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高中生物人教版 (2019)选择性必修3第1章 发酵工程第2节 微生物的培养技术及应用二 微生物的选择培养和计数学案设计
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这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3第1章 发酵工程第2节 微生物的培养技术及应用二 微生物的选择培养和计数学案设计，共14页。学案主要包含了选择培养基，微生物的选择培养，微生物的数量测定等内容，欢迎下载使用。
必备知识·夯实双基
一、选择培养基
1．概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2．实例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基以__尿素为唯一氮源__。
3．原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
二、微生物的选择培养
1．菌液稀释
(1)将10g土样加入盛有__90__mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，得到稀释10倍的菌液。
(2)取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，得到稀释102倍的菌液，依次等比稀释。
2．稀释涂布平板法的操作步骤
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
取菌液：用移液枪取0.1mL菌液，滴加到培养基表面
涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
涂布平板：用涂布器将__菌液__均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
3．待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d。
4．结果：在涂布有合适浓度菌液的平板上观察到分离的单菌落。
三、微生物的数量测定
1．常用方法：__稀释涂布平板法__和显微镜直接计数法。
2．稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目
(1)为了保证结果准确，同一稀释度下，应至少对3个平板，一般选择菌落数在__30～300，适于计数__的平板进行重复计数，并取平均值。
(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，因为__当两个或多个细胞连在一起时__，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
3．利用显微镜进行直接计数
(1)工具：特定的细菌计数板或血细胞计数板。
(2)统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
特别提醒：显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，因此一般用来统计总菌数。但是，通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成__脲酶__。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．操作步骤
(1)土壤取样
土壤中的微生物主要分布在距地表3～8cm的土壤层(酸碱度接近中性)，取样时用的铁铲和取样袋使用前都需要灭菌。
(2)样品的稀释
为保证获得菌落数为30～300的平板进行计数，可将稀释倍数为1×103～1×107的稀释液分别涂布到平板上培养。
(3)微生物的培养与观察
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。(放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7d；霉菌一般在25～28℃的温度下3～4d)在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目，选取__菌落数目稳定__时的记录作为结果。
┃┃学霸记忆__■
1．选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
3．为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
4．当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
5．统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
┃┃活学巧练__■
1．选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。(×)
2．用平板划线法培养计数，应选择菌落数在10～100的平板。(×)
3．统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。(×)
4．统计菌落数目的理论依据是一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。(√)
5．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。(×)
6．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿盖。(×)
思考：
1．要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
提示：应从富含纤维素的环境中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
2．根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？
提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。
3．为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数？
提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
4．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
课内探究·名师点睛
选择培养基与鉴别培养基
知识点
1．选择培养微生物的四种方法及其实例
知识贴士
能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌。原则上选择培养基只允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。
2．尿素分解菌的鉴定
