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新教材备战高考生物一轮复习全考点精讲课堂 第35讲 基因工程（课件）
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这是一份新教材备战高考生物一轮复习全考点精讲课堂 第35讲 基因工程（课件），共60页。PPT课件主要包含了章节知识体系，CONTENT，考点分析等内容，欢迎下载使用。
第1课时 基因工程
第十六单元 生物技术与工程
基因工程的基本操作工具
基因进入受体细胞的载体
基因工程的基本操作程序
将目的基因导入受体细胞
利用 PCR 获取和扩增目的基因
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
农牧业、医药卫生、食品工业等
能明确基因工程的概念和原理，了解基因工程的诞生和发展，认同基础理论和相关技术的发展催生了基因工程。
能阐明DNA重组技术所需的三种基本工具的作用，能完成DNA的粗提取和鉴定。
能理解利用PCR技术获取和扩增目标DNA片段，并用电泳鉴定PCR的产物。
能阐明蛋白质工程崛起的缘由，明确蛋白质工程的基本原理，能依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白质的过程。
了解基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面的应用。
能阐明基因工程的基本操作程序，能针对人类生产和生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
1、基因工程的概念
一、基因工程的概念及理论和技术基础
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
遗传性状
2、基因工程的理论和技术基础
二、基因工程的基本工具
1、限制性内切核酸酶(简称限制酶)—“分子手术刀”（1）来源：主要是从 生物中分离纯化出来的。（2）作用：识别双链DNA分子的某种特定的 ，并切开特定部位的两个核苷酸之间的 。（3）结果：产生 或平末端。
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成
①不同的限制酶所识别的核苷酸序列一般是不同的，切割 产生的黏性末端一般也是不同的。
限制酶切断的是核苷酸之间的这一段
①不同的限制酶所识别的核苷酸序列一般是不同的，切割 产生的黏性末端一般也是不同的。但也有例外！
1、限制性内切核酸酶(简称限制酶)—“分子手术刀”（1）来源：主要是从 生物中分离纯化出来的。（2）作用：识别双链DNA分子的某种特定的 ，并切开特定部位的两个核苷酸之间的 。（3）结果：产生 或平末端。
①不同的限制酶所识别的核苷酸序列一般是不同的，切割 产生的黏性末端一般也是不同的。但也有例外！
②限制酶识别的核苷酸序列一般是回文序列，一种限制酶 切割产生的黏性末端一般是相同的。
③限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该 酶的识别序列或识别序列已经被修饰(如甲基化)。
2、DNA连接酶—“分子缝合针”
（1）作用：恢复被限制酶切开的磷酸二酯键， 将两个DNA片段连接起来。
提醒：DNA连接酶与DNA聚合酶不是一回事。
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有 的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
3、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
作用：将外源基因送入受体细胞，使之能得到复制和进行表达。
①能在细胞中自我复制，或整合到受体DNA上， 随受体DNA同步复制
②有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA 片段(基因)插入其中
③有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选
其他载体：噬菌体和动、植物病毒等。
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
天然质粒需进行人工改造，才能用于基因工程
病毒侵染宿主细胞时，其核酸会进入细胞中
注：LacZ基因表达产物可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。
问题：哪种大肠杆菌可以在含X-gal和青霉素的固体培养基上形成蓝色菌落?
