA链。
（2）酶：TaqDNA聚合酶
（3）dNTP：四种脱氧核苷酸
（4）模板：PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。
（5）缓冲液：需要Mg2+。
PCR反应扩增出了高的拷贝数后要进行检测。琼脂糖凝胶电泳是最常用的检测手段。
琼脂糖凝胶电泳的原理：
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
琼脂糖凝胶电泳中，影响DNA分子迁移率的因素有：DNA的大小及构型、琼脂糖浓度、DNA的构象、电源电压、嵌入染料的存在、离子强度影响等。
【典例1】多聚酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如右图所示。下列关于PCR技术叙述不正确的是（）
A. PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术
B. 反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
C. PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D. 应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变
分层提分
题组A 基础过关练
单项选择题
1.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（ ）
A. 人工合成基因 B. 目的基因与运载体结合
C. 将目的基因导入受体细胞 D. 目的基因的检测和表达
2.下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A. 目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B. 限制性内切酶只在获得目的基因时才用
C. 重组质粒的形成只能在细胞内完成
D. 质粒分子上的抗性基因有利于目的基因的表达
3. 有关基因工程操作的基本步骤，正确的是（ ）。
①目的基因的检测与鉴定
②获取目的基因
③构建基因表达载体
④将目的基因导入受体细胞
A. ②④①③ B. ②③④① C. ②①③④ D. ①②④③
4.拟利用番茄表达人类凝血因子Ⅸ，操作步骤排序正确的是（ ）
①制备工程农杆菌 ②构建植物表达载体
③获取人类凝血因子Ⅸ基因 ④番茄植株中凝血因子Ⅸ基因的检测
⑤用农杆菌转化番茄植株并筛选 ⑥提取凝血因子Ⅸ并检测活性
A. ③①②⑤⑥④ B. ⑥③①②⑤④ C. ④③②①⑤⑥ D. ③②①⑤④⑥
5.基因工程第二步操作程序是（）
A. 基因表达载体的构建 B. 将目的基因导入受体细胞
C. 获取目的基因 D. 目的基因的检测与鉴定
6.科学家利用基因工程技术将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高。在培育转基因番茄的过程中，下列叙述不正确的是（）
A. 可用PCR技术或逆转录法获得抗冻蛋白基因
B. 在番茄细胞中检测到抗冻蛋白基因即证明转基因技术成功
C. 将抗冻蛋白基因与相应载体连接构建基因表达载体
D. 利用农杆菌转化法将基因表达载体导入番茄体细胞
7.利用农杆菌转化法可将抗虫基因导入大豆细胞获得抗虫植株。下列说法正确的是( )
A. 若对已知序列的抗虫基因进行大量扩增，应用PCR技术
B. 将重组的农杆菌Ti质粒喷洒到大豆伤口上，可成功转化
C. 利用害虫接种实验可从分子水平检测目的基因是否进入了大豆细胞
D. 将抗虫基因导入细胞质不可避免通过花粉传播进入其他植物
8.微生物常被用于基因工程中。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 从耐热的细菌中获取PCR所需的DNA连接酶
B. 大肠杆菌、酵母菌等是基因工程常用的载体
C. 作为载体的DNA分子需具有合成抗生素的基因
D. 常利用土壤农杆菌将目的基因导入植物细胞
9.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是 ( )
A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体
B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
C. 只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达
D. 选用的细菌为重组质粒受体细胞，是因为质粒易进入细菌细胞且繁殖快
10.下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是（ ）
A. 分子杂交技术 B. 抗原-抗体杂交
C. 抗虫或抗病的接种 D. 基因枪法
11.利用PCR技术将某小段DNA分子扩增n代，需（ ）
A. 测定DNA片段的核苷酸序列，以便设计引物对
B. 2n-1对引物参与子代DNA分子的合成
C. 向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等
D. 保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行
题组B 能力提升练
一、单项选择题
1.下列有关基因工程的叙述，正确的是（ ）
A. DNA重组技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和运载体
B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
C. 质粒是常用的运载体，存在于许多细菌以及酵母菌等生物的细胞中，是能够自主复制的很小的链状DNA分子
D. 操作的步骤包括：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
2.为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是( )
A. 用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B. 用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C. 在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D. 用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
3.基因工程为花卉育种提供了新的技术保障。如图为花卉育种的过程（字母代表相应的物质或结构，数字代表过程或方法）。下列说法正确的是（）
A. ①过程需要的酶有限制酶和DNA聚合酶
B. ②过程常用的方法是农杆菌转化法
C. ③、④过程为分化和再分化，该过程体现了植物细胞的全能性
D. 转基因生物DNA上是否插入目的基因，可用抗原—抗体杂交技术进行检测
4.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是（ ）
