第3章 基因工程章末复习 学案-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

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第3章 基因工程章末复习课学习目标1.通过梳理基因工程操作流程，能选择合适的限制酶进行基因表达载体的构建。（科学思维） 2.通过对基因工程基本操作程序的深入剖析，能设计方案进行重组DNA分子的筛选和目的基因的检测与鉴定，并能运用这些知识解决实际问题。(科学思维和科学探究）3.通过分析基因工程“重组人胰岛素生产”的真实情境，能理解基因工程的应用价值和潜在风险，培养批判性思维和社会责任意识。（科学思维、社会责任）自主预习一、重组DNA技术的基本工具1.限制酶的功能：能够识别双链DNA分子的　　　　核苷酸序列,并且使每一条链中　　　　部位的　　　　　　　断开，因此具有特异性。2.载体应具备哪些条件?二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因（1）PCR的原理是什么?（2）写出PCR扩增过程的步骤及对应的温度。2.基因表达载体的构建基因表达载体的组成[填图]3.将目的基因导入不同受体细胞的方法有哪些?4. 目的基因的检测与鉴定（1）分子水平检测①通过　　　等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。 ②从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行　　　　　　杂交,检测目的基因是否翻译成了蛋白质。 （2）个体生物学水平鉴定包括　　　　　的接种实验,以确定是否有抗虫的特性及抗性的程度;与天然产品活性进行比较等。 课堂探究【研究背景】胰岛素是治疗糖尿病的重要药物，科学家通过基因工程大规模生产人胰岛素，这一过程涉及一系列复杂而严谨的操作步骤。今天我们将以“重组人胰岛素的生产”为线索，系统梳理基因工程的核心流程与关键环节。探究一、基因工程中限制酶的选择若图1是获取的含有人胰岛素基因（目的基因）的DNA片段，Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；下图2是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；下图3是该过程所用质粒的结构示意图（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。请分析回答问题：（1）若用BamHⅠ切割图1所示的DNA片段获取目的基因，则需选用哪种限制酶切割图3所示质粒？（2）写出上述两个黏性末端连接后的碱基序列。该序列能不能被图2中某种酶识别？阐明理由。 （3）你认为（1）中构建基因表达载体的方案有缺陷吗？为什么？切割图1所示DNA片段的最佳方案是选用哪种或哪些限制酶？【总结】根据图示尝试总结限制酶的选择原则【跟踪训练】图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(　　)A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNAB.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长探究二、基因工程中重组DNA分子的筛选外源胰岛素基因插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。将此质粒载体用Sau3AⅠ、EcoRⅠ双酶切后，与用相应限制酶切割获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。可利用抗生素抗性基因筛选出含有重组DNA的大肠杆菌。【小组合作1】抗药性筛选1.被转化的大肠杆菌有几种情况？在含有青霉素的培养基中无法区分是否含有重组质粒，为什么？2．如图表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了大肠杆菌。培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有____________、____________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是____________(填图中的数字)菌落中的细菌。【小组活动2】显色筛选很多大肠杆菌的质粒上含有LacZ标记基因，其表达的酶可将一种无色的化合物（X-gal）水解成蓝色产物。若重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18同时携带Ampr和LacZ两个标记基因（ori为复制原点），据图分析，设计筛选成功导入目的基因的工程菌的方案。【小结】 （1）标记基因的作用： （2）抗药性筛选法、显色筛选同时使用与单用抗药性筛选法相比， 更具有优势，原因是 。探究三、目的基因的检测和鉴定方法分析外源胰岛素基因导入受体细胞后，还要进行检测和鉴定。为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。【小组交流】如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是什么？阐明理由。【总结】目的基因检测的方法及思路（1）利用PCR技术如何检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上？ （2）利用PCR技术如何检测目的基因是否转录出mRNA？（3）利用抗原—抗体杂交如何检测目的基因是否翻译出相应蛋白质？【思维拓展】将人的胰岛素基因导入大肠杆菌后，表达出的胰岛素与人的胰岛素结构完全相同吗？ 