三、DNA的粗提取与鉴定
利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2ml/L的NaCl溶液。
2、DNA的理化性质
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋 白质。
（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
新鲜洋葱(也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同)、研磨液、体积分数为95%的酒精、2ml/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
1、不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
2、用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是什么？
防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接。
3、请判断对错。 ①基因工程的原理是基因重组，此种变异是定向的( ) ②DNA重组技术的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体( ) ③大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成( ) ④限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开( ) ⑤DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键( ) ⑥做载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的( ) ⑦DNA粗提取时，洋葱研磨液经纱布过滤后，应放在－4℃冰箱中放置几分钟( ) ⑧将丝状物溶解在2 ml/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色( ) ⑨载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达( ) ⑩蛋白质不溶于酒精，但某些DNA溶于酒精，据此可以初步分离DNA与蛋白质( ) ⑪载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因( ) ⑫E.cli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( )
4、如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )A. ①②③④ B. ①②④③C. ①④②③ D. ①④③② 5、用XhⅠ和Sal Ⅰ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是( ) A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物 D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
6、(2022·长春市高三期中)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是（ ）
注：Y为C或T，R为A或G。
A. HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端 B. Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部 C. BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端 D. 一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
7、(2021·泰州高三模拟)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是( ) A．该载体最可能为环形DNA分子 B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距200bp D．限制酶作用于该载体会导致氢键和肽键断裂 8、[2022·江苏省东台中学高三检测]“工欲善其事，必先利其器”。限制性内切核酸酶、DNA连接酶的发现为DNA切割、连接、功能基因的获得以及表达载体的构建创造了条件，下列关于限制性内切核酸酶和DNA连接酶的叙述，正确的是( ) A．两者都是从原核生物中分离纯化出来的 B．两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变 C．限制性内切核酸酶都能在特定位点切割产生黏性末端 D．T4 DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
9、第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是（ ） A. 构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒 B. 图乙中只用EcRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团 C. 用EcRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物 D. 抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
10、近年诞生的 CRISPR/Cas9基因编辑技术可进行基因定点编辑。 CRISPR/Cas9系统主要包括Cas9(限制性内切核酸酶)和向导RNA，其原理是由向导RNA引导Cas9到一个特定的基因位点进行切割(上述过程见下图)。下列相关叙述正确的是( ) A．CRISPR/Cas9的组成物质是在 核糖体上合成的 B．向导RNA的合成需要逆转录酶 的参与 C．基因的定点编辑过程只涉及碱 基A-U，G-C的互补配对 D．切割后形成的每个DNA片段均 含有两个游离的磷酸基团
11、(2021·山东卷)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( ) A. 加入适量的木瓜蛋白酶 B. 37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟 C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精 D. 加入NaCl调节浓度至2 ml/L→过滤→加入NaCl调节浓度至0.14 ml/L 12、(2019·江苏)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( ) A. 用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B. DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C. 预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA D. 用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
四、基因工程的基本操作程序
利用基因工程技术生产凝乳酶主要需要四个步骤： ①目的基因的筛选与获取 ②基因表达载体的构建 ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测与鉴定
1、目的基因的筛选与获取
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②人工合成(如反转录、化学合成等)
③利用 PCR 获取和扩增目的基因
①从已构建的基因文库中获取
a、概念 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
b、DNA复制所需的基本条件
引物(通常为小的单链RNA)
使DNA聚合酶能够从引物的 3'端开始连接脱氧核苷酸
无需解旋酶，用高温代替
耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
引物(通常为小的单链DNA)
激活DNA聚合酶、为DNA复制提供适宜的反应条件
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为 20〜30 个核苷酸。
根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成的
引物自身及两种引物之间不应存在互补序列
引物不能太短，也不能过长；且碱基G+C的含量要达到一定的比例。
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端，即子链的延伸方向是5 ′→3 ′。 由于DNA聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物(最初的已有链)。
一次PCR一般要经历30次循环
若像图2那样设计引物，能不能扩增出目的基因片段？
至少经过 轮PCR后，才能扩增出目的基因；n轮后，完整的目的基因有 个。
扩增产物中，含有引物的DNA占 个，只含一种引物的DNA 个，含有两种引物的DNA 个。
n轮后，共消耗引物 个；第n轮，消耗引物 个。
e、用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
电泳原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2、基因表达载体的构建(核心)
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）基因表达载体的组成
①启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。②启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。③有时会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达(即在特定诱导物下才会活动)。此外，还有组成型启动子(一直活动)和组织特异性启动子(在特定组织中活动)
复制起始位点，此处的A和T特别多，相对氢键少，不稳定，DNA容易解旋。
目的基因一定要插入启动子和终止子之间
①终止子位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段 ②使转录在所需要的地方停下来
先用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶(同尾酶)切割载体和含有目的基因的片段，再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上，形成重组DNA分子。
问题： 选用哪种限制酶同时切割Bt基因和载体？
GGATCCACCTAGGTTCGA
Hind Ⅲ与BamH Ⅰ双酶切
怎样将基因表达载体选出？
双酶切优点： 利于载体与目的基因正确结合，避免反向连接和自身环化
因为质粒不相溶性，重组质粒和未重组质粒通常不会同时出现在细菌细胞中
基因表达载体（重组子）的筛选
基因表达载体（重组子）的筛选（再续）
问题： 若目的基因两侧无合适的限制酶切割位点怎么办？
含准备引入的限制酶切割位点
3、将目的基因导入受体细胞
（1）转化的概念 转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
可转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上
农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力
4、目的基因的检测与鉴定(检查基因工程是否做成功)
用普通棉(对照组)和抗虫棉(实验组)分别饲喂棉铃虫，观察抗虫效果
通常是抗原，但也可能是抗体
1、PCR可以扩增mRNA吗？利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物?
