高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序教案配套课件ppt

这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序教案配套课件ppt，共60页。PPT课件主要包含了内容索引，自主预习新知导学，合作探究释疑解惑，课堂小结，课标定位，素养阐释，3过程，方法步骤，问题引领，归纳提升等内容，欢迎下载使用。

1.通过对相关实例的分析归纳和对教材内容的梳理,能说出获取目的基因常用的方法和技术操作。2.通过图解分析,能初步认识基因表达载体的组成及构建的必要性。3.通过实例分析及对其他材料的研读,认识导入目的基因的一般方法、检测和鉴定目的基因的不同层次。4.概述PCR反应的原理,尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
1.结合基因工程的基本操作程序,理解“基因工程赋予生物新的遗传特性”这一生命观念。2.进行DNA片段的扩增及电泳鉴定,感悟科学技术的进步,提升科学探究能力。3.通过对PCR的学习,具备利用PCR技术解决生活中实际问题的能力。
一、目的基因的筛选与获取1.目的基因(1)概念:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。目的基因主要是指编码蛋白质的基因。(2)培育转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因,简称Bt基因。2.筛选合适的目的基因有效方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
3.利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR原理:根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。(2)组分和条件:缓冲液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶,同时要控制温度。
(3)过程变性:当温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链↓复性:当温度下降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 ↓延伸:当温度上升到72 ℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 (4)方式:成指数形式扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数)。
二、基因表达载体的构建1.基因表达载体的功能使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成
三、将目的基因导入受体细胞1.花粉管通道法花粉管通道法有多种操作方式。例如,可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中;可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。2.农杆菌转化法(1)转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)农杆菌的特点:在自然条件下能侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
3.将目的基因导入动物细胞和微生物细胞的方法:将目的基因导入动物细胞最常用的方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中;将目的基因导入大肠杆菌细胞一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。
四、目的基因的检测与鉴定1.检测与鉴定的目的:判断目的基因进入受体细胞后,是否稳定维持和 表达其遗传特性。2.检测方法(1)分子水平的检测:通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA;用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白。 (2)个体生物学水平的鉴定,如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定1.原理:(1)PCR利用了DNA的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。(2)DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
【预习检测】 1.判断正误。(1)Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。(　　)(2)基因表达载体中含有启动子和终止密码。(　　)(3)目的基因导入马铃薯细胞后,随着马铃薯DNA分子的复制而复制,传给子代细胞并表达。(　　)(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质,常用抗原—抗体杂交技术。(　　)(5)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术。(　　)(6)农杆菌转化法利用了Ti质粒的T-DNA可以转移的特点。(　　)(7)基因表达载体只包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。(　　)(8)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。(　　)
2.下列哪项不是PCR所必需的?(　　)A.DNA聚合酶　B.引物C.解旋酶D.四种脱氧核苷酸答案:C解析:DNA在细胞外解旋时不需要解旋酶。
3.(不定项选择题)下列关于目的DNA片段体外扩增的叙述,正确的是(　　)A.需要向离心管中加入引物、反应物、模板、Mg2+、DNA聚合酶、反应缓冲液等B.DNA聚合酶需要耐高温,引物只需一种,反应物是四种脱氧核苷酸C.扩增DNA的反应程序是变性→延伸→复性D.可以使用琼脂糖凝胶电泳法对PCR结果进行分析答案:AD4.下列哪项不是基因表达载体的组成成分?(　　)A.启动子B.终止密码C.标记基因 D.复制原点答案:B
5.在基因表达载体的构建中,所需要的酶是(　　)①限制酶　②DNA连接酶　③解旋酶　④DNA聚合酶A.①②　B.①②③　C.①②④　D.①②③④答案:A6.下列不属于目的基因与载体结合过程的是(　　)A.用一定的限制酶切割质粒,露出黏性末端B.用同种限制酶切割目的基因,露出黏性末端C.将切下的目的基因插入到质粒的切口处D.将重组DNA引入受体细胞中进行扩增答案:D
知识点一　目的基因的筛选与获取
围绕转基因抗虫棉的培育这个案例,阅读教科书第76~79页内容,思考并讨论下列问题。(1)在该项目中,目的基因是什么?根据什么筛选目的基因?提示:培育转基因抗虫棉的目的基因是来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因,简称Bt基因。筛选Bt基因的依据:Bt基因的序列信息及Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白等。还可以借助测序技术、序列比对工具以及序列数据库等。
