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2025届高考 一轮复习 浙科版 微生物的培养、分离与纯化 课件(浙江版)
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这是一份2025届高考 一轮复习 浙科版 微生物的培养、分离与纯化 课件(浙江版)，共60页。PPT课件主要包含了本单元内容索引等内容，欢迎下载使用。
3.1 获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础3.1.1 阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提3.1.2 阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术3.1.3 举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物3.1.4 概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法3.1.5 概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法3.2 发酵工程为人类提供多样的生物产品3.2.1 举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的3.2.2 阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品3.2.3 举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值
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第1讲 微生物的培养、分离与纯化第2讲 发酵工程及其应用
第1讲 微生物的培养、分离与纯化
精读课本 盘点基础知识
一、微生物的培养需要适宜条件1．培养基为目标微生物提供适宜的生长环境(1)培养基的概念：人们为满足微生物________或____________的需求而配制的混合养料。(2)培养基的用途：用于菌种的培养、____、鉴定、____微生物或积累其代谢物。(3)培养基的成分
(5)几种微生物的营养和能量来源
(4)培养基配制的基本原则①“__________________”，细菌培养基中要含有较高的有机氮，因此常用______和__________等来配制；霉菌培养基一般用__________加无机物配制，或用添加蔗糖的______等配制。②细菌通常要求在________的环境中生长，霉菌要求在________的环境中生长。
(6)培养基的类型①按物理状态分类
2．灭菌与无菌操作技术可以排除非目标微生物的干扰(1)目的：防止非目标微生物的污染，获得纯净的培养物。(2)灭菌与消毒的比较
[注意点] (1)选择无菌技术的原则：①要考虑无菌技术的效果，灭菌的效果比消毒要好；②要考虑操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。(2)其他操作：①做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触；②为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
二、纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得1．采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化(1)接种：是指微生物进入培养基质的过程。(2)单菌落：在固体培养基上采用____或________的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这样的细胞集团称为______。(3)平板划线法①连续平行划线是从培养基上的一点出发，向左右连续划______至覆盖整个培养基表面(如图A)。②扇形划线是从培养基上的一点出发，向______________，每划一条线都要将______在酒精灯的火焰上灭菌，然后再次从________变换方向划线(如图B)。
A．连续平行划线 B．扇形划线
③多次连续平行划线接种时，划线可分_______进行。将培养皿旋转一定角度后，____再次蘸取菌种，只需在上一次划线的________直接开始划线即可。具体操作如下：
[注意点] (1)每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。(2)灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。(3)在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。(4)划线时最后一区域不要与第一区域相连。(5)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(4)稀释涂布平板法①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
2．活动：配制可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基与接种、培养并分离酵母菌配制培养基：称取去皮的马铃薯20 g、切块→加水100 mL、加热煮沸10 min→纱布过滤到500 mL三角瓶中→加2 g蔗糖→用蒸馏水定容至所需体积 ↓制备液体培养基：将部分上述马铃薯浸汁分装到2个50 mL三角瓶中，每瓶约20 mL制备斜面培养基：加入所需量的琼脂到上述500 mL的三角瓶中，加热融化后，用漏斗分装到2支试管中，每支5～8 mL制备固体培养基：将剩余的培养基分装到250 mL三角瓶中 ↓
[注意点] (1)接种、培养并分离酵母菌时要注意①培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。②要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。③倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
④平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。⑤在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。⑥整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
