2021学年第2节 基因工程的基本操作程序集体备课课件ppt

这是一份2021学年第2节 基因工程的基本操作程序集体备课课件ppt，共37页。PPT课件主要包含了受热变性，解为单链，单链DNA，DNA聚合酶，引物的3’端，脱氧核苷酸，双链DNA解聚为单链，耐高温的DNA聚合酶，耐高温的DNA聚合，稳定存在等内容，欢迎下载使用。

第2节 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序：
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建（核心）
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
目的基因DNA__________后__________，______与单链相应互补序列结合；然后以___________为模板在____________作用下进行_____，即将4种____________加到__________________，如此重复循环多次。
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
一.目的基因的筛选与获取
变性：加热至 以上，___________________________ 复性：冷却至 ℃左右，引物与单链DNA结合；延伸：加热至 左右， 酶从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环多次。
利用PCR获取和扩增目的基因条件
①____：DNA的两条链。②____：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。③原料：A、T、G、C四种__________。④酶：______ _______ _酶。⑤其他条件：需要一定的__ __溶液和能严格控制温度的温控设备。
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，即成_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
第二步——基因表达载体的构建(核心步骤)
基因表达载体的构建这一步是基因工程的核心工作
2.基因表达载体的作用:
让目的基因在受体细胞中 ，并且 给下一代，同时，使目的基因能够 。
3.基因表达载体的组成*
（若需要能完成自主复制，还应有复制原点）
特殊类型：诱导型启动子；诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达
便于重组DNA分子的检测和筛选
RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因的转录
常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等
mRNA上三个相邻碱基
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起点（编码氨基酸）
翻译的结束（一般不编码氨基酸）
4.基因表达载体的构建过程
在构建抗虫棉的基因表达载体时,首先会用一定的限制酶切割载体,使它出现　 切口，　　个末端;
在构建抗虫棉的基因表达载体时,首先会用一定的限制酶切割载体,使它出现　　　切口，　　个末端;
再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处,这样就形成了一个重组DNA分子
用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
①用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，形成的“载体-目的基因”产物一定符合要求吗？
不一定，目的基因可能反向连接到质粒上
同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体（使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同）
同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体的优点是：
使目的基因定向插入表达载体，避免目的基因环化或反向连接到表达载体上。
③将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？
这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
*此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组；
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入微生物细胞
一、将目的基因导入植物细胞
花粉管通道法和农杆菌转化法。
花粉落到柱头上以后，在柱头上黏液的刺激下开始萌发，长出花粉管。花粉管穿过花柱，进入子房，一直达到胚珠，花粉管中的精子随花粉管的伸长而向下移动，最终进入胚珠内部，胚珠里面有卵细胞，它跟来自花粉管的精子结合，形成受精卵
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊；
操作简便；直接将目的基因导入卵细胞、合子或早期胚胎细胞，无须组织培养即可获得植株。
将Bt基因导入棉花细胞
（二）将目的基因导入植物细胞常用的方法——农杆菌转化法
①能在自然条件下侵染 植物和 植物，而对 植物没有侵染能力；
②农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将 上的 （可转移的DNA） 到被侵染的细胞，并且将其 ；
整合到该细胞的染色体DNA上
2.农杆菌转化法的实验思路（过程）*
第一次拼接是将 拼接到 上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的 上;
农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入 ,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入 。
3.农杆菌转化法的具体操作
①可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片(即 ）与 ，然后筛选转化细胞，并 ；
②可以将 直接浸没在含有 的溶液中一段时间，然后培养植株并获得 ，再进行 等；
【说明】随着转化方法的突破，利用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
二、将目的基因导入动物细胞
受精卵容易表现出全能性
利用显微注射将表达载体注入动物的受精卵中
三、将目的基因导入微生物细胞
常用 作为受体细胞，其中以 最广泛
繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养
能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
3.Ca2+处理法的一般过程
一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
再将重组的基因表达载体导入其中
第四步：目的基因的检测与鉴定
2.目的基因的检测与鉴定方法
1.转基因生物是否培育成功：
需要检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
目的基因是否翻译成蛋白质
目的基因是否转录出了mRNA
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
基本思路：1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）2、提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
DNA分子杂交检测目的基因的原理是什么？
杂交DNA分子（可检测）
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增和分子杂交技术
基本思路：1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）2、提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液。或先将RNA逆转录为cDNA，再与基因探针置于同一培养液。3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
分子杂交检测目的基因的原理是什么？
方法：抗原-抗体杂交技术
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
检测内容及方法----分子检测
表达产物是否具有生物学活性（个体是否具有相应性状）
抗性测定、个体性状测定等
通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
饲喂害虫（抗虫接种实验）
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
基因工程的基本操作程序
1.（不定向选择）研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的T质粒上,然后用它侵染番茄细胞,获得了抗冻的番茄品种。下列相关表述不正确的是（　　）A.afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因B.构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶DNA连接酶和核酸酶 C.只要检测出番茄细胞中含有afp基因,就代表抗冻番茄培育成功D.应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达
二、拓展应用2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。