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了NH3。NH3会使培养基的碱性增强，pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，则可初步说明该种细菌能够分解尿素。
3．鉴别培养基
(1)特点：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。
(2)用途：鉴别不同种类的微生物(如可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌。若有，菌落呈现深紫色)。
┃┃典例剖析__■
典例1 在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的苯酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出( C )
A．乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
B．固氮细菌、大肠杆菌、放线菌
C．固氮细菌、霉菌、放线菌
D．固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
解析：在缺乏氮源的选择培养基上可以筛选分离出固氮微生物，乳酸菌不属于固氮微生物，A不符合题意；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，在添加青霉素的选择培养基上可以筛选分离出真菌，而大肠杆菌和金黄色葡萄球菌属于细菌，不能在该培养基上生长，B、D不符合题意；加入10%的苯酚可以抑制细菌和霉菌的生长，此选择培养基可以筛选分离出放线菌。综上所述，C符合题意。
┃┃变式训练__■
1．下列培养基配方中，能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是( B )
A．②③B．③①
C．②④D．①④
解析：③中加入了20gNaCl，从而抑制了不耐盐微生物生长，促进了耐盐微生物的生长，属于选择培养基；①中加入伊红、亚甲蓝，只是使大肠杆菌菌落呈现深紫色，不会抑制其他微生物生长，属于鉴别培养基，B项正确。
知识点
微生物数量测定方法分析
1．微生物数量测定方法
微生物数量测定的常用方法有稀释涂布平板法、显微镜直接计数法等。二者的比较如下表所示：
知识贴士
稀释涂布平板法计数的几个注意事项
(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)要设置对照实验，且一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。
(3)计数时机：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
(4)用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
2．平板划线法与稀释涂布平板法的比较
┃┃典例剖析__■
典例2 下列有关稀释涂布平板法操作的叙述，不正确的是( C )
A．若稀释梯度以10倍为单位，当用移液管取1mL原始菌液进行稀释时，其余试管内的无菌水应为9mL
B．每次用灭菌后的移液管取菌液前，要先将菌液混匀
C．在涂布过程中，每次变换涂布的方向和位置时，应对涂布器进行灼烧灭菌
D．将菌液涂布在培养基表面时，为涂布均匀，应及时转动培养皿
解析：稀释梯度以10倍为单位时，如果溶液总量为10mL，需用移液管将1mL原始菌液移入盛有9mL无菌水的试管中，依次类推即可得到所需稀释倍数的菌液，A正确；每次用灭菌后的移液管取菌液前，要先将菌液混匀，B正确；在涂布前，先将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后冷却8～10s，用涂布器将菌液均匀涂布在培养基的表面，涂布结束后，应对涂布器进行灼烧灭菌，以防污染环境和感染操作者，C错误；涂布时，可转动培养皿，使菌液分布均匀，D正确。
┃┃变式训练__■
2．下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的描述不正确的是( C )
A．利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌
B．两种计数方法，其统计值与实际值相比，均有差异，但差异原因不同
C．两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D．当菌落数目稳定时，一般选取菌落在30～300的且差异不大的平板进行计数
解析：显微镜直接计数法只能看到细菌，无法区分死菌和活菌，A正确；稀释涂布平板法计数中，当多个细菌连在一起时，平板上观察到的往往是一个菌落，故而统计值比实际值小，显微镜直接计数法不能区分死菌和活菌，故测定的微生物数量往往大于实际的活菌数，因此两种计数方法的统计值与实际值相比均有差异，但差异原因不同，B正确；稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征，而不是微生物的形态特征，显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征，C错误；当菌落数目稳定时，一般选取菌落在30～300的且差异不大的平板进行计数，D正确。
知识点
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
1．实验设计流程
eq \x(土壤取样)(1)要求：富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤
(2)取样土层：距地表3～8cm的土壤层
eq \x(制备培养基)用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用以尿素为唯一氮源的培养基作为实验组，用来判断选择培养基是否具有选择作用
eq \x(样品的稀释)在酒精灯火焰旁称取10g土壤，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，振荡使土壤与水充分混合，将细菌分散，制成101倍土壤稀释液。用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍的土壤稀释液。依次类推，制成103、104、105、106、107倍的土壤稀释液
eq \x(涂布平板)
图中的1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；另外，还要有两个对照，即不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌
eq \x(培养与观察)将平板倒置于30～37℃温室中培养1～2d，每隔24h统计一次菌落数目
eq \x(菌落计数)当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。
3．结果分析与评价
┃┃典例剖析__■
典例3 从土壤中分离获得某种微生物的步骤是( B )
①土壤取样 ②梯度稀释 ③选择培养 ④涂布培养 ⑤筛选菌株