(2)配制酵母菌的马铃薯蔗糖培养基时要注意①制作斜面培养基和固体培养基时要注意控制好温度，防止培养基提前凝固。②斜面培养基试管中的液体量约为试管长度的1/4。③培养基需要经高压蒸汽灭菌(1 kg/cm2、121 ℃下灭菌20 min)。④棉塞的长度要保证既塞住瓶口，在瓶口外又要留有一定的长度，方便在接种时用无名指、小拇指取下来；棉塞粗细也要适当，以不易脱落为度。⑤制作棉塞应该使用普通棉花，不能使用医用的脱脂棉，防止脱脂棉吸水后引起污染。
3．稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量(1)显微镜直接计数法①结构：常用的是1 mm×1 mm×0.1 mm方格的计数板(如图)。每个计数板上有__个计数区，每个计数区上刻有9个大方格，其中只有正中间的大方格为____________，大方格的长和宽各为1 mm，深度为0.1 mm，其容积为________；大方格内分为25(或16)个中方格，每个中方格又分为16(或25)个小方格，即大方格是由400个小方格组成。
②操作：将清洁干燥的血细胞计数板的计数区上加盖专用的______，再用吸管在中央平台盖玻片边缘滴加____(计数准确)的酵母菌悬液，让菌液____盖玻片下直至充满计数区。③计数：在显微镜下计数__个中方格(16×25型)或__个中方格(25×16型)内的菌体数，求出每个小方格所含有细菌的平均数，按照以下公式计算：每毫升原液含有的菌数＝每个小方格平均细菌数×400×104×稀释倍数。
[注意点] (1)滴加菌液要避免菌液滴到盖玻片上并防止产生气泡，以免影响计数结果。(2)对有25个中方格的红细胞计数区可采用“五点取样”对酵母细胞进行计数。(3)在计数每一小方格中的细胞数时，为了避免重复计数压在小方格边缘线上细胞的数目，应“数上不数下”“数左不数右”。(4)为了保证结果的可信度，消除误差，应对同一红细胞计数区中的细胞数进行3次计数后取平均值，再按比例进行换算。
(2)间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)保证计数准确的做法：一是在保证能准确计数的前提下____稀释度；二是将____稀释度下的多组数值取______后再进行计算。即：每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少___培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×________。
[注意点] (1)要设置对照实验，且一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。(2)计数时机：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。(3)用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞形成的菌落连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。另外，还有可能有少数菌体粘在涂布器上，未接种到平板上。
(2)实验流程①制备培养基：(配制)100 mL _______培养基和100 mL ________培养基 ↓②灭菌：试管、三角瓶：121 ℃下灭菌15 min；尿素溶液：________________除菌 ↓③倒平板 ↓④制备______________ ↓
[注意点](1)尿素固体培养基中琼脂糖替代琼脂的原因：琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，可能为细菌生长提供氮源，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。(2)培养基中各种物质并不都是通过高压蒸汽灭菌法进行灭菌的，如尿素遇高温会分解，所以需进行过滤除菌，然后加入经高压蒸汽灭菌的培养基中。(3)取样的地点最好选择尿素含量丰富的区域，如哺乳动物经常排泄的区域。(4)土样必须用无菌水进行稀释，否则无法判断最后菌种来源于未灭菌的水还是土壤。
(5)每次稀释前，试管需进行充分振荡处理，目的是使菌体分布均匀，取上清液1 mL，转移至盛有9 mL 无菌水的试管中(土壤中一般为好氧菌)。(6)尿素固体培养基中若形成菌落，无法说明活动成功，因为有些固氮菌能直接利用空气中的氮气进行繁殖，最后形成菌落，所以还需观察菌落周围是否出现红色区域。(7)若培养基中出现5个带有红色区域的菌落，不能说明都是同一种微生物，可能是5种微生物，但都能合成脲酶，分解尿素。
内化知识 突破重点难点
一、两种纯化方法的比较
例1 (2023·山东等级考)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是( )A．不含氮源的平板不能用于微生物培养B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物[解析] 不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。
例2 (2022·浙江6月选考)回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：(1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用______________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80 ℃的_______________中保温一段时间，其目的是_____________________。(2)为提高筛选效率，可将菌种的__________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用__________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。(3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过__________后再筛选获得，或利用转基因、______________等技术获得。
二、两种计数方法的比较
