人教版 (2019)选择性必修3第3章 基因工程第2节 基因工程的基本操作程序教案

《基因工程的基本操作程序》教学设计

一、教学目标

（1）生命观念与实验探究 — 阐明基因工程的原理和基本操作程序，针对生活和生产需求，尝试提出利用基因工程的基本步骤或PCR技术提出解决问题的构想，并进行实验设计和制作；

（2）社会责任 — 能够基于对基因工程的原理和操作流程的认识，以理性的态度对待基因工程的研发和应用，认同我国科研工作者在基因工程领域取得的成就；面对日常生活中与基因工程相关的社会热点，基于实证运用相关生物学概念和原理进行分析讨论。

二、教学重点

   （1）基因工程基本操作程序的四个步骤。

   （2）PCR扩增目的基因。

三、教学难点

     利用PCR获取和扩增目的基因。

     目的基因检测与鉴定的方法。

四、教学过程

（一）新课导入

展示苏云金杆菌Bt蛋白抗虫机制；让同学们思考如何培育转基因抗虫棉，并试图写出大概的操作步骤。

培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：从苏云金杆菌中获取Bt基因，将Bt基因结合到载体上；将重组DNA分子导入棉花细胞，棉花表现出抗虫性状，即表明成功获得了转基因抗虫棉。

基因工程的基本操作程序的4大步骤，与转基因棉花培育操作基本相同；分为目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

（二）讲授新课

一、第一步：目的基因的筛选与获取

1.目的基因：

用于改变受体细胞性状或获取预期表达产物等的基因，这些基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。目前被广泛利用的主要是与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。为同学们举例：培育转基因抗虫棉所需要的Bt基因，以及植物的抗病毒、抗细菌基因和人的胰岛素基因等都可以是目的基因。

2、筛选合适的目的基因

（1）方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选

（2）实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家就已经知道苏云金杆菌的Bt基因和杀虫作用相关，并且科学家对Bt基因的序列信息和蛋白产物都有比较清晰的认识，因而，Bt基因就是培育转基因抗虫棉的理想目的基因。

（3）核酸序列数据库：GenBank（美国）上有许多生物的全基因组测序数据，以及一些研究清楚的基因的结构及功能注释，可以直接从中获得目的基因的序列以及它在染色体上的位置。使用序列比对工具核苷酸序列比对和蛋白质的氨基酸序列比对工具等，使科学家们掌握了越来越多的基因的结构和功能，为目的基因的筛选提供了更多的选择。

3、利用PCR获取和扩增目的基因

（1）获取目的基因的方法

   ①人工合成法：利用DNA合成仪合成序列已知、片段较小的基因

   ②从基因文库中获取：某生物基因碎片化后连在载体上导入受体菌中保存

   ③PCR扩增：提取苏云金杆菌的DNA→设计特异性引物→体外扩增Bt基因

（2）PCR简介

a.全称：聚合酶链式反应（(Polymerase Chain Reaction）

    b.原理：DNA半保留复制

    c.实质：DNA在体外的大量复制

    d. DNA复制所需条件：

   PCR引物：2种，各为一小段能与DNA母链的一段序列互补配对的短核苷酸单链，常为20-30bp。

（3）PCR过程：变性、复性、延伸

①变性：温度升高到90℃以上，DNA双链中氢键打开变为单链

②复性：温度降为50℃左右，两条引物通过碱基互补配对分别与DNA两条单链的特定部位结合（引物序列必需紧挨目的基因，两条分别位于目的基因的上下游）

③延伸：温度又升高到72℃，在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链

PCR在PCR仪中完成，一般设置30个循环，最终由1个DNA复制形成230个DNA，产生的许多Bt基因可以与载体相连。

（4）PCR扩增特点

以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）。

（5）完成PCR和DNA复制过程的比较表格

二、第二步：基因表达载体的构建（核心工作）

（1）载体的类型：基因表达载体

（2）基因表达载体的目的：

①使目的基因在受体细胞中稳定存在，遗传给下一代；

        ②使目的基因进行表达并发挥作用（转录、翻译）

（3）基因表达载体的结构

目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点

①启动子：一段特殊的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。

②终止子：基因尾端的一段特殊的DNA片段，能够阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，继而终止转录过程。

（4）基因表达载体构建过程：

用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因和载体→用DNA连接酶连接形成重组DNA分子。（不同受体细胞，基因表达载体的构建方法不同）

原则：通常用两种限制酶切割，目的：①使目的基因定向插入载体；②避免载体与载体，目的基因与目的基因之间自身连接；③避免目的基因与载体之间反向连接

三、第三步：将目的基因导入受体细胞

（1）农杆菌转化法——双子叶植物

    转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

农杆菌是一种生活在土壤中的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。农杆菌细胞内基于有Ti质粒，当它感染植物细胞后，能够将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞中，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这一特点，将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，将目的基因整合到植物细胞的基因组中，这就是农杆菌转化法。

（2）花粉管通道法——植物

     我国科学家独创的，也利用此法将Bt基因导入棉花细胞中

具体做法：

（1）微量注射器直接将DNA溶液注入子房中；（2）植物开花后一定时间，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。

    转基因结果：收获种子种下去，而不是当代就有抗虫性状。

（3）显微注射法——动物

     通过显微操作仪，将构建好的基因表达载体注入动物的受精卵中，体外培养成早期胚胎后进行胚胎移植，或者某些水生生物直接在水里发育。

为什么要注射动物受精卵细胞中呢？

因为动物受精卵细胞比较大，操作起来容易，此外受精卵的全能性比较高，容易培养出完整的动物个体。

（4）Ca2+处理法——微生物

     用原核细胞作受体细胞时，常用Ca2+处理使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将构建好的基因表达载体导入其中。

为什么主要一般使用大肠杆菌为受体细胞呢？

大肠杆菌为单细胞生物，遗传物质少，繁殖速度快，能快速完成实验需求。

四、目的基因的检测与鉴定

（1）分子水平检测

    ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因（PCR法和DNA分子杂交技术）。

    ②检测目的基因是否转录出了mRNA（PCR法和分子杂交技术）。

    ③检测目的基因是否翻译成蛋白质（抗原－抗体杂交法）

（2）个体生物学水平鉴定

     抗虫鉴定、抗病鉴定、耐盐鉴定、耐低温鉴定

五、课堂小结

六、板书设计

第2节  基因工程的基因操作程序

一、目的基因的筛选与获取

（1）目的基因：Bt基因→Bt抗虫蛋白

（2）筛选方法：已知结构和功能的基因（数据库）

（3）利用PCR获取和扩增目的基因

     原理：DNA半保留复制

     条件：模板、原料、引物、酶、缓冲液

     过程：变性、复性、延伸

二、基因表达载体的构建（核心工作）

（1）基因表达载体的结构

   ①启动子：一段特殊的DNA片段， RNA聚合酶识别和结合的部位，

             驱动基因转录。

   ②终止子：一段特殊的DNA片段，使转录终止。

（2）表达载体的构建过程

三、将目的基因导入受体细胞

（1）农杆菌转化法：植物最常用

（2）花粉管通道法：我国独创

（3）显微注射法：导入动物受精卵

（4）Ca2+处理法：导入微生物细胞

 四、目的基因的检测与鉴定

（1）分子水平检测

（2）个体生物学水平鉴定