不可以，因为PCR是用DNA双链做模板的，不能直接用单链RNA做PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。
DNA是两条链是反向平行的，而复制时只能从固定的方向(模板链的3‘端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。
2、转基因植物所携带的目的基因可能传递给非转基因植物，造成基因污染。如果将目的基因导入叶绿体DNA中，就可以有效避免基因污染，原因是什么？
叶绿体基因不会通过花粉传给下一代
①外源DNA必在位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制( ) ②用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物( ) ③在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( ) ④引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸( ) ⑤PCR利用DNA热变性原理，通过调节温度控制DNA双链的解聚与结合( ) ⑥检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原-抗体杂交技术( ) ⑦基因表达载体中含有启动子和终止密码子( ) ⑧抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达( ) ⑨从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达( ) ⑩Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起( ) ⑪用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列( ) ⑫表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点( ) ⑬转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测( ) ⑭目的基因的获得不一定需要限制酶( )
4、回答下列关于基因工程的一些问题。（1）在培育有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是 。（2）以mRNA为材料可以获得DNA，其原理是 。 。 。（3）PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏 的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但 的引物需要设定更高的复性温度。（4）从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是 ，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是 。（5）质粒运载体用EcRⅠ切割后产生的片段如右图： 。为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切核酸酶切割，该酶必须具有的特点是 。
侵染植物，将目的基因转移到受体细胞中
按照碱基互补配对的原则可以合成DNA
在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板
切割产生的DNA片段末端与EcR Ⅰ切割产生的末端相同
（5）为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用 进行检测目的基因是否已插入，又要在个体水平上鉴定，后者的具体过程是 。。 。（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是 。（7）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。（8）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是 (答出两点即可)。（9）目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。
将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐
的土壤中，观察该烟草植株的生长状态
未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
目的基因无复制原点；目的基因无表达所需的启动子
耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
4、回答下列关于基因工程的一些问题。
5、科学家对北极比目鱼的抗冻蛋白基因的结构已经非常明确，将其转入番茄后，使番茄的耐寒能力大大提高。下列有关叙述错误的是( ) A．以抗冻蛋白基因的mRNA作为模板进行PCR扩增，可获得大量的目的基因 B．抗冻蛋白基因首端可以构建受低温因素影响的诱导型启动子 C．该抗冻蛋白基因结构已知且功能清晰，能进行较为有效的筛选 D．鱼和番茄的基因能拼接成功说明二者的DNA分子空间结构是相同的 6、如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述，正确的是（ ） A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成的由两个DNA片段连接形成的产物有两种 B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键 C．为了防止目的基因反向粘连和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcRⅠ和BamHⅠ D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞中已成功导入该目的基因
7、利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列叙述正确的是( )
A．过程①需使用DNA聚合酶 B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因 C．过程③使用的大肠杆菌细胞可用Na＋处理 D．过程④可利用RCR技术检测目的基因是否已导入受体细胞
8、(2020·北京)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ） A. ①＋③ B. ①＋② C. ③＋② D. ③＋④
9、(2022·北京高三一模)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是（ ）
A. 应选择的限制酶组合是酶F和酶G B. 所选用的受体菌不能含有AmpR和 TetR基因 C. 用含氨苄青霉素的培养基筛选出 含重组质粒的受体菌 D. 同时用三种限制酶处理图中质粒， 电泳后可得到4个条带
注：Amp R：氨苄青霉素抗性基因， Tet R：四环素抗性基因
10、右图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是( )
A. 利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶而需要耐高温的DNA聚合酶 B. 引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的3′→5′方向延伸 C. 从理论上推测，第四轮循环产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16 D. 在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段且占1/4
11、农杆菌Ti质粒上的TDNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出TDNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定TDNA插入的具体位置。下列说法不正确的是( )
注：子链从引物的3′端开始延伸
A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理 B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定TDNA的插入位置