例3 (2021·浙江6月选考)下列关于原生质体和细胞计数的叙述，错误的是( )A．测定植物原生质体的密度时，可用血细胞计数板B．红墨水不能进入活细胞，可用于检测细胞的存活状态并计数C．涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落，都可用于细胞计数D．酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度[解析] 可用血细胞计数板对原生质体进行计数，A正确；活细胞的细胞膜具有选择透过性，红墨水中的色素分子不能透过细胞膜，当细胞死亡后，细胞膜失去选择透过性，红墨水中的色素分子能进入细胞，所以可用红墨水检测细胞的存活状态并计数，B正确；划线分离法不能用于细胞计数，C错误；酵母菌的密度与浑浊度指标存在一定的数量关系，所以酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度，D正确。
三、微生物的筛选与鉴别1．微生物的鉴别方法(1)菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、颜色、光泽度、隆起程度等特征进行鉴别。(2)指示剂鉴别法：如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。(3)染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。
2．筛选微生物的三种方法(1)单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目标微生物。(2)选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，淘汰非目标微生物，直接获得目标微生物。(3)鉴定培养法：利用鉴别培养基使目标微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目标微生物。
3．选择培养基四种常见制备方法或实例
例4 (2020·浙江7月选考)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是( )A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pHC．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒D．适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化[解析] 利用尿素固体培养基，由于不能利用尿素的微生物无法存活，而保留利用尿素的微生物，并非杀死，A错误；不同的微生物所需的pH不同，所以配置培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH，B正确；酵母菌不能直接利用淀粉，利用糯米酿酒需要先进行糖化，再用酵母菌发酵得到糯米酒，C正确；醋化醋杆菌在有氧条件下利用酒精产生醋酸，D正确。
延伸迁移 实现融会贯通
考向1 结合培养基的配制和无菌技术，考查科学思维素养1．(2023·四川成都石室中学校考模拟预测)微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，以防止杂菌污染，请分析下列操作，错误的是( )①煮沸消毒可以杀死微生物的细胞和部分芽孢②接种操作要在酒精灯火焰附近进行 ③培养基要进行高压蒸汽灭菌 ④加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌 ⑤紫外线消毒可以对接种室、超净工作台和操作人员进行消毒，以杀死物体表面或者空气中的微生物⑥在接种过程中，试管口、瓶口等易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌A．①② B．⑤⑥ C．③⑤ D．④⑤
D [①100 ℃煮沸5～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢，①正确；②酒精灯火焰附近存在一个无菌区，为了无菌操作，接种操作要在酒精灯火焰附近进行，②正确；③培养基的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，该方法应注意将压力达到预定要求，③正确；④指示剂和染料混有微生物，故加入培养基前需灭菌，④错误；⑤接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线消毒，但不能对操作人员进行紫外线消毒，⑤错误；⑥将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌，⑥正确。综上所述，错误的是④⑤。A、B、C不符合题意，D符合题意。]
2．高压蒸汽灭菌是避免杂菌污染的重要方法。下列常采用该法进行灭菌的是( )A．家庭制作泡菜所用的蔬菜B．添加血清的动物细胞培养液C．MS培养基D．用于获得原生质体的酶解液C [家庭制作泡菜利用的是蔬菜表面的微生物，不能用高压蒸汽灭菌，A错误；动物细胞培养液先用高压蒸汽灭菌，再添加血清，B错误；MS培养基通常用高压蒸汽灭菌，C正确；酶经高压蒸汽灭菌会失活，D错误。]
3．某科研小组尝试从自然发酵的泡菜中分离纯化优良乳酸菌，并对其进行产酸能力、生长能力和亚硝酸盐降解能力的测定，以挑选最优菌种。下表为该小组制作的提取分离乳酸菌的培养基配方，其中溴甲酚绿遇酸变黄。
请回答下列问题：(1)配制该培养基，除表中的成分外还需添加2 g 的_______；添加碳酸钙除了方便观察是否产酸，还可以产生CO2，以维持培养基______的稳定。
(2)初步筛选：应用_________________________法进行分离，挑选出______的菌落作为初筛菌，再分别挑取其中形态大小各不相同的菌落进行菌种纯化；最终获得若干个不同的菌种用于后续测定。(3)生长能力和亚硝酸盐降解能力的测定：光电比色法可用于细菌细胞密度的测定，OD600指的是某种溶液在600 nm波长处的吸光值。吸光值与溶液中吸光物质的浓度呈正比，通常用于细菌细胞密度(OD600)的测量。在无菌条件下将不同菌种分别接种至MRS—NaNO2的培养基中，37 ℃厌氧培养24 h。再将菌液_____，测定OD600值，OD600值相对较小的菌株生长能力_____。并通过测定发酵前后亚硝酸盐的含量，可以计算出__________________________。
稀释涂布平板(或平板划线)
菌种对亚硝酸盐的降解能力
