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高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序优秀课件ppt
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这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序优秀课件ppt，共60页。PPT课件主要包含了目的基因的获取，PCR技术扩增过程，★基因文库的构建，到社会中去，二材料用具，三方法步骤等内容，欢迎下载使用。
阐明基因工程的原理和基本操作程序。针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物
1、目的基因主要是指______________________
例如，与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因等。
2、获取目的基因的常用方法有哪些?
（一）人工合成（DNA合成仪）
（二）利用PCR技术扩增
（三）从基因文库中获取
（一）通过DNA合成仪用化学方法人工合成
基因DNA的核苷酸序列
当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。
1、概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。 整个过程是在体外进行，故又叫做体外DNA扩增技术。
2、PCR利用的原理是什么？
（二）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
3、方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增 循环的次数）
（2）4 种脱氧核苷酸(dNTP)
（3）热稳定DNA聚合酶(Taq酶）
（1）DNA模板( 需含有目的基因 )
引物是一段核苷酸序列，与目的基因的起始段互补。
有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
PCR扩增过程是怎样的？
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_______
b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部________。
c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，从引物的___________延伸，合成与模板互补的___________。
（三）从基因文库中直接获取（拓展）
2.按外源DNA片段的来源分类基因文库分为哪几类？
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库
3.建构基因文库的目的是什么？
为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。
4.怎样从基因文库中得到我们所需要的目的基因？
（1）基因组文库的构建
与载体连接导入受体菌群
（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）
（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成
双链DNA(cDNA)
第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
基因组文库和部分基因文库
二、基因表达载体的构建
（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出_________。（2）用_____________切断目的基因，使其产生_________________。
（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）。
基因表达载体的构建——核心
重组DNA分子（重组质粒）
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。
开阔眼界：1.原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶结合位点
启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
开阔眼界：2.真核细胞的基因结构
1、基因表达载体的组成：
2、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
三、将目的基因导入受体细胞
（一）将目的基因导入植物细胞
（二）将目的基因导入动物细胞
（三）将目的基因导入微生物细胞
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。
（1）农杆菌转化法（采用最多）
①农杆菌转化法的原理是什么？
②农杆菌转化法适用于那些植物？
1、方法：显微注射法 （采用最多；最有效）
（二）将目的基因导入动物细胞
2、操作的程序是怎样的？
1、为什么选用微生物作为受体细胞？
（三）将目的基因导入微生物细胞
3、什么是感受态细胞？用什么处理得到？
四、目的基因的检测与鉴定
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否转录出了mRNA
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。
（2）抗原—抗体杂交技术
检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
2.个体生物学水平的检测
饲喂害虫（抗虫接种实验）
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基
因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
探究·实践·DNA片段的扩增及电泳鉴定
（一）实验原理1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理：（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
1.试剂：（1）无菌水、琼脂糖；（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。（5）PCR反应体系的配方
2.用具：（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）；（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）；（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）；（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）；（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
2.DNA片段的电泳鉴定
（四）注意1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
总结: 基因工程的基本操作程序
获取目的基因人工合成利用PCR从基因文库构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞植物细胞、动物细胞、微生物细胞目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译
1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体 生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；
2、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因，如绿色荧光蛋白基因等
3、β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。
（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。
（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。
（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。
1. 下列不属于获得目的基因的方法的是 （ ） 从基因文库中获取 B. 利用人工合成法获得C. 利用PCR 技术大量获得 D.利用农杆菌转化法获得
【答案】D【解析】基因工程中获取目的基因的方法有三种：从基因文库中获取目的基因、利用PCR 技术扩增目的基因、人工合成法（包括反转录法和化学合成法）获得目的基因。
2. 聚合酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术。PCR 过程一般经历下述若干次循环： 90 ℃以上使模板DNA 解聚为单链→ 50 ℃左右下复性（引物与DNA 模板链结合）→ 72 ℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR 反应过程的叙述中，不正确的是 （ ） A. 变性过程中破坏的是DNA 分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B. 复性过程中引物与DNA 模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成C. 延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D. PCR 技术与细胞内DNA 复制相比，所需要酶的最适温度较高