12、(2021·湖北卷)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( ) A. 增加模板DNA的量 B. 延长热变性的时间 C. 延长延伸的时间 D. 提高复性的温度 13、下列有关电泳的叙述，错误的是( ) A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度 C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D．常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
14、一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记(下图左边一列)。关于该双链DNA，下列说法错误的是（ ） A. 呈环状结构 B. 分子质量大小为10 kb C. 有一个NtⅠ和两个EcRⅠ切点 D. 其NtⅠ切点与EcRⅠ切点的最短距离为2 kb
15、(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：（1）常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
EcRⅠ、PstⅠ、Sma Ⅰ和EcRⅤ
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。（4）表达载体含有启动子，启动子是指 。
位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
一个至多个限制酶切割位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
16、某一质粒载体如图所示，外源DNA插入AmpR或Tetr中会导致相应的基因失活(AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题。（1）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是 ；并且 和 的细胞也是不能区分的，其原因是 。（2）在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有 的固体培养基。
二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长
二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长
含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)
17、(2021·辽宁选择性考试改编)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。（2）右图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。
为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 (填“E.cli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
能吸收周围环境中DNA分子
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取单菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物：小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中。
18、[2020·江苏卷]如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：（1）步骤Ⅰ用的EcRⅠ是一种 酶，它通过识别特定的 切割特定位点。（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成 ；PCR循环中，升温到95℃是为了获得 ；Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
以DNA为模板的DNA链的延伸
（3）若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是 。
19、(2021·丹东模拟)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题：
（1）EcR Ⅴ酶切位点为 ，EcRⅤ酶切出来的线性载体P1为 末端。（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在 酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是 (填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是 。
第1课时 基因工程
第十六单元 生物技术与工程
基因工程的基本操作工具
基因进入受体细胞的载体
基因工程的基本操作程序
将目的基因导入受体细胞
利用 PCR 获取和扩增目的基因
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
农牧业、医药卫生、食品工业等
能明确基因工程的概念和原理，了解基因工程的诞生和发展，认同基础理论和相关技术的发展催生了基因工程。
能阐明DNA重组技术所需的三种基本工具的作用，能完成DNA的粗提取和鉴定。
能理解利用PCR技术获取和扩增目标DNA片段，并用电泳鉴定PCR的产物。
能阐明蛋白质工程崛起的缘由，明确蛋白质工程的基本原理，能依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白质的过程。
了解基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面的应用。
能阐明基因工程的基本操作程序，能针对人类生产和生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
1、基因工程的概念
一、基因工程的概念及理论和技术基础
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
遗传性状
2、基因工程的理论和技术基础
二、基因工程的基本工具
1、限制性内切核酸酶(简称限制酶)—“分子手术刀”（1）来源：主要是从 生物中分离纯化出来的。（2）作用：识别双链DNA分子的某种特定的 ，并切开特定部位的两个核苷酸之间的 。（3）结果：产生 或平末端。
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成
①不同的限制酶所识别的核苷酸序列一般是不同的，切割 产生的黏性末端一般也是不同的。
限制酶切断的是核苷酸之间的这一段
①不同的限制酶所识别的核苷酸序列一般是不同的，切割 产生的黏性末端一般也是不同的。但也有例外！
1、限制性内切核酸酶(简称限制酶)—“分子手术刀”（1）来源：主要是从 生物中分离纯化出来的。（2）作用：识别双链DNA分子的某种特定的 ，并切开特定部位的两个核苷酸之间的 。（3）结果：产生 或平末端。
①不同的限制酶所识别的核苷酸序列一般是不同的，切割 产生的黏性末端一般也是不同的。但也有例外！
②限制酶识别的核苷酸序列一般是回文序列，一种限制酶 切割产生的黏性末端一般是相同的。
③限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该 酶的识别序列或识别序列已经被修饰(如甲基化)。
2、DNA连接酶—“分子缝合针”
（1）作用：恢复被限制酶切开的磷酸二酯键， 将两个DNA片段连接起来。
提醒：DNA连接酶与DNA聚合酶不是一回事。
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有 的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
3、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
作用：将外源基因送入受体细胞，使之能得到复制和进行表达。
①能在细胞中自我复制，或整合到受体DNA上， 随受体DNA同步复制
②有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA 片段(基因)插入其中
③有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选
其他载体：噬菌体和动、植物病毒等。
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
天然质粒需进行人工改造，才能用于基因工程
病毒侵染宿主细胞时，其核酸会进入细胞中
注：LacZ基因表达产物可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。
问题：哪种大肠杆菌可以在含X-gal和青霉素的固体培养基上形成蓝色菌落?
