人教版 (2019)选择性必修3二 微生物的选择培养和计数完美版课件ppt

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二、微生物的选择培养和计数
微生物的培养技术及应用
高中生物 / 人教版 / 选择性必修三/第一章第二节 第2课时
科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
高温环境（热泉、火山口）
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?
1、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。
不加有机碳源
酵母菌和霉菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)
能消除石油污染的微生物
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基， 判断依据是_________________________________； 该类培养基的主要用途为_____________________；2.从用途上来讲，培养基二属于______培养基， 目的是为了获得_____________________；3.两种培养基共有的培养基成分有：________________________； 培养基一的碳源为________，氮源为________； 培养基二的碳源为________，氮源为________。
添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%~2%
碳源、氮源、无机盐、水
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
1.原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
稀释涂布平板法实验操作视频
①在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
② 取6支试管，分别加入9ml无菌水。分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
⑤将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
各梯度分别涂布3个平板、1个不涂布作空白对照
③取0.1ml菌液（不超过 ），滴加到培养基表面
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
放入37℃恒温箱中培养1～2d
在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。
①用菌落数为30-300的平板计数。②同一稀释度至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。
（3）结果:统计的菌落往往比活菌的实际数目低?。
这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
血细胞计数板：细菌计数板：
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
稀释涂布平板法显微镜直接计数法
(统计的菌落数比活菌的实际数目少)
——活菌、死菌一起统计→偏大
(四）土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1.从土壤中如何分离出能够分解尿素的细菌？
2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
自变量：________________________因变量：__________________________无关变量：_____________________________
能分解尿素细菌的生长情况
培养时间、培养基的pH、温度等
实验组：________________________对照组：__________________________空白对照：__________________________
在以尿素为唯一N源的选择培养基上，接种菌液
在完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）上，接种菌液
空白的牛肉膏蛋白胨培养基、空白的选择培养基
检测培养基是否含有杂菌
检测选择培养基是否有筛选作用
1）取样的位置：土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培养基。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌分布距地表3∼8cm的土壤层。2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。（铁铲与信封使用前要灭菌处理）
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
制备牛肉膏蛋白胨培养基
原则：确保菌落数在30∼300之间。接种：用稀释液涂布平板。
3.样品的稀释与涂布平板
测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。
4.微生物的培养与观察
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照。
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复）,4为牛肉膏蛋白胨培养基
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）
本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记
对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊
1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
a.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。b.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入 锥形瓶中，塞好棉塞。c.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
梯度稀释和涂布平板操作
练习1：某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。以下说法错误的是(　　)A．土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶B．能分解尿素的细菌也能以尿素的分解产物CO2作为碳源C．为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时应选择尿素作为唯一氮源D．筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4的作用是提供无机盐和维持pH
练习2：通过实验测定土壤中的细菌数量，下列与此操作有关的叙述中，不正确的是(　　)A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B．取1×104、1×105倍的土壤稀释液0.1 mL，分别涂布于各组平板上C．选择菌落数在300个以上的培养皿进行计数D．将培养皿倒置，37 ℃恒温培养24～48小时