A. 若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B. 图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切
C. 若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用感受态的大肠杆菌
D. 在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
5.科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶主要蛋白。以下有关基因工程的叙述错误的是（）
A. 在基因工程中，PCR技术可用于任何目的基因的获取，且能迅速获得大量目的基因
B. 启动子对于目的基因在块茎中的表达是不可缺少的
C. 应用DNA探针技术，可以检测转基因马铃薯植株中目的基因的存在及其转录产物
D. 用同一种限制酶，分别处理质粒和含目的基因的DNA，可用DNA连接酶连接形成重组DNA分子
6.科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计中，不合理的是（ ）
A. 用-珠蛋白编码序列加启动子、抗四环素基因等元件来构建基因表达载体
B. 利用小鼠DNA分子通过PCR克隆出-珠蛋白基因的编码序列
C. 用含有四环素的培养基筛选出已经导入-珠蛋白编码序列的大肠杆菌
D. 用处理大肠杆菌后，将表达载体导入具有四环素抗性的大肠杆菌中
7. 番茄叶片受害虫的损伤后，叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂，抑制害虫的消化作用。人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导人玉米，以对付猎獗的玉米螟。下图为培育转基因抗虫玉米的流程图，下列叙述正确的是（）
A. 用限制性核酸内切酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因
B. 用氯化钙处理玉米受体细胞，有利于含目的基因的重组质粒导入
C. 重组Ti质粒应有DNA聚合酶识别和结合的部位，以启动蛋白酶抑制剂基因的转录
D. 若将目的基因导入二倍体玉米的花粉细胞，通过花药离体培养，再用秋水仙素处理单倍体植株，可获得稳定遗传的转基因玉米
8.下图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，有关叙述中错误的是（ ）
A. 基因工程的核心是基因表达载体的构建
B. 可以利用人的皮肤细胞来完成①过程
C. 过程②必需的酶是逆转录酶，过程③不需要用解旋酶
D. 在利用A、B获得C的过程中，可用相同的限制性核酸内切酶切割A和B，使它们产生相同的黏性末端
9.新冠疫情的快速控制，离不开政府的科学决策和我国对新冠病毒（RNA病毒）的快速检测能力。荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图）。Ct值（循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是（）
A. 检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNA
B. PCR每个循环包括变性、退火（引物和模板结合）、延伸3个阶段
C. Ct值就越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
D. 若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性
二、填空题
10.烟草是有重要经济价值双子叶植物，易受TMV（烟草花叶病毒）感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV烟草，操作流程如图。
（1）①表示遗传信息流动中的____过程，所需原料为_____。过程③所需要的工具酶是______________。
（2）大量扩增目的基因可以使用PCR技术，该技术包括变性、复性、延伸三个步骤，变性这一步骤的目的是___________________，复性的目的是________________。
（3）过程④最常用的方法是________，过程⑤用到的细胞工程技术是________。
（4）过程⑥还需要进行基因工程操作步骤中的__________，其中，在个体水平上检验获得的烟草能否抗TMV的方法是_______________________。
题组C 培优拔尖练
一、 单项选择题
1.甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二者杂交后得到F1，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种。以下对相关操作及结果的叙述，错误的是（ ）
A. 将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞
B. 通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定
C. 调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株
D. 经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体
2.在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（ ）
A. 用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞
B. 用选择培养基筛选导入目的基因的细胞
C. 用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生质体融合
D. 用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽
3.下列有关病毒在生物学和医学领域应用的叙述，错误的是（ ）
A. 灭活的病毒可用于诱导动物细胞融合
B. 用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体
C. 基因工程中常用噬菌体转化植物细胞
D. 经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防
4.用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（ ）
A. 图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B. 图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C. 泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D. 图中被酶切的DNA片段是单链DNA