A．①②③④⑤ B．①③②④⑤
C．①②④③⑤D．①④②③⑤
解析：从土壤中分离获得某种微生物的步骤为：土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布培养→筛选菌株。
┃┃变式训练__■
3．(2022·烟台二中模拟)某生物兴趣小组尝试对土壤中分解尿素的细菌进行分离并计数，相关叙述正确的是( D )
A．制备选择培养基时，需加入尿素、琼脂、葡萄糖、硝酸盐等物质
B．用活菌计数法统计结果，活菌的实际数目往往比统计的菌落数低
C．脲酶将尿素分解成氨使培养基的pH降低，加入酚红指示剂后变红
D．测定土壤中细菌的数目，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板培养
解析：分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要添加尿素(唯一的氮源)、琼脂(凝固剂)、葡萄糖(提供碳源)，尿素给分解尿素的细菌提供氮源，不需要加硝酸盐，A错误；用活菌计数法统计结果时，有的活菌在培养过程中会死亡，而有的菌落是由两个或多个活菌连在一起形成的，统计的菌落数比实际值偏小，故活菌的实际数目往往比统计的菌落数高，B错误；脲酶将尿素分解成氨使培养基的pH升高，加入酚红指示剂后变红，C错误；土壤中细菌的含量比较多，测定土壤中细菌的数目，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板培养，D正确。
指点迷津·拨云见日
不能理解“多次划线”与“逐步稀释分散成单菌落”的关系
平板划线法中通过“多次划线”操作，达到“逐步稀释分散成单个菌落”的结果。具体分析如下：
(1)通过每次划线稀释菌种，线条末端菌体数少于线条首端。
(2)每次划线前灼烧接种环，杀死接种环上的微生物，保证下一次划线的菌种来自上一次划线的末端。再次通过划线稀释菌种，依次类推，得到单个菌落。
┃┃典例剖析__■
典例4 下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的划线操作。下列叙述中错误的是( C )
A．甲图中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂菌液
B．甲、乙两图的操作中只有甲可以用于微生物的计数
C．乙图中接种环需要灼烧5次
D．乙图中连续划线的起点是上一次划线的末端
解析：甲图中采用了稀释涂布平板法，涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂菌液，A项正确；乙图的操作对应平板划线法，无法用于微生物的计数，B项正确；乙图平板中划了5个区域，因此操作过程中接种环需要灼烧6次，C项错误；乙图中每次划线的起点是上一次划线的末端，D项正确。
解疑答惑
思考·讨论⇨P16
1．提示：培养基的配方中应含有微生物生长所需的营养要素——碳源、氮源、水、无机盐等。由于绝大多数微生物都能利用葡萄糖，分解尿素的细菌也能利用葡萄糖，因此可以用葡萄糖作为碳源，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，在培养基中加入尿素为唯一氮源，使培养基具有了选择作用。该培养基以尿素作为唯一氮源，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。
2．提示：该培养基与普通培养基相比较，共同点是都以有机碳(如葡萄糖)作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。
探究·实践⇨P18
结果分析与评价
1．提示：对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
2．提示：如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
3．提示：如果选取的是同一种土样，统计的结果应该接近，如果相差太大，可能培养基污染或混入了其他含氮物质，也可能是操作失误。
进一步探究
提示：由于细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。因此，可通过检测培养基中pH的变化来判断该反应是否发生。鉴定方法可以在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某细菌后，若pH升高，指示剂将变红，从而鉴定该细菌能分解尿素。
到社会中去⇨P20
提示：教材中几个实验都可采用稀释涂布平板法进行活菌计数，实验流程相似，大致都可分为以下几个步骤：
在相应环境中取样→制备培养基→梯度稀释与涂布平板→培养与观察→菌落计数。在对照实验设置方面，都需要设置一个未接种的普通培养基作为对照，以检测培养基是否被杂菌污染。第4个实验由于是土壤中真菌的分离与计数，可能要用到选择培养基，所以还需设置一个接种的普通培养基作对照，以检测选择培养基是否有选择作用。
练习与应用⇨P20
一、概念检测
1．(1)√
(2)√
(3)√
2．D
二、拓展应用
1．提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
2．(1)提示：首先进行土壤取样。在富含纤维素的潮湿土壤中用无菌小铁铲铲去表层土，迅速铲取土样，装入无菌信封内密封。其次，进行选择培养。将土壤稀释液接种到选择培养基中进行培养，以增加纤维素分解菌的浓度。然后进行梯度稀释，将稀释后的样品涂布到鉴别纤维素分解菌的固体培养基上，在培养的过程中，纤维素分解菌产生纤维素酶，将纤维素分解成纤维二糖、葡萄糖。这些产物不能与刚果红结合形成红色复合物，在培养基上就形成了以纤维素分解菌为中心的透明圈，用接种环或接种针挑选产生透明圈的菌落就是纤维素分解菌的菌落。
(2)提示：打算到富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌。因为根据生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。
(3)提示：这一做法可行，通过人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境，使纤维素分解菌聚集。滤纸富含纤维素，将滤纸埋在土壤中，纤维素分解菌就会在滤纸上聚集，分解纤维素，可以从腐烂滤纸中筛选纤维素分解菌。
训练巩固·课堂达标
1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( C )
注：“＋”表示加入，“－”表示不加
解析：分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有碳源，且以尿素作为唯一的氮源，故不能添加硝酸盐。
2．测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是( C )
A．细菌个体小，真菌个体大B．细菌易稀释，真菌不易稀释
C．细菌在土壤中数量比真菌多D．随机的，没有原因