考向2 结合微生物的培养、分离与纯化，考查科学思维素养4．(2023·湖州、衢州、丽水三地市高三教学质量检测)利用以尿素为唯一氮源的培养基，可从土壤中分离出能产脲酶的微生物。下列叙述错误的是( )A．需用无菌水制备和稀释土壤菌悬液B．培养基中加入酚红可起到鉴别作用C．尿素溶液用G6玻璃砂漏斗过滤除菌D．能在该培养基上生长的微生物均能产生脲酶D [土样必须用无菌水进行稀释，否则无法判断最后菌种来源于未灭菌的水还是土壤，A正确；由于尿素被分解后产生氨会使培养基的pH升高，因此培养基中加入酚红可起到鉴别作用，会显红色，B正确；尿素溶液需用高压蒸汽灭菌的G6玻璃砂漏斗过滤，用其过滤的原因是孔径小、细菌不能通过，便于除菌，C正确；能在该培养基上生长的微生物不一定能产生脲酶，比如能够利用空气中的氮气作为氮源的微生物也可以在上面生长，D错误。]
5．(2023·广东选择性考试)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是( )A．a点时取样、尿素氮源培养基B．b点时取样、角蛋白氮源培养基C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基D．c点时取样、角蛋白氮源培养基D [研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D正确，A、B、C错误。]
6．研究人员欲从土壤中筛选高淀粉酶活性的目标菌研究。回答下列问题：
图1 图2(1)在细菌筛选过程中，将土壤样品稀释液接种至__________________的固体培养基上进行培养，另外，该培养基还应含有氮源、水、无机盐、特殊生长因子和_____________。(2)微生物菌种纯化时，为得到单菌落，最常用的两种接种方法是______________________________。
稀释涂布平板法和平板划线法
(3)从土壤中筛选目标菌时，加碘-碘化钾溶液染色后，平板上出现了A、B和C三种菌落(如图1所示)。如果要得到淀粉酶活力最高的菌株，应该选择_____(填“A”“B”或“C”)菌落进一步纯化。A菌落经检测为硝化细菌，据此说明A菌落能在此培养基上生长且没有形成透明圈的原因是_________________________________________________________________________________。(4)经筛选获得了一菌株，能同时产三种不同的淀粉酶X、Y和Z，其相对分子量分别为45000、58000和37200。各种酶分子____________(写两点)或者所带电荷存在差异，因此可采用凝胶电泳分离它们。
硝化细菌为自养型细菌，
不能产生淀粉酶，但能够利用空气中的二氧化碳合成有机物
(5)最后选择了Z菌株，用于酿酒实验中糖化，“发酵”环节所用菌株为酵母菌，如图2中___________号试管为酵母菌在半固体培养基中培养后状态。酿酒工艺中“后处理”环节的一个重要工序是将酒样置于87 ℃保温30 min，目的是__________________________________________________________________。
杀死酒中微生物，防止发酵液中有机物的破坏和乙醇的流失，使酒更清亮
考向3 围绕微生物的纯化和计数，考查科学探究素养7．(2023·北京海淀统考二模)为探究抗生素对细菌的选择作用，将含抗生素的滤纸片放到接种了大肠杆菌的平板培养基上(如图)，一段时间后测量并记录抑菌圈的直径。从抑菌圈边缘的菌落上挑取细菌扩大培养，重复实验2～5次。下列叙述不正确的是( )A．接种时，将高浓度菌液涂布在平板培养基上B．①处滤纸片上不含抗生素，起对照作用C．重复2～5次实验后，抑菌圈的直径会变大D．抑菌圈边缘的菌落上挑取的细菌抗药性较强
C [将高浓度菌液涂布在平板培养基上，使平板上长出密集菌落，利于观察抑菌圈，A正确；①处滤纸片周围未出现抑菌圈，滤纸片上不含抗生素，起对照作用，B正确；随重复次数增加，抗药菌株的比例增加，抑菌圈的直径会变小，C错误；抑菌圈边缘的菌落可能是耐药菌，所以，抑菌圈边缘的菌落上挑取的细菌抗药性较强，D正确。]
8．(2023·杭州测试)如图为“能分解尿素的微生物的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是( )A．某一稀释度下至少涂布3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目少B．3号试管中的样品溶液稀释倍数为104倍C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个D．该实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基作对照，用以判断选择培养基是否有选择作用
C [设置重复组，增强实验的说服力与准确性，故某一稀释度下至少涂布3个平板，稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要少，A正确；据图可知，将10 g土样加入无菌水中定容至100 mL后，此时土样稀释倍数为10倍，再经3次10倍稀释得到3号试管中的样品，故3号试管中的样品溶液稀释倍数是104倍，B正确；5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3×106÷0.1＝1.7×109个，C错误；要判断选择培养基是否起到选择作用，需设置接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作对照，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落种类数目多于选择培养基上的菌落种类数目，则说明起到了选择作用，D正确。]
9．(2023·北京昌平统考二模)暹罗芽孢杆菌有望作为饲料发酵剂和添加剂应用于畜禽生产，以实现绿色健康养殖。(1)大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌(厌氧菌)能引起家禽和家畜的肠道疾病，常使用氨苄青霉素治疗。为检测暹罗芽孢杆菌代谢物的抑菌能力，实验过程如图1所示。Ⅰ、请完善实验过程：①________；②________。(填选项)a．37 ℃、200转/min、恒温培养箱b．37 ℃、200转/min、厌氧培养箱c．37 ℃、恒温培养箱d．37 ℃、厌氧培养箱e．上层清液f．下层沉淀
Ⅱ、该抑菌实验还需要设计________作为对照(填选项)。实验结果说明暹罗芽孢杆菌对三种病原菌有较好的抑菌活性，且不弱于氨苄青霉素。A．等量无菌水B．等量LB液体培养基C．等量FTG液体培养基D．等量含有氨苄青霉素的无菌水E．等量含有氨苄青霉素的LB液体培养基F．等量含有氨苄青霉素的FTG液体培养基