【跟踪训练】科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因（抗虫基因）导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析不正确的是（ ）A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，则可能是抗虫基因表达效率低B．若经A项检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若能检测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译C．若经B项检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中D．若经C项检测确定细胞中无抗虫基因，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入受体细胞1．用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）  A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落2．下图为构建基因表达载体和检测受体细胞是否含有目的基因的过程示意图，其中LacZ基因控制合成的酶可以分解物质X产生蓝色物质，使平板上形成的菌落呈蓝色，否则菌落为白色。图中③过程所用培养基含有氨苄青霉素和物质X。下列叙述错误的是（  ）  A．①过程需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶B．实验结果中形成的蓝色菌落中的大肠杆菌含有目的基因C．③过程使用的培养基中含有氨苄青霉素，属于选择培养基D．可用处理大肠杆菌使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态3.(不定项)斑点印迹杂交是一种核酸分子杂交技术，其技术流程如图所示。在食品卫生检测和环境监测等领域，利用斑点印迹杂交技术可快速检测出样品中存在的致病微生物或污染微生物。下列相关分析合理的是（    ）  A．斑点印迹杂交技术可用于受体菌细胞中转基因转录量的检测B．斑点印迹杂交技术可用于已知遗传病致病基因的点突变的检测C．p和q片段能够杂交的主要原因是两条链的碱基可以互补配对D．标记的探针中碱基序列的长度越短，则检测的精确度会越高4． 苜蓿是目前我国种植最广的豆科牧草，但是病菌往往威胁着苜蓿的生长。为提高产量，研究人员将溶菌酶基因(LYZ基因)和绿色荧光蛋白基因(GFP基因)连接为LYZ－GFP基因，利用农杆菌转化法将其导入苜蓿细胞中，并通过植物组织培养成功获得了抗病植株。图1表示Ti质粒，其中Vir区的基因产物是T－DNA转移的必备条件；图2表示含有LYZ－GFP基因的DNA片段。图中箭头表示相关限制酶的切割位点。回答下列问题。　　　(1)构建含有LYZ－GFP基因的重组质粒时，应选用限制酶________进行切割，原因是______________________________________________________________________。(2)据图分析，在培育转基因苜蓿植株的过程中，应选择LYZ－GFP基因中的GFP基因为标记基因，而不选择质粒中原有的卡那霉素抗性基因为标记基因，这种做法的优点是______________________________________________________________________。(3)在植物组织培养过程中，对愈伤组织进行显微检测，若____________ ___，则表明细胞中GFP基因存在并表达。(4)选择含有GFP基因的愈伤组织为材料，用PCR技术扩增并检测LYZ基因，需选用一段____________________合成引物，该过程所用的酶必须具有________的特性。(5)对该苜蓿植株进行抗病接种实验，通过观察其抗病程度可以进行个体生物学水平的鉴定，原因是______________________________________________________。【课堂小结】以概念图的形式概括总结本章的知识体系。参考答案自主预习一、1.特定　特定　磷酸二酯键2.(1)质粒分子上有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段插入其中。(2)携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后,能在细胞中进行自我复制,或整合到受体染色体DNA上,随受体细胞DNA同步复制。(3)质粒上常有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选。二、1．（1） DNA半保留复制。（2）变性:90 ℃以上;复性:50 ℃左右;延伸:72 ℃左右。2.3.(1)植物细胞:①花粉管通道法;②农杆菌转化法。(2)动物细胞:显微注射法。(3)微生物细胞:Ca2+处理法(感受态细胞法)。4. (1)PCR 抗原—抗体杂交 (2)抗虫、抗病课堂探究探究一（1）Sau3AⅠ （2）能被Sau3AⅠ识别，因为连接后含有Sau3AⅠ的识别序列。 （3）有缺陷，若只用BamHⅠ分别切割目的基因，用Sau3AⅠ切割质粒，会出现目的基因和质粒的自我环化、目的基因在质粒上的反向连接。EcoRⅠ和BamHⅠ。【总结】根据图示尝试总结限制酶的选择原则。①保护目的基因完整性：酶切位点不能破坏目标片段；②保留标记基因/启动子功能：质粒重要功能区不能被切断；③目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”； = 4 \* GB3 ④双酶切/同尾酶提升效率：可避免自身环化/反向连接，提升表达效率。【跟踪训练】D探究二【小组活动1】1.