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高考生物专题复习 蛋白质的分离与纯化课件 新人教版
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这是一份高考生物专题复习 蛋白质的分离与纯化课件 新人教版，共60页。PPT课件主要包含了血红蛋白，无色透明，脂溶性物质，红色透明，暗红色，血红蛋白提取，透析袋，磷酸缓冲液，缓冲液，4透析等内容，欢迎下载使用。
在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。它由四个肽链组成，包括两个α—肽链和两个β—肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色
有机溶剂 无色透明的甲苯层
脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层
血红蛋白溶液 红色透明液体
红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
第1层（最上层）： （ ）甲苯层
第2层（中上层）： （ ）的沉淀层， （ ）色薄层固体
第3层（中下层）： （ ）的水溶液层 （ ）的液体
第4层（最下层）： 其它杂质（ ）的沉淀层
思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白
1.洗 涤 红 细 胞
阅读思考：洗涤的目的是什么？
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？
目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。
取( )ml的血红蛋白溶液装入（ ）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mml/L的（ ）中，pH为（ ），透析12小时，目的是（ ）或用于更换样品中的（ ）。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。
除去样品中分子量较小的杂质
小结 样品处理
1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质
2.选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是 ( )多A．血红蛋白是有色蛋白 B．红细胞无细胞核C．红细胞蛋白质含量高 D．红细胞DNA含量高
3.收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离①透析的目的是__________________。②透析的原理是__________________。
①去除分子质量较小的杂质
②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内
5.下列操作正确的是（ ）A. 分离红细胞时采用低速长时间离心 B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸 馏水就可C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D. 透析时要用20mml/l的磷酸缓冲液，透析12h
下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是 ( )多A．采集血样后要高速短时问离心获得血细胞B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白D．释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来
在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是 A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C洗涤过程选用0.1%的生理盐水D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（ ）A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液
（1）原理：（2）材料
大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。
多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。
凝胶色谱法分离蛋白质的原理
Gel filtratin chrmatgraphy
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（ ），在0.5ml的（ ）头部切下（ ）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。
c.剪尼龙网小圆片覆盖在（ ）上，用（ ）的尼龙纱将橡皮塞（ ）包好，插到玻璃管一端。d、色谱柱下端用移液管头部做( )，连接一细的（ ），并用螺旋夹
插入安装了玻璃管的橡皮塞
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。
控制尼龙管的（ ），另一端放入收集（ ）的收集器内
2）凝胶色谱柱填料的处理
（1）凝胶的选择：（ ）（G-75） “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水7.5克。
（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（ ）中充分溶胀后，配成（ ）。
①固定：将色谱柱处置固定在支架上
②装填： 将（ ）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
③洗涤平衡：装填完后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mml/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
①调整缓冲液面：与凝 胶面平齐
加样前打开下端流出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口.
②滴加透析样品：用（ ）将1m（ ）的 样品加到色谱柱的（ ）③样品渗入凝胶床: （ ）④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱
⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集
注意正确的加样操作： ①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样 ③使吸管管口沿管壁 环绕移动
用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较
利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）A.相对分子质量大的B.溶解度高的C.相对分子量小的D.所代电荷多的
解析：凝集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。答案：A
凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为1．6 cm，有关说法中，正确的是( )多A．一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果B．凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大
在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是 A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果B、气泡阻碍蛋白质的运动C、气泡与蛋白质发生化学反应D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A． 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用： 能够抵制（ ）的对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。
3、缓冲溶液的配制
通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。
思考：说出人体血液中缓冲对。
NaH2PO4 / Na2HPO4
H2CO3 / NaHCO3
由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。
调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。
1、概念：指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。
思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）
2、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。
聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶
琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。
测定（ ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳
为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。
聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸带负电荷，在电场中向正极移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以用在对PCR扩增效果的鉴定上。
Native PAGESDS-PAGE
3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少 B 分子的大小C 肽链的多少 D 分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节pH B 维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长 D 防止血液凝固
5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀
基础试题训练1. 凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（ ） A. 对其他分子的亲和力 B. 溶解度 C. 所带电荷多少 D. 相对分子质量的大小2. 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是 A. 糖类化合物 B. 脂质 C. 蛋白质 D. 核酸3. 选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处 A. 血红蛋白是有色蛋白 B. 红细胞无细胞核 C. 红细胞蛋白质含量高 D. 红细胞 DNA含量高
4. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ）A. 甲苯 B. 血红蛋白水溶液C. 脂溶性物质的沉淀层 D. 其他杂质的沉淀5. 血红蛋白因含有（ ）而呈红色A. O2 B. CO C. CO2 D.血红素6. 下列操作正确的是（ ）A. 分离红细胞时采用低速长时间离心B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心D. 透析时要用20mml/l的磷酸缓冲液，透析12h
7. 样品的加入和洗脱的叙述正确的是（ ） A. 先加入1ml透析后的样品 B. 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出 C. 如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功 D. 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水8. 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ） A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
9. 凝胶色谱法操作正确的是（ ） A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 B. 将橡皮塞下部切出凹穴 C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片10. 样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ） A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
11. 下列说法不正确的是（ ） A. 血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，充分搅拌 B. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体 C. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物 D. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液
12. 分离血红蛋白溶液时，将混合液离心后可看到试管中的液体分为4层：第一层为______，第二层为______固体，第三层是______的溶液，第四层是其他杂质的______沉淀物。
13. 红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题： （1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：______、______、______和______。
（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。 ①加入柠檬酸钠的目的是__________________。 ②以上所述的过程即是样品处理，包括______、______、收集血红蛋白溶液。（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。①透析的目的是__________________。②透析的原理是______________________________。。
去除分子质量较小的杂质
透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内
4.然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。①样品纯化的目的是______________________________。②血红蛋白有什么特点？__________。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？
通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去