(2)研究者基于(1)的部分操作和检测方法，设计了如下表所示实验，发现暹罗芽孢杆菌具有较好的产酶能力。请任选一组完善下表中的实验设计。
加入碘液染色，观察有无透明圈
加入刚果红溶液，观察有无透明圈
3.1 获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础3.1.1 阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提3.1.2 阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术3.1.3 举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物3.1.4 概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法3.1.5 概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法3.2 发酵工程为人类提供多样的生物产品3.2.1 举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的3.2.2 阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品3.2.3 举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值
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第1讲 微生物的培养、分离与纯化第2讲 发酵工程及其应用
第1讲 微生物的培养、分离与纯化
精读课本 盘点基础知识
一、微生物的培养需要适宜条件1．培养基为目标微生物提供适宜的生长环境(1)培养基的概念：人们为满足微生物________或____________的需求而配制的混合养料。(2)培养基的用途：用于菌种的培养、____、鉴定、____微生物或积累其代谢物。(3)培养基的成分
(5)几种微生物的营养和能量来源
(4)培养基配制的基本原则①“__________________”，细菌培养基中要含有较高的有机氮，因此常用______和__________等来配制；霉菌培养基一般用__________加无机物配制，或用添加蔗糖的______等配制。②细菌通常要求在________的环境中生长，霉菌要求在________的环境中生长。
(6)培养基的类型①按物理状态分类
2．灭菌与无菌操作技术可以排除非目标微生物的干扰(1)目的：防止非目标微生物的污染，获得纯净的培养物。(2)灭菌与消毒的比较
[注意点] (1)选择无菌技术的原则：①要考虑无菌技术的效果，灭菌的效果比消毒要好；②要考虑操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。(2)其他操作：①做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触；②为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
二、纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得1．采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化(1)接种：是指微生物进入培养基质的过程。(2)单菌落：在固体培养基上采用____或________的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这样的细胞集团称为______。(3)平板划线法①连续平行划线是从培养基上的一点出发，向左右连续划______至覆盖整个培养基表面(如图A)。②扇形划线是从培养基上的一点出发，向______________，每划一条线都要将______在酒精灯的火焰上灭菌，然后再次从________变换方向划线(如图B)。
A．连续平行划线 B．扇形划线
③多次连续平行划线接种时，划线可分_______进行。将培养皿旋转一定角度后，____再次蘸取菌种，只需在上一次划线的________直接开始划线即可。具体操作如下：
[注意点] (1)每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。(2)灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。(3)在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。(4)划线时最后一区域不要与第一区域相连。(5)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(4)稀释涂布平板法①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
2．活动：配制可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基与接种、培养并分离酵母菌配制培养基：称取去皮的马铃薯20 g、切块→加水100 mL、加热煮沸10 min→纱布过滤到500 mL三角瓶中→加2 g蔗糖→用蒸馏水定容至所需体积 ↓制备液体培养基：将部分上述马铃薯浸汁分装到2个50 mL三角瓶中，每瓶约20 mL制备斜面培养基：加入所需量的琼脂到上述500 mL的三角瓶中，加热融化后，用漏斗分装到2支试管中，每支5～8 mL制备固体培养基：将剩余的培养基分装到250 mL三角瓶中 ↓
[注意点] (1)接种、培养并分离酵母菌时要注意①培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。②要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。③倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
④平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。⑤在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。⑥整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