三、DNA的粗提取与鉴定
利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2ml/L的NaCl溶液。
2、DNA的理化性质
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋 白质。
（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
新鲜洋葱(也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同)、研磨液、体积分数为95%的酒精、2ml/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
1、不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
2、用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是什么？
防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接。
3、请判断对错。 ①基因工程的原理是基因重组，此种变异是定向的( ) ②DNA重组技术的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体( ) ③大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成( ) ④限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开( ) ⑤DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键( ) ⑥做载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的( ) ⑦DNA粗提取时，洋葱研磨液经纱布过滤后，应放在－4℃冰箱中放置几分钟( ) ⑧将丝状物溶解在2 ml/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色( ) ⑨载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达( ) ⑩蛋白质不溶于酒精，但某些DNA溶于酒精，据此可以初步分离DNA与蛋白质( ) ⑪载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因( ) ⑫E.cli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( )
4、如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )A. ①②③④ B. ①②④③C. ①④②③ D. ①④③② 5、用XhⅠ和Sal Ⅰ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是( ) A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物 D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
6、(2022·长春市高三期中)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是（ ）
注：Y为C或T，R为A或G。
A. HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端 B. Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部 C. BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端 D. 一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
7、(2021·泰州高三模拟)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是( ) A．该载体最可能为环形DNA分子 B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距200bp D．限制酶作用于该载体会导致氢键和肽键断裂 8、[2022·江苏省东台中学高三检测]“工欲善其事，必先利其器”。限制性内切核酸酶、DNA连接酶的发现为DNA切割、连接、功能基因的获得以及表达载体的构建创造了条件，下列关于限制性内切核酸酶和DNA连接酶的叙述，正确的是( ) A．两者都是从原核生物中分离纯化出来的 B．两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变 C．限制性内切核酸酶都能在特定位点切割产生黏性末端 D．T4 DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
9、第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是（ ） A. 构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒 B. 图乙中只用EcRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团 C. 用EcRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物 D. 抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
10、近年诞生的 CRISPR/Cas9基因编辑技术可进行基因定点编辑。 CRISPR/Cas9系统主要包括Cas9(限制性内切核酸酶)和向导RNA，其原理是由向导RNA引导Cas9到一个特定的基因位点进行切割(上述过程见下图)。下列相关叙述正确的是( ) A．CRISPR/Cas9的组成物质是在 核糖体上合成的 B．向导RNA的合成需要逆转录酶 的参与 C．基因的定点编辑过程只涉及碱 基A-U，G-C的互补配对 D．切割后形成的每个DNA片段均 含有两个游离的磷酸基团
11、(2021·山东卷)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( ) A. 加入适量的木瓜蛋白酶 B. 37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟 C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精 D. 加入NaCl调节浓度至2 ml/L→过滤→加入NaCl调节浓度至0.14 ml/L 12、(2019·江苏)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( ) A. 用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B. DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C. 预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA D. 用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
四、基因工程的基本操作程序
利用基因工程技术生产凝乳酶主要需要四个步骤： ①目的基因的筛选与获取 ②基因表达载体的构建 ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测与鉴定
1、目的基因的筛选与获取
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②人工合成(如反转录、化学合成等)
③利用 PCR 获取和扩增目的基因
①从已构建的基因文库中获取
a、概念 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
b、DNA复制所需的基本条件
引物(通常为小的单链RNA)
使DNA聚合酶能够从引物的 3'端开始连接脱氧核苷酸
无需解旋酶，用高温代替
耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
引物(通常为小的单链DNA)
激活DNA聚合酶、为DNA复制提供适宜的反应条件
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为 20〜30 个核苷酸。