解析：土壤中的微生物大约70%～90%是细菌，真菌的数量要比细菌少。样品的稀释度越高，在平板上生成的菌落数目就越少。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，适于平板计数，所以细菌的稀释倍数要高于真菌的稀释倍数。综上分析，C项正确。
3．选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是( D )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
解析：不含有机物的培养基可以选择自养微生物，缺少氮元素的培养基可以选择固氮微生物，含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。
4．(不定项)(2022·山东日照高三期末)屠宰场废弃血污不经过处理直接排放，会对环境造成污染。传统的处理方法有填埋法和焚烧法等。填埋法易造成地表环境、地下水资源污染。焚烧法处理也会造成大气污染，且废弃物中所含的蛋白资源不能得到有效利用。研究人员以屠宰场血污堆积土壤为分离基质，利用血平板培养基(添加了动物血液)，分离出了高效降解血红蛋白的菌株，并初步用于降解废弃血液、生产氨基酸液态肥料。下列叙述正确的是( ACD )
A．上述菌株分离、纯化过程中用到了稀释涂布平板法和平板划线法
B．对分离、纯化得到的菌株培养后进行计数，只能采用稀释涂布平板法
C．平板培养基上添加了动物血液，透明圈大的菌落分泌的蛋白酶的活性往往较高
D．利用该菌株降解废弃血液可在保护环境的同时实现资源的可持续利用
解析：根据题图中培养皿上的菌落可知，分离、纯化过程中先后用到了稀释涂布平板法和平板划线法，A项正确；对分离、纯化得到的菌株培养后进行计数，除了采用稀释涂布平板法，还可以用显微镜直接计数法，B项错误；平板培养基上添加了动物血液，能降解血红蛋白的菌株周围会出现透明圈，且透明圈大的菌落分泌的蛋白酶的活性往往较高，C项正确；根据题干信息可知，利用该菌株可降解废弃血液，同时生产氨基酸液态肥料，可在保护环境的同时实现资源的可持续利用，D项正确。
选择培养原理
具体处理
分离菌种
利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养
不加含碳有机物的无碳培养基
分离自养型微生物
无氮培养基
分离自生固氮微生物
利用微生物(目的菌)对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者
石油作为唯一碳源的培养基
分离能消除石油污染的微生物
尿素作为唯一氮源的培养基
分离能分解尿素的微生物
在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长
加入青霉素等抗生素
分离酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌、放线菌的生长
加入高浓度的食盐
分离金黄色葡萄球菌
在高盐环境中
可分离耐盐菌，其他菌在高盐浓度下易失水而不能生存
在高温环境中
可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存
原料
①
②
③
④
蛋白胨
10g
10g
10g
10g
乳糖
5g
5g
5g
5g
蔗糖
5g
5g
5g
5g
K2HPO4
2g
2g
2g
2g
伊红
0.4g
亚甲蓝
0.065g
琼脂
10g
20g
NaCl
20g
蒸馏水
1000mL
1000mL
1000mL
1000mL
项目
显微镜直接计数法
稀释涂布平板法(间接计数法)
原理
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计数一定容积的样品中微生物的数量
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌
主要用具
显微镜、细菌计数板(或血细胞计数板)
培养基
计数数据
菌体本身
培养基上的菌落数
优点
计数方便、操作简单
计数的是活菌
缺点
死菌、活菌都计算在内
操作较复杂，有一定误差
计算公式
每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10000×稀释倍数
每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
工具
接种环
涂布器
分离
单菌
落的
原理
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落
特点
可以分离得到单菌落，且操作简单，但不宜计数
可以分离得到单菌落，可以计数，但操作复杂
稀释度
104
105
106
107
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
菌落数/平板
内容
现象
结论
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
选择培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高
培养基中混入其他氮源
选择培养基
的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
样品的稀
释操作
得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
选项
尿素
琼脂
葡萄糖
硝酸盐
A
＋
＋
＋
＋
B
－
－
－
－
C
＋
＋
＋
－
D
＋
－
－
＋
必备知识·夯实双基
一、选择培养基
1．概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2．实例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基以__尿素为唯一氮源__。
3．原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
二、微生物的选择培养
1．菌液稀释
(1)将10g土样加入盛有__90__mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，得到稀释10倍的菌液。
(2)取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，得到稀释102倍的菌液，依次等比稀释。
2．稀释涂布平板法的操作步骤
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
取菌液：用移液枪取0.1mL菌液，滴加到培养基表面
涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
涂布平板：用涂布器将__菌液__均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
3．待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d。
4．结果：在涂布有合适浓度菌液的平板上观察到分离的单菌落。
三、微生物的数量测定
1．常用方法：__稀释涂布平板法__和显微镜直接计数法。
2．稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目