(2)配制酵母菌的马铃薯蔗糖培养基时要注意①制作斜面培养基和固体培养基时要注意控制好温度，防止培养基提前凝固。②斜面培养基试管中的液体量约为试管长度的1/4。③培养基需要经高压蒸汽灭菌(1 kg/cm2、121 ℃下灭菌20 min)。④棉塞的长度要保证既塞住瓶口，在瓶口外又要留有一定的长度，方便在接种时用无名指、小拇指取下来；棉塞粗细也要适当，以不易脱落为度。⑤制作棉塞应该使用普通棉花，不能使用医用的脱脂棉，防止脱脂棉吸水后引起污染。
3．稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量(1)显微镜直接计数法①结构：常用的是1 mm×1 mm×0.1 mm方格的计数板(如图)。每个计数板上有__个计数区，每个计数区上刻有9个大方格，其中只有正中间的大方格为____________，大方格的长和宽各为1 mm，深度为0.1 mm，其容积为________；大方格内分为25(或16)个中方格，每个中方格又分为16(或25)个小方格，即大方格是由400个小方格组成。
②操作：将清洁干燥的血细胞计数板的计数区上加盖专用的______，再用吸管在中央平台盖玻片边缘滴加____(计数准确)的酵母菌悬液，让菌液____盖玻片下直至充满计数区。③计数：在显微镜下计数__个中方格(16×25型)或__个中方格(25×16型)内的菌体数，求出每个小方格所含有细菌的平均数，按照以下公式计算：每毫升原液含有的菌数＝每个小方格平均细菌数×400×104×稀释倍数。
[注意点] (1)滴加菌液要避免菌液滴到盖玻片上并防止产生气泡，以免影响计数结果。(2)对有25个中方格的红细胞计数区可采用“五点取样”对酵母细胞进行计数。(3)在计数每一小方格中的细胞数时，为了避免重复计数压在小方格边缘线上细胞的数目，应“数上不数下”“数左不数右”。(4)为了保证结果的可信度，消除误差，应对同一红细胞计数区中的细胞数进行3次计数后取平均值，再按比例进行换算。
(2)间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)保证计数准确的做法：一是在保证能准确计数的前提下____稀释度；二是将____稀释度下的多组数值取______后再进行计算。即：每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少___培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×________。
[注意点] (1)要设置对照实验，且一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。(2)计数时机：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。(3)用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞形成的菌落连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。另外，还有可能有少数菌体粘在涂布器上，未接种到平板上。
(2)实验流程①制备培养基：(配制)100 mL _______培养基和100 mL ________培养基 ↓②灭菌：试管、三角瓶：121 ℃下灭菌15 min；尿素溶液：________________除菌 ↓③倒平板 ↓④制备______________ ↓
[注意点](1)尿素固体培养基中琼脂糖替代琼脂的原因：琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，可能为细菌生长提供氮源，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。(2)培养基中各种物质并不都是通过高压蒸汽灭菌法进行灭菌的，如尿素遇高温会分解，所以需进行过滤除菌，然后加入经高压蒸汽灭菌的培养基中。(3)取样的地点最好选择尿素含量丰富的区域，如哺乳动物经常排泄的区域。(4)土样必须用无菌水进行稀释，否则无法判断最后菌种来源于未灭菌的水还是土壤。
(5)每次稀释前，试管需进行充分振荡处理，目的是使菌体分布均匀，取上清液1 mL，转移至盛有9 mL 无菌水的试管中(土壤中一般为好氧菌)。(6)尿素固体培养基中若形成菌落，无法说明活动成功，因为有些固氮菌能直接利用空气中的氮气进行繁殖，最后形成菌落，所以还需观察菌落周围是否出现红色区域。(7)若培养基中出现5个带有红色区域的菌落，不能说明都是同一种微生物，可能是5种微生物，但都能合成脲酶，分解尿素。
内化知识 突破重点难点
一、两种纯化方法的比较
例1 (2023·山东等级考)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是( )A．不含氮源的平板不能用于微生物培养B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物[解析] 不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。
例2 (2022·浙江6月选考)回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：(1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用______________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80 ℃的_______________中保温一段时间，其目的是_____________________。(2)为提高筛选效率，可将菌种的__________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用__________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。(3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过__________后再筛选获得，或利用转基因、______________等技术获得。
二、两种计数方法的比较