被转化的大肠杆菌有三种情况，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。在含有青霉素的培养基中能不能区分出来， 因为导入环状目的基因的大肠杆菌不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上不生长，而含有质粒载体和含有重组质粒的大肠杆菌均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。 2． 氨苄青霉素 四环素 4和6【小组活动2】方案：大肠杆菌与重组质粒混合培养，一段时间后，将其接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上，若目的基因插入LacZ基因内，则打断其表达，菌落呈白色；若未插入，LacZ基因表达正常，菌落呈蓝色，因此筛选出的白色菌落即工程菌。【小结】 （1）便于重组DNA分子的筛选（2）抗药性筛选法、显色筛选同时使用 ①只需要经过一次筛选，操作简便；②筛选时只需要一种抗生素，避免抗生素滥用和浪费探究三乙和丙 如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50 bp +300 bp +100 bp =450bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行 PCR鉴定。【总结】（1）从转基因生物中提取出DNA，用目的基因设计的引物进行PCR,然后进行琼脂糖凝胶电泳，观察是否出现目的基因对应的条带。（2）从转基因生物中提取出RNA逆转录形成DNA，用目的基因设计的引物进行PCR,然后进行琼脂糖凝胶电泳，观察是否出现目的基因对应的条带。（3）从转基因生物中提取中蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译出蛋白质。【思维拓展】不完全相同，大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的内质网、高尔基体等结构，无法对核糖体合成的肽链进行加工。【跟踪训练】D当堂检测1.D 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确; 若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因，因此在含四环素培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。2.B ①过程为基因表达载体的构建，使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A正确；标记基因因外源基因的插入而不能表达出相关酶，无法分解物质X，不能产生蓝色物质，故实验结果中形成的白色菌落中的大肠杆菌含有目的基因，B错误；③过程使用的培养基中含有氨苄青霉素，使得含有氨苄青霉素抗性基因的微生物能存活而其他微生物不能存活，属于选择培养基，C正确；可用Ca2+处理大肠杆菌使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，从而实现目的基因的转化，D正确。3.ABC 斑点印迹杂交是一种核酸分子杂交技术，该技术遵循的原理是碱基互补配对，可用于受体菌细胞中转基因转录量（DNA与RNA的碱基配对）的检测，也可用于已知遗传病致病基因的点突变（DNA与DNA碱基互补配对）的检测，A、B正确；结合图示可知，p和q片段能够杂交的主要原因是两条链的碱基可以互补配对，从而形成杂交带，C正确；探针中碱基序列的长度会影响检测的灵敏度。一般来说，探针中碱基序列的长度适中(通常为 100～1000bp)有利于提高杂交效率和检测的灵敏度。探针中碱基序列的长度越短，则检测的精确度会越低，D错误。4.(1)Ⅰ和Ⅲ　选择限制酶Ⅰ和限制酶Ⅲ能获取LYZ－GFP基因，不会破坏质粒中的Vir区的基因，使目的基因的插入位点位于T－DNA片段上　(2)LYZ－GFP基因在T－DNA片段上，能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，便于追踪检测LYZ基因的表达情况　(3)观察到绿色荧光　(4)LYZ基因的核苷酸序列　耐高温(或热稳定)　(5)LYZ基因能够表达出溶菌酶，溶菌酶能够杀灭病菌，转基因成功的苜蓿植株会表现出抗病特性解析　(1)据题图2可知，构建含有LYZ－GFP基因的重组质粒时，含有LYZ－GFP基因的DNA片段有三个酶切位点，目的基因两侧没有相同限制酶切割位点，应该使用双酶切法，限制酶Ⅲ为必选。根据题图1结合农杆菌转化法的原理，所用限制酶的切割位点必须在T－DNA片段上，限制酶Ⅰ会切断Ti质粒本身的四环素抗性基因，但GFP基因、卡那霉素抗性基因都可以作为标记基因，所以可选择限制酶Ⅰ和Ⅲ。限制酶Ⅱ会破坏质粒中的Vir区的基因，不可选用。(2)据题图1可知，若LYZ－GFP基因在T－DNA片段上，就能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，便于追踪检测LYZ基因的表达情况，这是选用GFP基因为标记基因的优点。而卡那霉素抗性基因不在T－DNA片段上，不能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，所以不宜选用。(3)GFP基因的表达产物是绿色荧光蛋白，对愈伤组织进行显微检测时，若观察到绿色荧光，则表明细胞中的GFP基因存在并表达。(4)用PCR技术扩增并检测LYZ基因的前提是要有一段已知的LYZ基因的核苷酸序列，以便合成引物。PCR扩增过程使用的酶应具有耐高温或热稳定的特性。(5)LYZ基因能够表达出溶菌酶，根据免疫学知识可知，溶菌酶是免疫活性物质，能够杀死病菌，因此转基因成功的苜蓿植株会表现出抗病特性。课堂小结