(1)为了保证结果准确，同一稀释度下，应至少对3个平板，一般选择菌落数在__30～300，适于计数__的平板进行重复计数，并取平均值。
(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，因为__当两个或多个细胞连在一起时__，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
3．利用显微镜进行直接计数
(1)工具：特定的细菌计数板或血细胞计数板。
(2)统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
特别提醒：显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，因此一般用来统计总菌数。但是，通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成__脲酶__。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．操作步骤
(1)土壤取样
土壤中的微生物主要分布在距地表3～8cm的土壤层(酸碱度接近中性)，取样时用的铁铲和取样袋使用前都需要灭菌。
(2)样品的稀释
为保证获得菌落数为30～300的平板进行计数，可将稀释倍数为1×103～1×107的稀释液分别涂布到平板上培养。
(3)微生物的培养与观察
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。(放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7d；霉菌一般在25～28℃的温度下3～4d)在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目，选取__菌落数目稳定__时的记录作为结果。
┃┃学霸记忆__■
1．选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
3．为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
4．当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
5．统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
┃┃活学巧练__■
1．选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。(×)
2．用平板划线法培养计数，应选择菌落数在10～100的平板。(×)
3．统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。(×)
4．统计菌落数目的理论依据是一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。(√)
5．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。(×)
6．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿盖。(×)
思考：
1．要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
提示：应从富含纤维素的环境中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
2．根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？
提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。
3．为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数？
提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
4．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
课内探究·名师点睛
选择培养基与鉴别培养基
知识点
1．选择培养微生物的四种方法及其实例
知识贴士
能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌。原则上选择培养基只允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。
2．尿素分解菌的鉴定
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了NH3。NH3会使培养基的碱性增强，pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，则可初步说明该种细菌能够分解尿素。
3．鉴别培养基
(1)特点：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。
(2)用途：鉴别不同种类的微生物(如可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌。若有，菌落呈现深紫色)。
┃┃典例剖析__■
典例1 在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的苯酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出( C )
A．乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
B．固氮细菌、大肠杆菌、放线菌
C．固氮细菌、霉菌、放线菌
D．固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
解析：在缺乏氮源的选择培养基上可以筛选分离出固氮微生物，乳酸菌不属于固氮微生物，A不符合题意；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，在添加青霉素的选择培养基上可以筛选分离出真菌，而大肠杆菌和金黄色葡萄球菌属于细菌，不能在该培养基上生长，B、D不符合题意；加入10%的苯酚可以抑制细菌和霉菌的生长，此选择培养基可以筛选分离出放线菌。综上所述，C符合题意。
┃┃变式训练__■
1．下列培养基配方中，能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是( B )
A．②③B．③①
C．②④D．①④
解析：③中加入了20gNaCl，从而抑制了不耐盐微生物生长，促进了耐盐微生物的生长，属于选择培养基；①中加入伊红、亚甲蓝，只是使大肠杆菌菌落呈现深紫色，不会抑制其他微生物生长，属于鉴别培养基，B项正确。
知识点
微生物数量测定方法分析
1．微生物数量测定方法
微生物数量测定的常用方法有稀释涂布平板法、显微镜直接计数法等。二者的比较如下表所示：
知识贴士
稀释涂布平板法计数的几个注意事项