例3 (2021·浙江6月选考)下列关于原生质体和细胞计数的叙述，错误的是( )A．测定植物原生质体的密度时，可用血细胞计数板B．红墨水不能进入活细胞，可用于检测细胞的存活状态并计数C．涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落，都可用于细胞计数D．酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度[解析] 可用血细胞计数板对原生质体进行计数，A正确；活细胞的细胞膜具有选择透过性，红墨水中的色素分子不能透过细胞膜，当细胞死亡后，细胞膜失去选择透过性，红墨水中的色素分子能进入细胞，所以可用红墨水检测细胞的存活状态并计数，B正确；划线分离法不能用于细胞计数，C错误；酵母菌的密度与浑浊度指标存在一定的数量关系，所以酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度，D正确。
三、微生物的筛选与鉴别1．微生物的鉴别方法(1)菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、颜色、光泽度、隆起程度等特征进行鉴别。(2)指示剂鉴别法：如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。(3)染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。
2．筛选微生物的三种方法(1)单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目标微生物。(2)选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，淘汰非目标微生物，直接获得目标微生物。(3)鉴定培养法：利用鉴别培养基使目标微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目标微生物。
3．选择培养基四种常见制备方法或实例
例4 (2020·浙江7月选考)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是( )A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pHC．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒D．适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化[解析] 利用尿素固体培养基，由于不能利用尿素的微生物无法存活，而保留利用尿素的微生物，并非杀死，A错误；不同的微生物所需的pH不同，所以配置培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH，B正确；酵母菌不能直接利用淀粉，利用糯米酿酒需要先进行糖化，再用酵母菌发酵得到糯米酒，C正确；醋化醋杆菌在有氧条件下利用酒精产生醋酸，D正确。
延伸迁移 实现融会贯通
考向1 结合培养基的配制和无菌技术，考查科学思维素养1．(2023·四川成都石室中学校考模拟预测)微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，以防止杂菌污染，请分析下列操作，错误的是( )①煮沸消毒可以杀死微生物的细胞和部分芽孢②接种操作要在酒精灯火焰附近进行 ③培养基要进行高压蒸汽灭菌 ④加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌 ⑤紫外线消毒可以对接种室、超净工作台和操作人员进行消毒，以杀死物体表面或者空气中的微生物⑥在接种过程中，试管口、瓶口等易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌A．①② B．⑤⑥ C．③⑤ D．④⑤
D [①100 ℃煮沸5～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢，①正确；②酒精灯火焰附近存在一个无菌区，为了无菌操作，接种操作要在酒精灯火焰附近进行，②正确；③培养基的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，该方法应注意将压力达到预定要求，③正确；④指示剂和染料混有微生物，故加入培养基前需灭菌，④错误；⑤接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线消毒，但不能对操作人员进行紫外线消毒，⑤错误；⑥将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌，⑥正确。综上所述，错误的是④⑤。A、B、C不符合题意，D符合题意。]
2．高压蒸汽灭菌是避免杂菌污染的重要方法。下列常采用该法进行灭菌的是( )A．家庭制作泡菜所用的蔬菜B．添加血清的动物细胞培养液C．MS培养基D．用于获得原生质体的酶解液C [家庭制作泡菜利用的是蔬菜表面的微生物，不能用高压蒸汽灭菌，A错误；动物细胞培养液先用高压蒸汽灭菌，再添加血清，B错误；MS培养基通常用高压蒸汽灭菌，C正确；酶经高压蒸汽灭菌会失活，D错误。]
3．某科研小组尝试从自然发酵的泡菜中分离纯化优良乳酸菌，并对其进行产酸能力、生长能力和亚硝酸盐降解能力的测定，以挑选最优菌种。下表为该小组制作的提取分离乳酸菌的培养基配方，其中溴甲酚绿遇酸变黄。
请回答下列问题：(1)配制该培养基，除表中的成分外还需添加2 g 的_______；添加碳酸钙除了方便观察是否产酸，还可以产生CO2，以维持培养基______的稳定。
(2)初步筛选：应用_________________________法进行分离，挑选出______的菌落作为初筛菌，再分别挑取其中形态大小各不相同的菌落进行菌种纯化；最终获得若干个不同的菌种用于后续测定。(3)生长能力和亚硝酸盐降解能力的测定：光电比色法可用于细菌细胞密度的测定，OD600指的是某种溶液在600 nm波长处的吸光值。吸光值与溶液中吸光物质的浓度呈正比，通常用于细菌细胞密度(OD600)的测量。在无菌条件下将不同菌种分别接种至MRS—NaNO2的培养基中，37 ℃厌氧培养24 h。再将菌液_____，测定OD600值，OD600值相对较小的菌株生长能力_____。并通过测定发酵前后亚硝酸盐的含量，可以计算出__________________________。
稀释涂布平板(或平板划线)
菌种对亚硝酸盐的降解能力
考向2 结合微生物的培养、分离与纯化，考查科学思维素养4．(2023·湖州、衢州、丽水三地市高三教学质量检测)利用以尿素为唯一氮源的培养基，可从土壤中分离出能产脲酶的微生物。下列叙述错误的是( )A．需用无菌水制备和稀释土壤菌悬液B．培养基中加入酚红可起到鉴别作用C．尿素溶液用G6玻璃砂漏斗过滤除菌D．能在该培养基上生长的微生物均能产生脲酶D [土样必须用无菌水进行稀释，否则无法判断最后菌种来源于未灭菌的水还是土壤，A正确；由于尿素被分解后产生氨会使培养基的pH升高，因此培养基中加入酚红可起到鉴别作用，会显红色，B正确；尿素溶液需用高压蒸汽灭菌的G6玻璃砂漏斗过滤，用其过滤的原因是孔径小、细菌不能通过，便于除菌，C正确；能在该培养基上生长的微生物不一定能产生脲酶，比如能够利用空气中的氮气作为氮源的微生物也可以在上面生长，D错误。]