根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成的
引物自身及两种引物之间不应存在互补序列
引物不能太短，也不能过长；且碱基G+C的含量要达到一定的比例。
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端，即子链的延伸方向是5 ′→3 ′。 由于DNA聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物(最初的已有链)。
一次PCR一般要经历30次循环
若像图2那样设计引物，能不能扩增出目的基因片段？
至少经过 轮PCR后，才能扩增出目的基因；n轮后，完整的目的基因有 个。
扩增产物中，含有引物的DNA占 个，只含一种引物的DNA 个，含有两种引物的DNA 个。
n轮后，共消耗引物 个；第n轮，消耗引物 个。
e、用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
电泳原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2、基因表达载体的构建(核心)
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）基因表达载体的组成
①启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。②启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。③有时会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达(即在特定诱导物下才会活动)。此外，还有组成型启动子(一直活动)和组织特异性启动子(在特定组织中活动)
复制起始位点，此处的A和T特别多，相对氢键少，不稳定，DNA容易解旋。
目的基因一定要插入启动子和终止子之间
①终止子位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段 ②使转录在所需要的地方停下来
先用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶(同尾酶)切割载体和含有目的基因的片段，再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上，形成重组DNA分子。
问题： 选用哪种限制酶同时切割Bt基因和载体？
GGATCCACCTAGGTTCGA
Hind Ⅲ与BamH Ⅰ双酶切
怎样将基因表达载体选出？
双酶切优点： 利于载体与目的基因正确结合，避免反向连接和自身环化
因为质粒不相溶性，重组质粒和未重组质粒通常不会同时出现在细菌细胞中
基因表达载体（重组子）的筛选
基因表达载体（重组子）的筛选（再续）
问题： 若目的基因两侧无合适的限制酶切割位点怎么办？
含准备引入的限制酶切割位点
3、将目的基因导入受体细胞
（1）转化的概念 转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
可转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上
农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力
4、目的基因的检测与鉴定(检查基因工程是否做成功)
用普通棉(对照组)和抗虫棉(实验组)分别饲喂棉铃虫，观察抗虫效果
通常是抗原，但也可能是抗体
1、PCR可以扩增mRNA吗？利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物?
不可以，因为PCR是用DNA双链做模板的，不能直接用单链RNA做PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。
DNA是两条链是反向平行的，而复制时只能从固定的方向(模板链的3‘端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。
2、转基因植物所携带的目的基因可能传递给非转基因植物，造成基因污染。如果将目的基因导入叶绿体DNA中，就可以有效避免基因污染，原因是什么？
叶绿体基因不会通过花粉传给下一代
①外源DNA必在位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制( ) ②用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物( ) ③在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( ) ④引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸( ) ⑤PCR利用DNA热变性原理，通过调节温度控制DNA双链的解聚与结合( ) ⑥检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原-抗体杂交技术( ) ⑦基因表达载体中含有启动子和终止密码子( ) ⑧抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达( ) ⑨从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达( ) ⑩Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起( ) ⑪用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列( ) ⑫表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点( ) ⑬转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测( ) ⑭目的基因的获得不一定需要限制酶( )
4、回答下列关于基因工程的一些问题。（1）在培育有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是 。（2）以mRNA为材料可以获得DNA，其原理是 。 。 。（3）PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏 的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但 的引物需要设定更高的复性温度。（4）从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是 ，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是 。（5）质粒运载体用EcRⅠ切割后产生的片段如右图： 。为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切核酸酶切割，该酶必须具有的特点是 。
侵染植物，将目的基因转移到受体细胞中
按照碱基互补配对的原则可以合成DNA
在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板
切割产生的DNA片段末端与EcR Ⅰ切割产生的末端相同
（5）为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用 进行检测目的基因是否已插入，又要在个体水平上鉴定，后者的具体过程是 。。 。（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是 。（7）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。（8）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是 (答出两点即可)。（9）目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。
将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐
的土壤中，观察该烟草植株的生长状态
未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
目的基因无复制原点；目的基因无表达所需的启动子
耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
4、回答下列关于基因工程的一些问题。