【答案】C【解析】聚合酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术，相当于DNA 的大量复制。所以在形成新的DNA 过程中，所需要的原料是四种脱氧核苷酸。
A. 基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B. 基因表达载体的构建并不一定相同C. 图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位D. 抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
【答案】C【解析】由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的；启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于目的基因的上游，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
3. 下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是 （ ）
4. 下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是 （ ） A. ⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异B. ③侵染植物细胞后，重组Ti 质粒整合到④的染色体上C. ④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D. ②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA 聚合酶参与
【答案】A【解析】⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A 项正确；③侵染植物细胞后，重组Ti 质粒上的T-DNA 整合到棉花细胞的染色体上，B 项错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C 项错误； 基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA 连接酶参与，D 项错误。
【答案】C【解析】抗原—抗体杂交利用的是抗原与抗体特异性结合的原理，没有进行碱基互补配对。
5. 基因工程是在DNA 分子水平上进行设计操作的，在基因工程操作的基本步骤中，一定不进行碱基互补配对的是 （ ） A. 利用PCR 技术扩增目的基因B. 目的基因与载体的黏性末端结合C. 抗原—抗体杂交检测目的基因表达D. DNA 探针检测受体细胞的目的基因
6. 绿叶海天牛（简称甲）吸食滨海无隔藻（简称乙）后，身体就逐渐变绿，这些“夺来”的叶绿体能够在甲体内长期稳定存在，有科学家推测其原因是在甲的染色体DNA 上可能存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因。为证实上述推测，以这种变绿的甲为材料进行实验，方法和结果最能支持上述推测的是 （ ） A. 提取甲的全部DNA，通过PCR 技术能克隆出乙的编码叶绿体蛋白的核基因B. 通过核酸分子杂交技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体蛋白的核基因转录出的RNA C. 给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性D. 用乙编码叶绿体蛋白的核基因做探针与甲的染色体DNA 杂交，结果显示出杂交带
【答案】D【解析】通过PCR 技术从甲体内的DNA 中克隆出属于乙的编码叶绿体蛋白的核基因，这只能说明甲体内含有乙的编码叶绿体蛋白的核基因，但不能说明甲的染色体DNA 上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，A 项错误；通过核酸分子杂交技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体蛋白的核基因转录出的RNA，这只能说明甲体内含有乙的编码叶绿体蛋白的核基因且发生了转录，但不能说明甲的染色体DNA 上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，B 项错误； 给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性，这只能说明甲进行了光合作用，其中含有叶绿体，但不能说明甲的染色体DNA 上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，C 项错误；用乙编码叶绿体蛋白的核基因做探针与甲的染色体DNA 杂交，结果显示出杂交带，这说明甲的染色体DNA 上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因， D 项正确。
阐明基因工程的原理和基本操作程序。针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物
1、目的基因主要是指______________________
例如，与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因等。
2、获取目的基因的常用方法有哪些?
（一）人工合成（DNA合成仪）
（二）利用PCR技术扩增
（三）从基因文库中获取
（一）通过DNA合成仪用化学方法人工合成
基因DNA的核苷酸序列
当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。
1、概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。 整个过程是在体外进行，故又叫做体外DNA扩增技术。
2、PCR利用的原理是什么？
（二）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
3、方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增 循环的次数）
（2）4 种脱氧核苷酸(dNTP)
（3）热稳定DNA聚合酶(Taq酶）
（1）DNA模板( 需含有目的基因 )
引物是一段核苷酸序列，与目的基因的起始段互补。
有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
PCR扩增过程是怎样的？
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_______
b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部________。
c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，从引物的___________延伸，合成与模板互补的___________。
（三）从基因文库中直接获取（拓展）
2.按外源DNA片段的来源分类基因文库分为哪几类？
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库
3.建构基因文库的目的是什么？
为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。
4.怎样从基因文库中得到我们所需要的目的基因？
（1）基因组文库的构建
与载体连接导入受体菌群
（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）
（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成
双链DNA(cDNA)
第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
基因组文库和部分基因文库
二、基因表达载体的构建
（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出_________。（2）用_____________切断目的基因，使其产生_________________。
（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）。
基因表达载体的构建——核心
重组DNA分子（重组质粒）
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。
开阔眼界：1.原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶结合位点
启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
开阔眼界：2.真核细胞的基因结构
1、基因表达载体的组成：
2、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
三、将目的基因导入受体细胞
（一）将目的基因导入植物细胞
（二）将目的基因导入动物细胞
（三）将目的基因导入微生物细胞
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。
（1）农杆菌转化法（采用最多）
①农杆菌转化法的原理是什么？
②农杆菌转化法适用于那些植物？
1、方法：显微注射法 （采用最多；最有效）
（二）将目的基因导入动物细胞
2、操作的程序是怎样的？
1、为什么选用微生物作为受体细胞？
（三）将目的基因导入微生物细胞
3、什么是感受态细胞？用什么处理得到？