5．(2023·广东选择性考试)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是( )A．a点时取样、尿素氮源培养基B．b点时取样、角蛋白氮源培养基C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基D．c点时取样、角蛋白氮源培养基D [研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D正确，A、B、C错误。]
6．研究人员欲从土壤中筛选高淀粉酶活性的目标菌研究。回答下列问题：
图1 图2(1)在细菌筛选过程中，将土壤样品稀释液接种至__________________的固体培养基上进行培养，另外，该培养基还应含有氮源、水、无机盐、特殊生长因子和_____________。(2)微生物菌种纯化时，为得到单菌落，最常用的两种接种方法是______________________________。
稀释涂布平板法和平板划线法
(3)从土壤中筛选目标菌时，加碘-碘化钾溶液染色后，平板上出现了A、B和C三种菌落(如图1所示)。如果要得到淀粉酶活力最高的菌株，应该选择_____(填“A”“B”或“C”)菌落进一步纯化。A菌落经检测为硝化细菌，据此说明A菌落能在此培养基上生长且没有形成透明圈的原因是_________________________________________________________________________________。(4)经筛选获得了一菌株，能同时产三种不同的淀粉酶X、Y和Z，其相对分子量分别为45000、58000和37200。各种酶分子____________(写两点)或者所带电荷存在差异，因此可采用凝胶电泳分离它们。
硝化细菌为自养型细菌，
不能产生淀粉酶，但能够利用空气中的二氧化碳合成有机物
(5)最后选择了Z菌株，用于酿酒实验中糖化，“发酵”环节所用菌株为酵母菌，如图2中___________号试管为酵母菌在半固体培养基中培养后状态。酿酒工艺中“后处理”环节的一个重要工序是将酒样置于87 ℃保温30 min，目的是__________________________________________________________________。
杀死酒中微生物，防止发酵液中有机物的破坏和乙醇的流失，使酒更清亮
考向3 围绕微生物的纯化和计数，考查科学探究素养7．(2023·北京海淀统考二模)为探究抗生素对细菌的选择作用，将含抗生素的滤纸片放到接种了大肠杆菌的平板培养基上(如图)，一段时间后测量并记录抑菌圈的直径。从抑菌圈边缘的菌落上挑取细菌扩大培养，重复实验2～5次。下列叙述不正确的是( )A．接种时，将高浓度菌液涂布在平板培养基上B．①处滤纸片上不含抗生素，起对照作用C．重复2～5次实验后，抑菌圈的直径会变大D．抑菌圈边缘的菌落上挑取的细菌抗药性较强
C [将高浓度菌液涂布在平板培养基上，使平板上长出密集菌落，利于观察抑菌圈，A正确；①处滤纸片周围未出现抑菌圈，滤纸片上不含抗生素，起对照作用，B正确；随重复次数增加，抗药菌株的比例增加，抑菌圈的直径会变小，C错误；抑菌圈边缘的菌落可能是耐药菌，所以，抑菌圈边缘的菌落上挑取的细菌抗药性较强，D正确。]
8．(2023·杭州测试)如图为“能分解尿素的微生物的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是( )A．某一稀释度下至少涂布3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目少B．3号试管中的样品溶液稀释倍数为104倍C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个D．该实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基作对照，用以判断选择培养基是否有选择作用
C [设置重复组，增强实验的说服力与准确性，故某一稀释度下至少涂布3个平板，稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要少，A正确；据图可知，将10 g土样加入无菌水中定容至100 mL后，此时土样稀释倍数为10倍，再经3次10倍稀释得到3号试管中的样品，故3号试管中的样品溶液稀释倍数是104倍，B正确；5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3×106÷0.1＝1.7×109个，C错误；要判断选择培养基是否起到选择作用，需设置接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作对照，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落种类数目多于选择培养基上的菌落种类数目，则说明起到了选择作用，D正确。]
9．(2023·北京昌平统考二模)暹罗芽孢杆菌有望作为饲料发酵剂和添加剂应用于畜禽生产，以实现绿色健康养殖。(1)大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌(厌氧菌)能引起家禽和家畜的肠道疾病，常使用氨苄青霉素治疗。为检测暹罗芽孢杆菌代谢物的抑菌能力，实验过程如图1所示。Ⅰ、请完善实验过程：①________；②________。(填选项)a．37 ℃、200转/min、恒温培养箱b．37 ℃、200转/min、厌氧培养箱c．37 ℃、恒温培养箱d．37 ℃、厌氧培养箱e．上层清液f．下层沉淀
Ⅱ、该抑菌实验还需要设计________作为对照(填选项)。实验结果说明暹罗芽孢杆菌对三种病原菌有较好的抑菌活性，且不弱于氨苄青霉素。A．等量无菌水B．等量LB液体培养基C．等量FTG液体培养基D．等量含有氨苄青霉素的无菌水E．等量含有氨苄青霉素的LB液体培养基F．等量含有氨苄青霉素的FTG液体培养基
(2)研究者基于(1)的部分操作和检测方法，设计了如下表所示实验，发现暹罗芽孢杆菌具有较好的产酶能力。请任选一组完善下表中的实验设计。
加入碘液染色，观察有无透明圈
加入刚果红溶液，观察有无透明圈
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