高中生物人教版 (新课标)选修1《生物技术实践》课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段教案

专题5  DNA与蛋白质技术

课题5.2  多聚酶链式反应扩增DNA片段

一、【课题目标】

（一）知识与技能

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

   （二）过程与方法

　　在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件

（三）情感、态度与价值观

    通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神

二、【课题重点】

PCR的原理和PCR的基本操作

三、【课题难点】

  　PCR的原理

四、【教学方法】

    启发式教学

五、【教学工具】

    多媒体课件

六、【教学过程】

（一）引入新课

在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。

（二）进行新课

1．基础知识

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1．1细胞内DNA复制条件分析：

1．2细胞内DNA复制过程

（1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6）

核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）

由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。

DNA双螺旋结构的反向平行结构：

（2）DNA的复制过程:

解    旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

DNA聚合酶结合：

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。

［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？

DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。

［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。

1．3DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。

反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4．PCR的反应过程

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列） 

2．实验操作

2．1 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

2．2 实验操作步骤

2．3 按照PCR反应体系配方配制反应液；

（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

（3）将微量离心管放到PCR仪中；

（4）设置PCR仪的工作参数。

（5）DNA在PCR仪中大量扩增。

2．4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。

3．实验注意事项

3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

4．结果分析与评价

4．1反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

4．2将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

（三）课堂总结、点评

（四）实例探究

例1 在（    ）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开

     A. 10－20℃     B. 80－100℃      C. 20－30℃     D. 40－60℃

解析：蛋白质大多不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。

答案：B

例2 关于DNA的复制，下列叙述正确的是（    ）

A. DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5’端延伸DNA链

B. DNA复制不需要引物

C. 引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

D. DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸

解析：由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。

答案：C

☆综合应用

例3 下列有关PCR描述，不正确的是（    ）

A. 是一种酶促反应

B. 引物决定了扩增的特异性

C. 扩增产量按y＝（1＋X）n

D. 扩增对象是氨基酸序列

E. 扩增对象是DNA序列

解析：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原理，在引物的作用下使DNA聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量为y＝（1＋X）n，y代表DNA片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数，因此答案选D。

答案：D

（五）巩固练习

1．DNA分子复制时，解旋的两条链中（   ）

A仅一条作为复制模板  

B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子

C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子

D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子

2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是（   ）

①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构

A①③④②⑤     B①④②⑤③     C①③⑤④②   D③①④②⑤

3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（   ）

①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录

A①②③④⑤     B①②③④      C①②③⑤     D①③④⑤

4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（   ）

①酶②游离的脱氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度

A①②③④⑤⑥    B②③④⑤⑥⑦      C②③④⑤⑦⑧    D①②③④⑦⑧

5.利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（   ）

A  2        B   4        C    8       D   16，

6.关于DNA分子的叙述中，正确的是（   ）

A .DNA的两条链是极性相同，同向平行    B.DNA的两条链是极性相同，反向平行

C.DNA的两条链中极性不同，反向平行的   D.DNA的两条链是极性不同，同向平行

7.假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（   ）

A   215          B   230       C    260     D   231

8.DNA的合成方向总是（   ）延伸。

A从DNA分子的左端向右端    B从DNA分子的右端向左端

C从子链的5，端向3，端         D从子链的3，端向5，端

9.要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（   ）

A 氧气的浓度    B酸碱度     C温度    D 大气的湿度

10.DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（   ）

A模板母链相同   B非模板母链相同  

C两条模板母链相同 D两条模板母链都不相同

答案： CDADA   CBCCB

七、【课余作业】

1、PCR与生物体DNA复制有何区别？

2、如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？

八、【教学体会】

教师在教学过程中，可以鲜引导学生回忆必修2的有关DNA复制的知识，在此基础上，学生可加深对于PCR原理的认识。对于PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。

九、【资料袋】

免疫-PCR

免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统.它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测.

免疫-PCR试验的主要步骤有三个:①抗原-抗体反应，②与嵌合连接分子结合，③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA).该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原.

免疫PCR优点为:①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.②敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测.③操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行.