(2)在PCR技术中,为什么不直接加入解旋酶对DNA进行解旋?为什么要求所加入的DNA聚合酶具有耐高温的特性?子链的合成为什么需要引物?提示:DNA解旋酶既可以打开双链模板DNA,又可以打开模板DNA与引物结合的部分,会导致复制与解旋不断地重复,达不到扩增效果。因此,PCR反应中利用高温代替解旋酶使DNA解旋。PCR反应需要高温变性,因此需要耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶只能将单个的脱氧核苷酸连接到已有的短单链核酸上,因此需要一段已知序列的短单链核酸作为引物。(3)PCR扩增目的基因是获得目的基因的唯一方法吗?你还能说出什么方法?提示:不是。还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
1.目的基因的筛选是根据基因的有关信息,包括基因的核苷酸序列、基因的位置、基因的表达产物等,借助测序技术、序列比对工具以及序列数据库的辅助进行筛选。
2.PCR的相关知识(1)原理:DNA半保留复制。(2)过程第一步:变性,加热至 90 ℃以上,DNA解链为单链。第二步:复性,冷却到50 ℃左右,引物与两条单链DNA结合。第三步:延伸,加热至 72 ℃左右,热稳定DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成。(3)特点:以指数形式扩增。(4)条件:缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等。
特别提醒 (1)Taq酶是一种能耐高温的DNA聚合酶,能在高温条件下催化DNA复制。(2)引物是依据目的基因的已知序列合成的短单链核酸,在复性过程中与相应模板链结合。2条子链在引物的基础上延伸,方向相反。目的基因的2条链碱基序列不同,因此需要合成2种引物。
3.细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)的比较
基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是　　　　　,在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是　　　　　　　　　　。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的　　　　。 (2)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是  　。 答案:(1)解旋酶　加热至90 ℃以上　氢键(2)Taq酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析:(1)体内DNA复制时,需用解旋酶破坏氢键使双链DNA解旋,而利用PCR技术扩增目的基因时,是借助高温加热至90 ℃以上使DNA变性。(2)PCR反应体系中进行互补链的合成时,温度需控制在72 ℃左右,则应使用耐高温的DNA聚合酶,即Taq酶,而不能使用大肠杆菌DNA聚合酶(高温下会失活)。
【变式训练】 利用PCR技术可获得目的基因,下列相关叙述正确的是(　　)A.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似B.PCR反应体系中需添加磷酸、脱氧核糖和含氮的碱基作为原料C.PCR反应体系中需要添加从受体细胞中提取的解旋酶和DNA聚合酶D.在PCR过程中,温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应答案:A
解析:在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似。PCR反应体系中需添加脱氧核糖核苷酸作为原料。PCR是通过高温使DNA分子中的氢键断裂的,不需要加入解旋酶,需要加入热稳定的DNA聚合酶。在PCR过程中,温度的周期性改变是为了使DNA变性、复性、延伸,而不是为了使DNA聚合酶催化不同的反应。
知识点二　基因表达载体的构建
(1)为什么要构建基因表达载体?提示:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体中的启动子、终止子、标记基因各有什么作用?提示:启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。终止子位于基因的下游,是一段有特殊序列结构的DNA片段,使转录在所需要的地方停下来。标记基因便于重组DNA分子的筛选。
(3)怎样构建基因表达载体?请以抗虫棉基因表达载体的构建为例进行说明。提示:在构建抗虫棉的基因表达载体时,首先会用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口;然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段;再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处,这样就形成了一个重组DNA分子。
1.基因表达载体的构建过程
2.注意的问题(1)载体与表达载体的区别:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。(2)用到的工具酶:既用到限制酶切割载体,又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接,两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。(3)启动子、终止子对于目的基因的表达必不可少。(4)目的基因不能单独进入受体细胞,必须以表达载体的方式进去。(5)切割载体的限制酶与切割目的基因的限制酶必须产生相同的黏性末端,以便DNA连接酶将其连接,可以用同一种限制酶,也可以用不同的限制酶。
(6)目的基因的插入位点不是随意的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插到启动子与终止子之间的部位。目的基因的插入不能破坏标记基因。(7)将切开的载体与切开的目的基因混合,加入DNA连接酶后,会出现多种连接方式,如载体与载体连接、目的基因与目的基因连接、载体与目的基因连接等。
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,最好使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。①所选限制酶与切割目的基因的限制酶产生的黏性末端要相同。②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因;如果所选酶的切割位点不止一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
图1中的三个DNA片段上依次表示出了EcR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点,图2为某种表达载体的示意图(载体上的EcR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识,回答下列问题。(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被　　　酶切后的产物连接,理由是　  　。 (2)若某人利用图2所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图3所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有　　　　　,不能表达的原因是　   　。 
