高中生物第1章 发酵工程第2节 微生物的培养技术及应用二 微生物的选择培养和计数第2课时学案

这是一份高中生物第1章 发酵工程第2节 微生物的培养技术及应用二 微生物的选择培养和计数第2课时学案，共14页。学案主要包含了选择培养基，微生物的选择培养，微生物的数量测定等内容，欢迎下载使用。

第2课时　微生物的选择培养和计数

课标内容要求
核心素养对接
1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
2．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
1．生命观念：通过实例理解各类微生物都能适应其生活环境。
2．科学思维：根据微生物的代谢类型配制选择培养基；总结分离微生物的过程和测定微生物数量的常用方法。
3．科学探究：讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验方法并对实验结果进行评价。


一、选择培养基
1．实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．选择培养基概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
3．选择培养基配方的设计
(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生NH3。
(2)培养基配方设计：以尿素为唯一氮源的选择培养基。
二、微生物的选择培养
1．方法：对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
2．稀释涂布平板法的操作过程
(1)系列梯度稀释操作

(2)涂布平板操作
①取菌液：取0.1_mL菌液，滴加到培养基表面。
②涂布器灭菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上灼烧，待酒精燃尽，涂布器冷却后，再进行涂布。
③涂布过程：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
3．培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d，观察。
三、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)统计依据
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)操作
①选用一定稀释范围的样品液进行培养，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
2．显微镜直接计数：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
四、探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．提出问题：如何分离土壤中分解尿素的细菌？每克土壤样品中含有多少分解尿素的细菌？
2．基础知识
组分
含量
提供的主要营养
KH2PO4
1.4 g
无机盐
Na2HPO4
2.1 g
MgSO4·7H2O
0.2 g
葡萄糖
10.0 g
碳源
尿素
1.0 g
氮源
琼脂
15.0 g
凝固剂
H2O
定容至1 000 mL
水
3．实验设计
(1)土壤取样：先铲去表层土，取距地表3～8 cm的土壤层，将样品装入纸袋中。
(2)样品的稀释：一般选用1×104、1×105、1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
(3)微生物的培养与观察：细菌一般在30～37_℃的温度下培养1～2天，每隔24_h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。 (×)
提示：选择分解尿素的细菌的培养基为固体培养基，固体培养基具有分离、鉴定作用。
2．由于使用了选择培养基，因此本实验不需要设置对照组。 (×)
提示：应该设置未接种的平板和接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板作为对照。
3．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿盖。 (×)
提示：为了防止杂菌污染，不能完全打开皿盖。
4．在同一稀释度下，至少要涂布3个平板。 (√)
5．当菌落数目稳定时，选取菌落数为30～300的平板进行计数。 (√)
6．统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。 (×)
提示：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。

　微生物的选择培养与计数方法
1．选择培养的目的：从众多微生物中分离出需要的特定微生物。
2．筛选微生物常用培养基——选择培养基和鉴别培养基

选择培养基
鉴别培养基
特殊成分
控制某一条件(如唯一氮源)或加入某种物质(如青霉素)
加入某种指示剂或化学药品
目的
抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长
与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途
培养、分离出特定微生物
鉴别不同的微生物
举例
培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌
可用伊红—美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
3．稀释涂布平板法
(1)主要操作环节：系列梯度稀释和涂布平板。
(2)系列梯度稀释和涂布平板后培养结果如图所示：

(3)计算公式：
每克样品中的菌株数＝
×稀释倍数
(4)计数结果：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，计算结果比实际值偏小。
4．稀释涂布平板法操作注意问题
(1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。
(2)涂布平板时：
①涂布器浸在体积分数为70%的酒精中，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不接触任何物体。
(3)同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。
5．显微镜直接计数
(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)方法：显微镜下观察，细菌计数板或血细胞计数板计数。
(3)计算公式：
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。
(4)缺点：统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和，计算结果比实际值偏大。