5.下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A. 若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B. 抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C. 抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D. 已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
6.关于DNA的实验，叙述正确的是（ ）
A. 用兔的成熟红细胞可提取DNA
B. PCR的每个循环一般依次经过变性-延伸-复性三步
C. DNA溶液与二苯胺试剂混合，沸水浴后生成蓝色产物
D. 用甲基绿对人的口腔上皮细胞染色，细胞核呈绿色，细胞质呈红色
7.如图表示利用细菌中抗虫基因培育抗虫玉米的过程，其中①～⑧表示操作步骤，a、b表示相关分子，c～e表示培养过程，其中d过程表示细菌与玉米细胞混合培养。下列有关叙述正确的是（ ）
A. 图中需要用到限制酶的是步骤①②③
B. 图中导入目的基因的是步骤④
C. 步骤⑤的主要目的是扩增目的基因
D. 脱分化和再分化的步骤分别是⑦和⑧
8.基因工程的基本操作步骤如图所示，其中甲、乙、丙表示结构，①表示过程。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 甲、乙分别表示含有抗性基因的质粒、受体细胞
B. ①过程表示用有抗生素的培养基筛选含目的基因的受体细胞
C. 丙可以是单细胞、器官、植物或动物等
D. 若要使丙表达人的蛋白质，则乙是能分裂的人体细胞
9.如图是利用基因工程技术生产可使用疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列有关说法正确的是（ ）
A. 图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶均来自原核生物
B. 图示中构建基因表达载体时，需用到一种限制性核酸内切酶
C. 一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列
D. 抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
10.下列有关基因工程操作的叙述中，正确的是（ ）
A. 用同种限制酶切割载体与目的基因可获得相同的粘性末端
B. 检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功
C. 以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同
D. 用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接
11.质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置（插入点a、b、c），请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（）
细菌在含氨苄青霉素培养基上生长情况
细菌在含四环素
培养基上生长情况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
A. ①是c；②是b；③是c B. ①是a和b；②是a；③是b
C. ①是a和b;②是b；③是a D. ①是c；②是a；③是b
12.PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。具体过程见下图。下列对 PCR的相关叙述，正确的是（）
A. 由于PCR过程需要高温处理，因此所加解旋酶也需要耐高温
B. DNA在胞内复制时所用的引物与PCR过程中所加的引物应该相同
C. 若要得到两条链等长的DNA片段，则至少需要完成3轮复制
D. 在基因工程中，可用PCR手段对重组质粒进行大量扩增
二、填空题
13.嗜热土壤芽胞杆菌产生的β-葡萄糖苷酶（BglB）是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：
Ⅰ．利用大肠杆菌表达BglB酶
（1）PCR扩增bglB基因时，选用______基因组DNA作模板。
（2）图1为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入______和______不同限制酶的识别序列。
（3）大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为______．
Ⅱ．温度对BglB酶活性的影响
（4）据图2、3可知，80℃保温30分钟后，BglB酶会______；为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在______（单选）．
A.50℃B.60℃C.70℃D.80℃
Ⅲ．利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性
在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率。经过筛选，可获得能表达出热稳定性高的BglB酶的基因。
（5）与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽胞杆菌相比，上述育种技术获得热稳定性高的BglB酶基因的效率更高，其原因是在PCR过程中______（多选）．
A．仅针对bglB基因进行诱变 B．bglB基因产生了定向突变
C．bglB基因可快速累积突变 D．bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变．
14.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为______末端。
（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为______的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在______酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“-”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是______（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______、______。
A
B
C
无抗生素
+
+
+
氨苄青霉素
+
+
-
四环素
+
-
-
氨苄青霉素+四环素
+
-
-
（ 4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是______。
