高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序学案

第2节　基因工程的基本操作程序（第1课时） 

学习目标

1.运用系统思想解释基因工程的基本步骤和原理（生命观念）

2.结合资料和示意图阐明PCR的原理，说出PCR所需的条件及其反应过程（科学思维）

3.结合模式图说出基因表达载体的组成，并理解构建目的（生命观念、科学思维）

课前自主探究

一、目的基因的筛选与获取

1．目的基因

(1)概念：用于改变                      或获得                    等的基因。 

(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是                                   。

2．筛选合适的目的基因

(1)较为有效的方法：从相关的                 和                   的基因中进行筛选。

(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的                  ，也对Bt基因的表达产物——                                    有了较为深入的了解。

(3)认识基因结构和功能的技术方法：          技术、          数据库、       工具。

3．利用PCR获取和扩增目的基因

(1)PCR的含义：PCR是               的缩写，它是一项根据              的原理，在体外提供             的各种组分与反应条件，对                     进行大量复制的技术。

(2)原理：            

(3)条件：

（4）过程：PCR过程包括                                三步（填图）

(5)结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成               形式扩增(约为    ，其中n为              数)。

提醒：　

①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。

②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。

③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。

二、基因表达载体的构建——核心

1．构建基因表达载体的目的

(1)使目的基因在受体细胞中                      ，并且可以            给下一代。

(2)使目的基因能够                       和发挥作用。

2．基因表达载体的组成[填图]

3．构建过程[填图]

易错易混辨析：

1.目的基因就是指编码蛋白质的基因(　 　)

2.从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。（ ）               (√)

3.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(　 　)

4.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物(　 　)

5．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。（  ）6．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。              (   )

课堂合作探究

探究一　PCR技术相关分析

【情境探究】根据PCR技术的过程，思考回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增目的基因需要提供哪些条件？

(2)什么是引物？PCR过程中为什么需要引物？

（3）PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补？说明理由。

（4）如果在某基因组定位了一个目的基因X,但是其核苷酸序列未知，现已知X邻近区域的上、下游的部分DNA序列，此时如何设计引物？

（5）若PCR过程中加入模板DNA片段a个，经过n次复制后，产生的DNA片段中含有模板DNA片段a的DNA个数为多少？试分析原因。

(6)某同学认为PCR过程不同的DNA片段变性时温度是不同的，你认为他的说法正确吗？说明你的理由。

(7)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，可能导致PCR得不到任何扩增产物。复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。

(8)一个目的基因（DNA)分子在第3次扩增时，需要几种引物？需要几个引物？

(9)PCR技术扩增目的基因实际上是在体外模拟DNA复制过程。请从酶的角度分析PCR技术扩增DNA与DNA体内复制的不同点。

(10)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？

【归纳总结】

1.PCR技术和DNA复制的比较

2.PCR中与引物有关的易错点

(1)设计引物的依据通常是目的基因两端的核苷酸序列。

(2)用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。若引物长度过短，则引物与模板链结合的特异性较差。

(3)两种引物需符合以下要求，否则引物失效，得不到扩增产物。

①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对，否则会导致自身折叠；

②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物自连。

(4)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5端加上限制酶的酶切位点，且常在两种引物设计上加入不同的酶切位点，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接。

3.PCR过程模型

注意：

(1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。

(2)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。

4.PCR中的数量关系

探究二.基因表达载体的构建

【情境探究】请据图思考回答下列问题：

(1)为什么必须构建基因表达载体？

(2)假设图中利用同一种限制酶切割质粒和外源DNA片段，分别产生几个黏性末端？

(3)构建基因表达载体时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体，请分析原因。

（4）作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？

（5）构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？

（6）启动子是起始密码子吗？终止子是终止密码子吗？请说明理由。（科学思维）

【归纳总结】

1.真核细胞的基因结构

(1)结构：①编码区：内含子、外显子；②非编码区：启动子、终止子。基因结构如下图所示：

(2)表达：只有编码区能转录生成RNA,内含子转录生成的部分要剪切掉，即转录生成的mRNA只有外显子的对应部分。因此，以mRNA为模板，逆转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。

2．基因表达载体构建过程

如果用同一种限制酶切割，若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。

3.基因表达载体的组成

提醒　启动子≠起始密码子　终止子≠终止密码子

①启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。

②起始密码子和终止密码子均位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止

4.限制酶的选择方法

根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。

(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用Pst Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。

(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。

课前自主探究答案

一、目的基因的筛选与获取

1.（1）受体细胞性状  预期表达产物 （2）Bt抗虫蛋白基因

2.（1）已知结构  功能清晰  （2）序列信息  Bt抗虫蛋白  （3）测序 序列  序列比对 

3.（1）聚合酶链式反应  DNA半保留复制  参与DNA复制  目的基因的核苷酸序列

(2)DNA半保留复制

（3）条件：

（4）  变性、复性和延伸    

（5）指数    2n   扩增循环次

二、基因表达载体的构建

1.（1）稳定存在  遗传  （2）表达

2.