1．如何从大豆田土壤中分离出固氮微生物？
提示：从大豆田土壤取土样，利用缺乏氮源的培养基可分离出固氮微生物。
2．要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
提示：应从富含纤维素的土壤中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
3．在用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，统计菌落数目的理论依据是什么？
提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
4．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。

1．(2021·河北衡水中学检测)秸秆还田可增加土壤肥力，缓解环境污染。为分离分解纤维素的微生物菌种，实现废物的资源化利用，研究人员设计了“土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布平板→挑选菌株”的实验流程。下列叙述错误的是(　　)
A．配制培养基时，应在高压蒸汽灭菌之后调节pH
B．选择培养时，应使用纤维素为唯一碳源的培养基
C．进行梯度稀释时，应在酒精灯火焰旁完成各种操作
D．挑选菌株后，应将使用过的培养基进行灭菌后再丢弃
A　[配制培养基时，应在高压蒸汽灭菌之前调节pH，避免灭菌之后调节pH造成杂菌污染，A错误；选择培养时，为分离分解纤维素的微生物菌种，应使用纤维素为唯一碳源的培养基，B正确；进行梯度稀释时，为了无菌操作，应在酒精灯火焰旁完成各种操作，C正确；挑选菌株后，为了防止造成污染，应将使用过的培养基进行灭菌后再丢弃，D正确。]
2．(2020·全国卷Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。

无菌水　　甲　　乙　　 　　甲
回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用______________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是____________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是____________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：_________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即_____________。
[解析]　(1)实验过程中，对盛有水或培养基的摇瓶进行灭菌时，常采用高压蒸汽灭菌法。据题图分析可知，乙培养基为固体培养基，与甲培养基相比，其特有的组分Y物质应是凝固剂琼脂。甲、乙培养基均只允许能利用物质S作为氮源和碳源的微生物生长，因此均为选择培养基。(2)据题意，假设至少将摇瓶M中的菌液稀释X倍，才能保证稀释后的100 μL菌液中细菌细胞数不超过200个，初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，则稀释之前100 μL菌液中有2×106个细菌，可得2×106×(1/X)＝200，则X＝104，因此至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍。(3)在筛选过程中，若培养基中S浓度过高，可能会导致细胞失水，进而抑制菌株的生长。(4)将含有能降解S的细菌的淤泥加入无菌水中，进行适当稀释后，利用稀释涂布平板法，取适量的菌液涂布到乙培养基上，在适宜条件下进行培养，一段时间后，统计菌落数，即可估算出淤泥中能降解S的细菌细胞数。(5)本实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供的营养物质是水、碳源、氮源和无机盐。
[答案]　(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104
(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐
　两种纯化方法的比较
主要方法
平板划线法
稀释涂布平板法
主要
步骤
接种环在固体培养基表面连续划线
系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具
接种环
涂布器
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
能否用
于计数
不能计数
可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
共同点
都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征

　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．分离菌种的原理
在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，只有能产生脲酶的微生物才能分解尿素，而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖。
2．实验流程示意图

3．实验操作过程
流程
具体操作
操作提示
土壤取样
先铲去表层土，取距地表3～8 cm的土壤层，将样品装入纸袋中
①适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样
②取样用的铁铲和取样的纸袋使用前都需要灭菌
制备
培养基
分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基
牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用
样品的稀释和涂布
①火焰旁称取土壤样本
②将稀释倍数为103～107倍稀释的稀释液涂布平板。每个稀释度至少涂布三个平板作为重复组
①注意无菌操作
②对所用的平板、试管做好标记
③初次实验对于稀释的范围没有把握，可选择一个较为宽泛范围103～107倍稀释的稀释液
培养、观察和计数
①将涂布好的平板和空白平板放在适宜温度下的培养箱中倒置培养
②每隔24 h统计一次菌落数目，比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录
③当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数
①空白平板作为对照，检测培养基制备是否合格
②观察时还要记录不同菌落的形状、大小、颜色等
③在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中活菌的数目
4．实验结果分析
内容
现象
结论
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高
培养基中混入其他杂菌
选择培养基的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
样品的
稀释操作
得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
5．鉴定原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3，使培养基的碱性增强，pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。


