还剩52页未读，
继续阅读
成套系列资料，整套一键下载
生物人教版 (2019)第2节 基因工程的基本操作程序精品课件ppt
展开
这是一份生物人教版 (2019)第2节 基因工程的基本操作程序精品课件ppt，共60页。PPT课件主要包含了PCR，DNA半保留复制，DNA体外复制，DNA母链，解旋酶，单链RNA，单链DNA，种脱氧核苷酸，DNA聚合酶，耐高温DNA聚合酶等内容，欢迎下载使用。
Basic perating prcedures fr genetic engineering
DNA片段的扩增与鉴定
DNA片段的PCR扩增
PCR amplificatin f DNA fragments
根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
解开螺旋形成的两条单链
断开氢键打开DNA双链
利用水解ATP获得能量
调节温度控制DNA解聚与结合
使用DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
能与DNA母链的一段碱基序列互补配对
Mg2+激活DNA聚合酶
维持反应体系的pHMg2+激活DNA聚合酶
温度上升到90℃以上，双链DNA解旋为单链
温度下降到50℃左右，两种引物与两条单链DNA结合
温度上升到72℃左右，缓冲液中的脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的催化作用下合成新的DNA链
DNA数量以指数方式增加
至少扩增3次获得目的基因
思考：PCR技术最终哪部分被大量复制了
成对的引物应位于目的基因两侧
引物自身不应存在互补序列等
引物之间不应存在互补序列等
防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合
引物类似于书签，指示聚合酶从特定位置开始复制，从而仅对DNA上的特定片段进行扩增
思考：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子
核酸（DNA或RNA）检测
①模板: 需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料: 以四种脱氧核苷酸为原料③酶: 需要DNA聚合酶④引物: 使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
解旋酶、DNA聚合酶等
控制温度需在不同温度下进行
1. 判断(1) PCR要根据目的基因全部的核苷酸序列设计引物 ( )(2) PCR除需要耐热的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板外，还需要引物等基本条件。 （ ）(3) DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链 （ ）(4) 高温变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键（ ）(5) PCR复性的目的是使原来分开的DNA的两条单链重新连接成双链（ ）(6) PCR 过程中只需要两个引物分子（ ）
2. 利用 PCR 技术扩增目的基因，其原理与细胞内 DNA 复制类似（如图所示）。图中引物为单链 DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是 ( )
A. 由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物A或引物BB. 第四轮循环产物中同时含有引物 A 和引物 B 的 DNA 片段所占的比例为1/8C. 复性温度过高可能导致 PCR 反应得不到任何扩增产物D. 设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
3. X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有( )
A. 8个 B. 6个 C. 4个 D. 2个
4. 在表达融合蛋白时可以利用融合PCR技术把两个不同的基因片段连接起来，其原理如图所示，下列分析正确的是（ ）A.该过程使用的引物P2和P3的碱基完全互补配对，所以不能放在一个 系统中工作B.融合PCR的第一步需要加入耐高温DNA聚合酶、DNA连接酶等C.融合PCR的第一步是不需要引物的，可能是因为两条链重叠的部位互为另一条链的引物D.若融合PCR的第二步获得了64个融合基因，则该过程消耗了128个引物
DNA fragment identificatin
在电场作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程称为电泳
在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷
DNA分子具有可解离的基团
凝胶中DNA分子的迁移速率
DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
低浓度用来进行大片段DNA电泳高浓度用来进行小片段DNA电泳
根据分离DNA片段大小配制琼脂糖溶液深度
在紫外光下发荧光，其荧光强度与DNA分子含量成正比
A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
电泳前将DNA溶液由加样孔加入
C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
维持电泳时PH，并使溶液具有一定导电性，利于核酸迁移
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
增加PCR产物溶液密度，帮助样品沉降到点样孔的底部
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套
⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
1.下列关于DNA糖凝胶电泳表述正确的是 （ ）A.凝胶融化时一定要充分加热，使凝胶溶液沸腾一会儿再停止加热，并立刻倒入制胶槽B.因上样缓冲液中含有指示剂，凝胶电泳后可直接观察到DNA条带C.不同长度的线性DNA分子具有不同的电泳迁移率D.长度相同的DNA分子电泳迁移率一致
2. 在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶（R1和R2）处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是（ ）
A.该载体最可能为环形DNA分子B.两种限制酶在载体上识别的序列可能相同C.限制酶R1与R2的切点最短相距约200bpD.限制酶作用位点会导致磷酸二酯键断裂
Basic perating prcedures fr genetic engineering
DNA片段的扩增与鉴定
DNA片段的PCR扩增
PCR amplificatin f DNA fragments
根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
解开螺旋形成的两条单链
断开氢键打开DNA双链
利用水解ATP获得能量
调节温度控制DNA解聚与结合
使用DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