在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
课间活动请同学们注意安全
在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。它由四个肽链组成，包括两个α—肽链和两个β—肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色
有机溶剂 无色透明的甲苯层
脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层
血红蛋白溶液 红色透明液体
红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
第1层（最上层）： （ ）甲苯层
第2层（中上层）： （ ）的沉淀层， （ ）色薄层固体
第3层（中下层）： （ ）的水溶液层 （ ）的液体
第4层（最下层）： 其它杂质（ ）的沉淀层
思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白
1.洗 涤 红 细 胞
阅读思考：洗涤的目的是什么？
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？
目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。
取( )ml的血红蛋白溶液装入（ ）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mml/L的（ ）中，pH为（ ），透析12小时，目的是（ ）或用于更换样品中的（ ）。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。
除去样品中分子量较小的杂质
小结 样品处理
1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质
2.选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是 ( )多A．血红蛋白是有色蛋白 B．红细胞无细胞核C．红细胞蛋白质含量高 D．红细胞DNA含量高
3.收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离①透析的目的是__________________。②透析的原理是__________________。
①去除分子质量较小的杂质
②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内
5.下列操作正确的是（ ）A. 分离红细胞时采用低速长时间离心 B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸 馏水就可C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D. 透析时要用20mml/l的磷酸缓冲液，透析12h
下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是 ( )多A．采集血样后要高速短时问离心获得血细胞B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白D．释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来
在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是 A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C洗涤过程选用0.1%的生理盐水D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（ ）A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液
（1）原理：（2）材料
大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。
多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。
凝胶色谱法分离蛋白质的原理
Gel filtratin chrmatgraphy
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（ ），在0.5ml的（ ）头部切下（ ）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。
c.剪尼龙网小圆片覆盖在（ ）上，用（ ）的尼龙纱将橡皮塞（ ）包好，插到玻璃管一端。d、色谱柱下端用移液管头部做( )，连接一细的（ ），并用螺旋夹
插入安装了玻璃管的橡皮塞
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。
控制尼龙管的（ ），另一端放入收集（ ）的收集器内
2）凝胶色谱柱填料的处理
（1）凝胶的选择：（ ）（G-75） “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水7.5克。
（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（ ）中充分溶胀后，配成（ ）。
①固定：将色谱柱处置固定在支架上
②装填： 将（ ）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
③洗涤平衡：装填完后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mml/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
①调整缓冲液面：与凝 胶面平齐
加样前打开下端流出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口.
②滴加透析样品：用（ ）将1m（ ）的 样品加到色谱柱的（ ）③样品渗入凝胶床: （ ）④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱
⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集
注意正确的加样操作： ①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样 ③使吸管管口沿管壁 环绕移动
用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较
利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）A.相对分子质量大的B.溶解度高的C.相对分子量小的D.所代电荷多的
解析：凝集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。答案：A
凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为1．6 cm，有关说法中，正确的是( )多A．一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果B．凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大
在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是 A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果B、气泡阻碍蛋白质的运动C、气泡与蛋白质发生化学反应D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A． 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用： 能够抵制（ ）的对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。
3、缓冲溶液的配制
通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。
思考：说出人体血液中缓冲对。
NaH2PO4 / Na2HPO4
H2CO3 / NaHCO3
由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。
调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。
1、概念：指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。
思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）
2、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。
聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶
琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。
测定（ ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳
为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。
聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸带负电荷，在电场中向正极移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以用在对PCR扩增效果的鉴定上。
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3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少 B 分子的大小C 肽链的多少 D 分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节pH B 维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长 D 防止血液凝固
5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀
基础试题训练1. 凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（ ） A. 对其他分子的亲和力 B. 溶解度 C. 所带电荷多少 D. 相对分子质量的大小2. 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是 A. 糖类化合物 B. 脂质 C. 蛋白质 D. 核酸3. 选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处 A. 血红蛋白是有色蛋白 B. 红细胞无细胞核 C. 红细胞蛋白质含量高 D. 红细胞 DNA含量高
4. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ）A. 甲苯 B. 血红蛋白水溶液C. 脂溶性物质的沉淀层 D. 其他杂质的沉淀5. 血红蛋白因含有（ ）而呈红色A. O2 B. CO C. CO2 D.血红素6. 下列操作正确的是（ ）A. 分离红细胞时采用低速长时间离心B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心D. 透析时要用20mml/l的磷酸缓冲液，透析12h
7. 样品的加入和洗脱的叙述正确的是（ ） A. 先加入1ml透析后的样品 B. 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出 C. 如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功 D. 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水8. 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ） A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
9. 凝胶色谱法操作正确的是（ ） A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 B. 将橡皮塞下部切出凹穴 C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片10. 样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ） A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
11. 下列说法不正确的是（ ） A. 血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，充分搅拌 B. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体 C. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物 D. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液
12. 分离血红蛋白溶液时，将混合液离心后可看到试管中的液体分为4层：第一层为______，第二层为______固体，第三层是______的溶液，第四层是其他杂质的______沉淀物。
13. 红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题： （1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：______、______、______和______。
（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。 ①加入柠檬酸钠的目的是__________________。 ②以上所述的过程即是样品处理，包括______、______、收集血红蛋白溶液。（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。①透析的目的是__________________。②透析的原理是______________________________。。
去除分子质量较小的杂质
透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内
4.然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。①样品纯化的目的是______________________________。②血红蛋白有什么特点？__________。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？
通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去
在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
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