5、科学家对北极比目鱼的抗冻蛋白基因的结构已经非常明确，将其转入番茄后，使番茄的耐寒能力大大提高。下列有关叙述错误的是( ) A．以抗冻蛋白基因的mRNA作为模板进行PCR扩增，可获得大量的目的基因 B．抗冻蛋白基因首端可以构建受低温因素影响的诱导型启动子 C．该抗冻蛋白基因结构已知且功能清晰，能进行较为有效的筛选 D．鱼和番茄的基因能拼接成功说明二者的DNA分子空间结构是相同的 6、如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述，正确的是（ ） A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成的由两个DNA片段连接形成的产物有两种 B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键 C．为了防止目的基因反向粘连和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcRⅠ和BamHⅠ D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞中已成功导入该目的基因
7、利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列叙述正确的是( )
A．过程①需使用DNA聚合酶 B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因 C．过程③使用的大肠杆菌细胞可用Na＋处理 D．过程④可利用RCR技术检测目的基因是否已导入受体细胞
8、(2020·北京)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ） A. ①＋③ B. ①＋② C. ③＋② D. ③＋④
9、(2022·北京高三一模)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是（ ）
A. 应选择的限制酶组合是酶F和酶G B. 所选用的受体菌不能含有AmpR和 TetR基因 C. 用含氨苄青霉素的培养基筛选出 含重组质粒的受体菌 D. 同时用三种限制酶处理图中质粒， 电泳后可得到4个条带
注：Amp R：氨苄青霉素抗性基因， Tet R：四环素抗性基因
10、右图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是( )
A. 利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶而需要耐高温的DNA聚合酶 B. 引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的3′→5′方向延伸 C. 从理论上推测，第四轮循环产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16 D. 在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段且占1/4
11、农杆菌Ti质粒上的TDNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出TDNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定TDNA插入的具体位置。下列说法不正确的是( )
注：子链从引物的3′端开始延伸
A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理 B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定TDNA的插入位置
12、(2021·湖北卷)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( ) A. 增加模板DNA的量 B. 延长热变性的时间 C. 延长延伸的时间 D. 提高复性的温度 13、下列有关电泳的叙述，错误的是( ) A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度 C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D．常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
14、一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记(下图左边一列)。关于该双链DNA，下列说法错误的是（ ） A. 呈环状结构 B. 分子质量大小为10 kb C. 有一个NtⅠ和两个EcRⅠ切点 D. 其NtⅠ切点与EcRⅠ切点的最短距离为2 kb
15、(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：（1）常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
EcRⅠ、PstⅠ、Sma Ⅰ和EcRⅤ
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。（4）表达载体含有启动子，启动子是指 。
位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
一个至多个限制酶切割位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
16、某一质粒载体如图所示，外源DNA插入AmpR或Tetr中会导致相应的基因失活(AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题。（1）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是 ；并且 和 的细胞也是不能区分的，其原因是 。（2）在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有 的固体培养基。
二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长
二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长
含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)
17、(2021·辽宁选择性考试改编)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。（2）右图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。
为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 (填“E.cli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
能吸收周围环境中DNA分子
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取单菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物：小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中。
18、[2020·江苏卷]如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：（1）步骤Ⅰ用的EcRⅠ是一种 酶，它通过识别特定的 切割特定位点。（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成 ；PCR循环中，升温到95℃是为了获得 ；Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
以DNA为模板的DNA链的延伸
（3）若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是 。
19、(2021·丹东模拟)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题：
（1）EcR Ⅴ酶切位点为 ，EcRⅤ酶切出来的线性载体P1为 末端。（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在 酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是 (填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是 。
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