 3.

易错易混辨析：× √ √ √  ××

  课堂合作探究

探究一　(1)利用PCR技术扩增目的基因需要提供哪些条件？

提示：(1)需要模板、酶、原料、引物以及适宜的温度和pH等条件。即以DNA两条链为模板，在耐高温的DNA聚合酶的作用下，4种脱氧核苷酸（A、T、C、G)作为合成子链的原料，从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。反应过程中，缓冲溶液维持反应的pH,并保证变性、复性和延伸需要的适宜温度。

(2)什么是引物？PCR过程中为什么需要引物？

提示：（2)引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。

（3）PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补？说明理由。

提示：（3）不能。因为两种引物分别与两个DNA单链的3端互补结合，而DNA的两条单链的3端碱基序列往往不同，如果2种引物的碱基序列互补那么会影响引物与DNA单链的结合。

（4）如果在某基因组定位了一个目的基因X,但是其核苷酸序列未知，现已知X邻近区域的上、下游的部分DNA序列，此时如何设计引物？

提示：（4）虽然目的基因X的核苷酸序列未知，但X临近区域的上、下游的部分DNA序列已知，因此可根据X临近区域的上、下游已知序列设计引物。

（5）若PCR过程中加入模板DNA片段a个，经过n次复制后，产生的DNA片段中含有模板DNA片段a的DNA个数为多少？试分析原因。

提示：（5）2a个。因为DNA是半保留复制，一开始的模板链最终分布在子代DNA分子中。

(6)某同学认为PCR过程不同的DNA片段变性时温度是不同的，你认为他的说法正确吗？说明你的理由。

提示：（6）正确。变性目的是通过升高温度破坏氢键，将DNA分子双链变成单链，不同片段的DNA分子中氢键的数量不同导致稳定性不同，因此所需的温度不同。

(7)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，可能导致PCR得不到任何扩增产物。复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。

提示：（7）在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。

(8)一个目的基因（DNA)分子在第3次扩增时，需要几种引物？需要几个引物？

提示：（8)一个目的基因（DNA)分子在第3次扩增时，需要2种引物；第三轮是在第二轮的基础上进行的，第二轮得到四个DNA分子，共八条链，因此需要8个引物。

(9)PCR技术扩增目的基因实际上是在体外模拟DNA复制过程。请从酶的角度分析PCR技术扩增DNA与DNA体内复制的不同点。

提示：（9)①PCR技术扩增DNA不需要解旋酶；②PCR技术需要的DNA聚合酶应具有耐高温性。

(10)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？

提示：（10)第3轮，如图

探究二.(1)为什么必须构建基因表达载体？

提示：(1)构建的基因表达载体中包含复制原点、启动子、终止子等结构，可以控制目的基因的复制、转录等过程，目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达，因此不能直接把目的基因导入受体细胞，必须构建基因表达载体。

(2)假设图中利用同一种限制酶切割质粒和外源DNA片段，分别产生几个黏性末端？

提示：(2)由图示可知，用同一种限制酶切割质粒，产生一个切口，两个黏性末端；切割外源DNA片段需要在目的基因两侧分别切割，因此产生两个切口，四个黏性末端。

(3)构建基因表达载体时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体，请分析原因。

提示：（3)如果用一种限制酶切割，目的基因两侧的末端以及载体切口的两个末端都是互补的，因此连接时可能会出现载体与载体、目的基因与目的基因、目的基因与载体三种连接情况，而符合要求的只有载体与目的基因的连接。

（4）作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？

提示：（4).不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达开发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子等。

（5）构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？

提示：（5）启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。

（6）启动子是起始密码子吗？终止子是终止密码子吗？请说明理由。（科学思维）

提示：（6)启动子不是起始密码子，终止子也不是终止密码子。启动子和终止子是分别位于基因上游和下游的特殊DNA序列，作用分别是启动和终止转录；而起始密码子和终止密码子分别是mRNA上决定翻译开始和结束的三个相邻碱基。