能与DNA母链的一段碱基序列互补配对
Mg2+激活DNA聚合酶
维持反应体系的pHMg2+激活DNA聚合酶
温度上升到90℃以上，双链DNA解旋为单链
温度下降到50℃左右，两种引物与两条单链DNA结合
温度上升到72℃左右，缓冲液中的脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的催化作用下合成新的DNA链
DNA数量以指数方式增加
至少扩增3次获得目的基因
思考：PCR技术最终哪部分被大量复制了
成对的引物应位于目的基因两侧
引物自身不应存在互补序列等
引物之间不应存在互补序列等
防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合
引物类似于书签，指示聚合酶从特定位置开始复制，从而仅对DNA上的特定片段进行扩增
思考：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子
核酸（DNA或RNA）检测
①模板: 需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料: 以四种脱氧核苷酸为原料③酶: 需要DNA聚合酶④引物: 使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
解旋酶、DNA聚合酶等
控制温度需在不同温度下进行
1. 判断(1) PCR要根据目的基因全部的核苷酸序列设计引物 ( )(2) PCR除需要耐热的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板外，还需要引物等基本条件。 （ ）(3) DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链 （ ）(4) 高温变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键（ ）(5) PCR复性的目的是使原来分开的DNA的两条单链重新连接成双链（ ）(6) PCR 过程中只需要两个引物分子（ ）
2. 利用 PCR 技术扩增目的基因，其原理与细胞内 DNA 复制类似（如图所示）。图中引物为单链 DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是 ( )
A. 由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物A或引物BB. 第四轮循环产物中同时含有引物 A 和引物 B 的 DNA 片段所占的比例为1/8C. 复性温度过高可能导致 PCR 反应得不到任何扩增产物D. 设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
3. X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有( )
A. 8个 B. 6个 C. 4个 D. 2个
4. 在表达融合蛋白时可以利用融合PCR技术把两个不同的基因片段连接起来，其原理如图所示，下列分析正确的是（ ）A.该过程使用的引物P2和P3的碱基完全互补配对，所以不能放在一个 系统中工作B.融合PCR的第一步需要加入耐高温DNA聚合酶、DNA连接酶等C.融合PCR的第一步是不需要引物的，可能是因为两条链重叠的部位互为另一条链的引物D.若融合PCR的第二步获得了64个融合基因，则该过程消耗了128个引物
DNA fragment identificatin
在电场作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程称为电泳
在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷
DNA分子具有可解离的基团
凝胶中DNA分子的迁移速率
DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
低浓度用来进行大片段DNA电泳高浓度用来进行小片段DNA电泳
根据分离DNA片段大小配制琼脂糖溶液深度
在紫外光下发荧光，其荧光强度与DNA分子含量成正比
A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
电泳前将DNA溶液由加样孔加入
C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
维持电泳时PH，并使溶液具有一定导电性，利于核酸迁移
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
增加PCR产物溶液密度，帮助样品沉降到点样孔的底部
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套
⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
1.下列关于DNA糖凝胶电泳表述正确的是 （ ）A.凝胶融化时一定要充分加热，使凝胶溶液沸腾一会儿再停止加热，并立刻倒入制胶槽B.因上样缓冲液中含有指示剂，凝胶电泳后可直接观察到DNA条带C.不同长度的线性DNA分子具有不同的电泳迁移率D.长度相同的DNA分子电泳迁移率一致
2. 在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶（R1和R2）处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是（ ）
A.该载体最可能为环形DNA分子B.两种限制酶在载体上识别的序列可能相同C.限制酶R1与R2的切点最短相距约200bpD.限制酶作用位点会导致磷酸二酯键断裂
相关课件
人教版 (2019)选择性必修3二 胚胎工程技术及其应用优质ppt课件： 这是一份人教版 (2019)选择性必修3<a href="/sw/tb_c4008682_t3/?tag_id=26" target="_blank">二 胚胎工程技术及其应用优质ppt课件</a>，共60页。PPT课件主要包含了胚胎工程技术及其应用，体外受精，卵母细胞采集，精子的获取，胚胎移植，两次处理，两次检查，胚胎移入的基础，胚胎收集的基础，胚胎移植实质等内容，欢迎下载使用。
人教版 (2019)选择性必修3第2章 细胞工程第3节 胚胎工程一 胚胎工程的理论基础优秀ppt课件： 这是一份人教版 (2019)选择性必修3<a href="/sw/tb_c4008681_t3/?tag_id=26" target="_blank">第2章 细胞工程第3节 胚胎工程一 胚胎工程的理论基础优秀ppt课件</a>，共45页。PPT课件主要包含了胚胎工程的理论基础，准备阶段，受精阶段，输卵管，精子获能，获能液，卵子准备，放射冠，卵细胞膜，透明带等内容，欢迎下载使用。
高中人教版 (2019)三 动物体细胞核移植技术和克隆动物公开课ppt课件： 这是一份高中人教版 (2019)<a href="/sw/tb_c4008678_t3/?tag_id=26" target="_blank">三 动物体细胞核移植技术和克隆动物公开课ppt课件</a>，共47页。PPT课件主要包含了动物细胞培养，梦想照进现实，动物细胞核移植技术，技术原理，细胞核全能性，胚胎细胞核移植，体细胞核移植，体细胞核移植的过程，以克隆高产奶牛为例，思考●讨论等内容，欢迎下载使用。