1．在稀释涂布平板法中，为何需要涂布3个平板？
提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
2．为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数？
提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
3．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。

1．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是(　　)
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红
B　[利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低，菌落太多，会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在没有选择作用的牛肉膏蛋白胨培养基上培养作为对照，B错误；该实验应采用稀释涂布平板法，C正确；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，则能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。]
2．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析，下列叙述正确的是(　　)

A.3号试管的稀释倍数为103倍
B.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要多
C　[3号试管的稀释倍数为104倍，A项错误；4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数不一定恰好为5号试管的10倍，B项错误；5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(个)，C项正确；在固体培养基上可能存在两个或多个菌体形成一个菌落的情况，得到的结果往往会比实际活菌数目少，D项错误。]
　实验中的两种“对照组”与“重复组”
(1)两种对照组作用比较。
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基(空白对照组)同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置完全培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)进行接种培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置3个平板作为重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式计算活菌数。


微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。如图为产油脂芽孢杆菌筛选的流程，其中B平板上的5个菌落是初筛得到的芽孢杆菌，C为B平板上菌落的原位影印，利用苏丹黑B可使脂类物质呈黑色的特性，对C进行染色，得到结果D。回答下列问题：


通过本案例培养学生的演绎与推理和对实验结果的交流和讨论能力。

(1)图中对土壤菌液进行系列梯度稀释的目的是什么？(科学思维)
(2)根据D的染色结果，判断B平板中产油脂芽孢杆菌的菌落是哪一个？(科学思维)
(3)采用什么方法将B平板中的产油脂芽孢杆菌的单菌落进一步纯化培养得到E？(科学思维)
提示：(1)将微生物分散成单个细胞，进而获得单个细胞。
(2)3。
(3)平板划线法或稀释涂布平板法。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建
核 心 语 句 背 诵

1.选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
3．为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
4．当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
5．统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

1．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是(　　)
A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、蒸馏水
B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、蒸馏水
C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、蒸馏水
D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、蒸馏水
A　[在A项的培养基中既有尿素作为唯一氮源，又有其他各种成分，可以选择出分解尿素的细菌，而B项中无尿素作氮源，C项中缺少碳源，D项中有牛肉膏可提供氮源。]
2．(2020·山东淄博月考)下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述，正确的是(　　)
A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B.统计样品中的活菌数目一般用平板划线法
C.筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质
D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌
A　[统计样品中的活菌数目时一般用稀释涂布平板法，B错误；筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一氮源，培养基中还应含有水、无机盐、碳源等营养物质，C错误；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则表明筛选到了分解尿素的细菌，D错误。]
3．(2020·太原实验中学高二月考)判断选择培养基是否起到了选择作用时，需要设置的对照是(　　)
A.未接种的选择培养基
B.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
C.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
D.接种了的选择培养基
B　[选择培养基的作用是只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长，若设置对照组，需要用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基，若该培养基上微生物能生长且并非只有特定种类，则可证明选择培养基起到选择作用，B项符合题意。]
4．用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是(　　)
A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是212、240和250，取平均值234
D　[在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，A、B错误。C项虽然涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与其他的相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值，C错误。]
5．尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题：
(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。
(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是________________________________。
(3)一般依据尿素分解菌菌落的________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数量为________个。上述过程采用的接种方法是______________。
(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________________________________________________________。
[解析]　(1)分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，尿素作为氮源。因为只有能合成脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度，据此来统计菌落的数目。微生物计数的方法采用稀释涂布平板法接种，1 mL悬液中活细菌的数目为(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(个)。(4)可单独设置一个灭菌后不接种样液的含培养基的培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。
[答案]　(1)脲酶　(2)无机盐　只有以尿素为唯一氮源的细菌才能在该培养基上生长 　(3)形状、大小　4.2×108　稀释涂布平板法 　(4)单独设置一个灭菌后不接种样液的培养皿(含培养基)进行培养