高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序优秀ppt课件

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基因工程的基本操作程序
前体：目的基因的筛选与获取
核心：基因表达载体的构建
关键：将目的基因导入受体细胞
保证：目的基因的检测与鉴定
直接从基因文库获取利用PCR获取和扩增化学方法人工合成
目的基因、启动子、终止子、标记基因
农杆菌转化法(植物)显微注射法(动物) 感受态细胞转化法(微生物)
分子检测: 是否插入、转录、翻译个体水平: 是否具有抗性以及抗性强度等
将目的基因导入受体细胞
转化：指目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入微生物细胞
将目的基因导入受体细胞—植物细胞
花粉管通道法是我国科学家周光宇在1987年独创的。将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中。此方法直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。
操作方法：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定时间内剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
※转化思路：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA 中，通过农杆菌的转化作用，可以使目的基因进入植物细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
载体：农杆菌Ti质粒（T-DNA)
可转移的DNA,整合到受体细胞的染色体DNA上
能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞染色体DNA上
随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
将从叶片取下的圆形小片与农杆菌共培养，筛选转化细胞，再生成植株
将花序浸没在含农杆菌的溶液中，培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定
T-DNA将目的基因转移到染色体上
农杆菌转化法导入受体细胞
该过程经过 次拼接、 次导入？①第一次拼接： ；②第二次拼接： ；③第一次导入： ；④第二次导入： ；
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。常用的金属颗粒有钨粉粒子和金粉粒子。通过该方法甚至可将目的基因导入叶绿体等细胞器中。
将目的基因导入受体细胞—动物细胞
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将表达载体注入动物的受精卵中
①体积大，易操作;②全能性高，易培养成完整个体。
知识拓展其他方法:科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如：如慢病毒载体、腺病毒载体等。
将目的基因导入受体细胞—微生物细胞
受体细胞: 微生物（大肠杆菌）
优点: 繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养
原理: 增加细胞壁的通透性；使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）
利用转基因大肠杆菌生产胰岛素
真核生物基因转入原核生物可以正常表达吗，该如何解决呢 ？
不可以，真核生物的基因有内含子，原核生物没切除内含子对应的RNA序列的机制，即使获得蛋白质可能没有活性，因为没有相应内质网、高尔基体等细胞器加工可以使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
目的基因的检测与鉴定方法
RNA-DNA分子杂交
分子水平检测—核酸分子杂交技术
基因探针：用放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记与目的基因互补的特异核苷酸序列。
首先取出转基因生物的基因组DNA。
使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。
分子水平检测—PCR扩增技术
分子水平检测—抗原-抗体杂交技术
饲喂害虫（抗虫接种实验）
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
个体生物学水平的具体鉴定方法
1.下列有关基因工程中目的基因的检测与鉴定的说法错误的是( )A. 检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因用DNA分子杂交的方法B. 检测目的基因是否转录用分子杂交的方法C. 检测目的基因是否表达用抗原-抗体杂交的方法D. 目的基因的检测与鉴定是基因工程的核心步骤
2.利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。下列说法不正确的是( )A. cDNA文库的构建需要用到逆转录酶B. 图中的菌落是通过稀释涂布平板法获得的C. 核酸分子杂交的原理是碱基互补配对D. 从该文库中可以筛选到胰高血糖素基因
3. 下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答：
1）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用 限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含 的培养基上进行。
2）能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是________(填字母代号)。 A．启动子 B．tetR C．复制原点 D．ampR
3）过程①可采用的操作方法是________(填字母)。 A．农杆菌转化 B．大肠杆菌转化 C．显微注射 D．细胞融合
4）为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用 （填选项字母）技术。 A.核酸分子杂交 B.基因序列分析 C.抗原-抗体杂交 D.PCR
HindⅢ和BamHⅠ
探究·实践—DNA片段的扩增
利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：利用DNA热变性原理，通过调节温度控制DNA双连的解聚与结合。
变性：加热至90 ～ 95℃使DNA 解链
复性：冷却到 55～60 ℃，引物结合到互补DNA链
延伸：加热至70 ～75 ℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始，按5‘ → 3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。
原料： 4种脱氧核苷酸
模板： DNA片段的两条母链
原则： 碱基互补配对原则
耐高温的DNA 聚合酶（ Taq酶）
原理： DNA的半保留复制
引物：一段小分子DNA ，与模板特异性结合后，使 DNA聚合酶从引物3’ 端开始连接脱氧核苷酸
利用PCR在体外进行DNA片段扩增
PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环,复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合，因此一般在PCR实验中引物的投入量远大于产物量（但不能随意加大浓度）。
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）、PCR原料（4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水）、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖及核酸染料等。
设置好PCR仪循环程序，将微量离心管放入PCR仪中进行反应。
用微量移液器用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分
所有组分加入后，盖严离心管盖子，放入离心机离心10s，使反应液集中在管底
※可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性的目的是什么呢 ？
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
探究·实践—DNA片段的电泳鉴定
PCR扩增产物DNA片段的电泳鉴定
电泳原理：带电荷的DNA分子在电场中移动，受到琼脂糖凝胶的阻碍，移动速度和分子量成反比。
用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液
倒入模具并插入梳子形成加样孔
产物混合后注入凝胶加样孔内
接通电源，根据距离来设定电压
如图所示，该片段大小约为 bp
若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的哪一极？
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