答案:(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录解析:(1)由图1可知,尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别位点不相同,但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端,故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与图2中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用,甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游,故这两个载体上的目的基因都不能被转录和翻译。
【变式训练】 1.下列有关基因工程中载体的说法,错误的是(　　)A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B.任何基因表达载体的构建都是一样的,没有差别C.启动子位于基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因答案:B
2.下列关于构建基因表达载体的叙述,错误的是(　　)A.需要限制酶和DNA连接酶B.抗生素抗性基因可作为标记基因C.终止子使转录在需要的地方停止D.启动子位于目的基因的首端,是启动翻译的一段DNA答案:D解析:基因表达载体的构建需要启动子和终止子,启动子启动转录,终止子使转录在所需要的地方停止。
知识点三　将目的基因导入受体细胞
在基因工程中,哪些细胞可以作为受体细胞?提示:培育转基因植物时,受体细胞可以是受精卵,也可以是植物的体细胞,因为植物体细胞具有较强的全能性;培育转基因动物时,常常以受精卵作为受体细胞;培育转基因微生物时,以微生物细胞作为受体细胞。
将目的基因导入受体细胞的几种方法的比较
下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图,下列叙述错误的是(　　)A.①→②利用两种不同限制酶处理,能避免抗虫基因的DNA片段自身环化B.②→③可用氯化钙处理农杆菌,有助于促进重组Ti质粒转入农杆菌细胞中C.③→④用农杆菌侵染植物细胞,重组Ti质粒整合到植物细胞的染色体上D.④→⑤用植物组织培养技术培养,具有抗虫性状的植株产生了可遗传变异答案:C
解析:③→④用农杆菌侵染植物细胞,重组Ti质粒的T-DNA片段整合到植物细胞的染色体上。
【变式训练】 1.农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后,目的基因插入的位置是(　　)A.Ti质粒上　　B.受体细胞染色体DNA上C.T-DNAD.农杆菌的拟核答案:B
2.(不定项选择题)下图是将人的生长激素基因导入细菌B制造的“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A,也不含质粒A上的基因。下列说法正确的是(　　)A.将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法B.将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上,能生长的包括导入了重组质粒的细菌和导入了质粒A的细菌C.将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上,能生长的只是导入了质粒A的细菌D.该过程选用的受体细胞可以是含质粒A的细菌答案:BC
解析:将目的基因导入细菌时,常用Ca2+处理细菌,使之处于感受态,从而能够吸收重组质粒。由于重组质粒中氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,所以在含有氨苄青霉素的培养基上生长的是导入了质粒A的细菌和导入了重组质粒的细菌。由于重组质粒中四环素抗性基因被破坏,所以能在含有四环素的培养基上生长的只是导入了质粒A的细菌。重组质粒以氨苄青霉素抗性基因作为标记基因,因此受体细胞内不能含氨苄青霉素抗性基因,否则,就不能完成筛选和鉴定。
知识点四　目的基因的检测与鉴定
1.完成第三步操作后,是否意味着目的基因一定成功导入了受体细胞?是否意味着转基因生物就一定培育成功?为什么?提示:不一定。目的基因进入受体细胞后是否能稳定存在、是否能传递给下一代、是否能表达和发挥作用,只有通过检测与鉴定才能知道。2.目的基因的检测与鉴定可从哪几个水平进行?提示:(1)分子水平的检测:通过PCR等技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA;从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。(2)个体生物学水平的检测。
目的基因检测的必要性:目的基因成功导入受体细胞后,不一定在受体细胞稳定存在、不一定遗传给下一代、不一定表达和发挥作用,因此需要做目的基因的检测与鉴定。首先是分子水平的检测,包括检测目的基因是否插入到受体细胞的染色体DNA上,常借助PCR等技术;检测目的基因是否转录出mRNA;检测目的基因是否翻译出蛋白质,采用抗原—抗体杂交技术。其次,进行个体生物学水平的鉴定。包括抗虫、抗病的接种实验,以确定是否有抗性以及抗性的程度;基因工程产品与天然产品的活性比较,以确定功能是否相同等。
(不定项选择题)在培育转基因植物的研究中,卡那霉素抗性基因(kanr)常作为标记基因,只有含卡那霉素抗性基因的细胞和组织才能在含卡那霉素的培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。下列有关叙述正确的是(　　)A.①过程需要的酶有限制性内切核酸酶和DNA连接酶B.②过程需要加入卡那霉素进行选择培养C.④过程可以采用一定的技术进行分子水平的检测　D.④过程可以用虫感染植株进行个体水平的检测答案:ABCD
解析:①过程构建基因表达载体,需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶;②过程需要借助标记基因的功能进行筛选,由于以卡那霉素抗性基因作为标记基因,所以需要在培养基中加卡那霉素;④过程对目的基因的检测和鉴定,既可在分子水平上进行,也可在个体水平上进行。
【变式训练】 1.下列目的基因的检测与鉴定方法,从个体水平上进行的是(　　)A.检测受体细胞染色体上是否有目的基因B.检测受体细胞细胞质中是否有与目的基因互补配对的RNAC.抗原—抗体杂交技术D.抗虫接种实验答案:D
2.下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述,错误的是(　　)A.目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入质DNA中B.检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录的方法都是分子水平的检测C.目的基因进入受体细胞后,经分子水平检测后,还需要进行个体生物学水平的鉴定D.如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质,可确定目的基因首端含有启动子答案:A解析:目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入染色体DNA中。