四、目的基因的检测与鉴定
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否转录出了mRNA
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。
（2）抗原—抗体杂交技术
检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
2.个体生物学水平的检测
饲喂害虫（抗虫接种实验）
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基
因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
探究·实践·DNA片段的扩增及电泳鉴定
（一）实验原理1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理：（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
1.试剂：（1）无菌水、琼脂糖；（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。（5）PCR反应体系的配方
2.用具：（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）；（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）；（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）；（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）；（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
2.DNA片段的电泳鉴定
（四）注意1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
总结: 基因工程的基本操作程序
获取目的基因人工合成利用PCR从基因文库构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞植物细胞、动物细胞、微生物细胞目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译
1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体 生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；
2、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因，如绿色荧光蛋白基因等
3、β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。
（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。
（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。
（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。
1. 下列不属于获得目的基因的方法的是 （ ） 从基因文库中获取 B. 利用人工合成法获得C. 利用PCR 技术大量获得 D.利用农杆菌转化法获得
【答案】D【解析】基因工程中获取目的基因的方法有三种：从基因文库中获取目的基因、利用PCR 技术扩增目的基因、人工合成法（包括反转录法和化学合成法）获得目的基因。
2. 聚合酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术。PCR 过程一般经历下述若干次循环： 90 ℃以上使模板DNA 解聚为单链→ 50 ℃左右下复性（引物与DNA 模板链结合）→ 72 ℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR 反应过程的叙述中，不正确的是 （ ） A. 变性过程中破坏的是DNA 分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B. 复性过程中引物与DNA 模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成C. 延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D. PCR 技术与细胞内DNA 复制相比，所需要酶的最适温度较高
【答案】C【解析】聚合酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术，相当于DNA 的大量复制。所以在形成新的DNA 过程中，所需要的原料是四种脱氧核苷酸。
A. 基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B. 基因表达载体的构建并不一定相同C. 图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位D. 抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
【答案】C【解析】由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的；启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于目的基因的上游，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
3. 下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是 （ ）
4. 下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是 （ ） A. ⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异B. ③侵染植物细胞后，重组Ti 质粒整合到④的染色体上C. ④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D. ②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA 聚合酶参与
【答案】A【解析】⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A 项正确；③侵染植物细胞后，重组Ti 质粒上的T-DNA 整合到棉花细胞的染色体上，B 项错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C 项错误； 基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA 连接酶参与，D 项错误。
【答案】C【解析】抗原—抗体杂交利用的是抗原与抗体特异性结合的原理，没有进行碱基互补配对。
5. 基因工程是在DNA 分子水平上进行设计操作的，在基因工程操作的基本步骤中，一定不进行碱基互补配对的是 （ ） A. 利用PCR 技术扩增目的基因B. 目的基因与载体的黏性末端结合C. 抗原—抗体杂交检测目的基因表达D. DNA 探针检测受体细胞的目的基因
6. 绿叶海天牛（简称甲）吸食滨海无隔藻（简称乙）后，身体就逐渐变绿，这些“夺来”的叶绿体能够在甲体内长期稳定存在，有科学家推测其原因是在甲的染色体DNA 上可能存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因。为证实上述推测，以这种变绿的甲为材料进行实验，方法和结果最能支持上述推测的是 （ ） A. 提取甲的全部DNA，通过PCR 技术能克隆出乙的编码叶绿体蛋白的核基因B. 通过核酸分子杂交技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体蛋白的核基因转录出的RNA C. 给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性D. 用乙编码叶绿体蛋白的核基因做探针与甲的染色体DNA 杂交，结果显示出杂交带
【答案】D【解析】通过PCR 技术从甲体内的DNA 中克隆出属于乙的编码叶绿体蛋白的核基因，这只能说明甲体内含有乙的编码叶绿体蛋白的核基因，但不能说明甲的染色体DNA 上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，A 项错误；通过核酸分子杂交技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体蛋白的核基因转录出的RNA，这只能说明甲体内含有乙的编码叶绿体蛋白的核基因且发生了转录，但不能说明甲的染色体DNA 上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，B 项错误； 给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性，这只能说明甲进行了光合作用，其中含有叶绿体，但不能说明甲的染色体DNA 上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，C 项错误；用乙编码叶绿体蛋白的核基因做探针与甲的染色体DNA 杂交，结果显示出杂交带，这说明甲的染色体DNA 上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因， D 项正确。
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