(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)要设置对照实验，且一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。
(3)计数时机：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
(4)用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
2．平板划线法与稀释涂布平板法的比较
┃┃典例剖析__■
典例2 下列有关稀释涂布平板法操作的叙述，不正确的是( C )
A．若稀释梯度以10倍为单位，当用移液管取1mL原始菌液进行稀释时，其余试管内的无菌水应为9mL
B．每次用灭菌后的移液管取菌液前，要先将菌液混匀
C．在涂布过程中，每次变换涂布的方向和位置时，应对涂布器进行灼烧灭菌
D．将菌液涂布在培养基表面时，为涂布均匀，应及时转动培养皿
解析：稀释梯度以10倍为单位时，如果溶液总量为10mL，需用移液管将1mL原始菌液移入盛有9mL无菌水的试管中，依次类推即可得到所需稀释倍数的菌液，A正确；每次用灭菌后的移液管取菌液前，要先将菌液混匀，B正确；在涂布前，先将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后冷却8～10s，用涂布器将菌液均匀涂布在培养基的表面，涂布结束后，应对涂布器进行灼烧灭菌，以防污染环境和感染操作者，C错误；涂布时，可转动培养皿，使菌液分布均匀，D正确。
┃┃变式训练__■
2．下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的描述不正确的是( C )
A．利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌
B．两种计数方法，其统计值与实际值相比，均有差异，但差异原因不同
C．两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D．当菌落数目稳定时，一般选取菌落在30～300的且差异不大的平板进行计数
解析：显微镜直接计数法只能看到细菌，无法区分死菌和活菌，A正确；稀释涂布平板法计数中，当多个细菌连在一起时，平板上观察到的往往是一个菌落，故而统计值比实际值小，显微镜直接计数法不能区分死菌和活菌，故测定的微生物数量往往大于实际的活菌数，因此两种计数方法的统计值与实际值相比均有差异，但差异原因不同，B正确；稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征，而不是微生物的形态特征，显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征，C错误；当菌落数目稳定时，一般选取菌落在30～300的且差异不大的平板进行计数，D正确。
知识点
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
1．实验设计流程
eq \x(土壤取样)(1)要求：富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤
(2)取样土层：距地表3～8cm的土壤层
eq \x(制备培养基)用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用以尿素为唯一氮源的培养基作为实验组，用来判断选择培养基是否具有选择作用
eq \x(样品的稀释)在酒精灯火焰旁称取10g土壤，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，振荡使土壤与水充分混合，将细菌分散，制成101倍土壤稀释液。用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍的土壤稀释液。依次类推，制成103、104、105、106、107倍的土壤稀释液
eq \x(涂布平板)
图中的1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；另外，还要有两个对照，即不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌
eq \x(培养与观察)将平板倒置于30～37℃温室中培养1～2d，每隔24h统计一次菌落数目
eq \x(菌落计数)当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。
3．结果分析与评价
┃┃典例剖析__■
典例3 从土壤中分离获得某种微生物的步骤是( B )
①土壤取样 ②梯度稀释 ③选择培养 ④涂布培养 ⑤筛选菌株
A．①②③④⑤ B．①③②④⑤
C．①②④③⑤D．①④②③⑤
解析：从土壤中分离获得某种微生物的步骤为：土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布培养→筛选菌株。
┃┃变式训练__■
3．(2022·烟台二中模拟)某生物兴趣小组尝试对土壤中分解尿素的细菌进行分离并计数，相关叙述正确的是( D )
A．制备选择培养基时，需加入尿素、琼脂、葡萄糖、硝酸盐等物质
B．用活菌计数法统计结果，活菌的实际数目往往比统计的菌落数低
C．脲酶将尿素分解成氨使培养基的pH降低，加入酚红指示剂后变红
D．测定土壤中细菌的数目，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板培养
解析：分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要添加尿素(唯一的氮源)、琼脂(凝固剂)、葡萄糖(提供碳源)，尿素给分解尿素的细菌提供氮源，不需要加硝酸盐，A错误；用活菌计数法统计结果时，有的活菌在培养过程中会死亡，而有的菌落是由两个或多个活菌连在一起形成的，统计的菌落数比实际值偏小，故活菌的实际数目往往比统计的菌落数高，B错误；脲酶将尿素分解成氨使培养基的pH升高，加入酚红指示剂后变红，C错误；土壤中细菌的含量比较多，测定土壤中细菌的数目，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板培养，D正确。
指点迷津·拨云见日
不能理解“多次划线”与“逐步稀释分散成单菌落”的关系
平板划线法中通过“多次划线”操作，达到“逐步稀释分散成单个菌落”的结果。具体分析如下：
(1)通过每次划线稀释菌种，线条末端菌体数少于线条首端。
(2)每次划线前灼烧接种环，杀死接种环上的微生物，保证下一次划线的菌种来自上一次划线的末端。再次通过划线稀释菌种，依次类推，得到单个菌落。
┃┃典例剖析__■
典例4 下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的划线操作。下列叙述中错误的是( C )
A．甲图中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂菌液
B．甲、乙两图的操作中只有甲可以用于微生物的计数
C．乙图中接种环需要灼烧5次
D．乙图中连续划线的起点是上一次划线的末端
解析：甲图中采用了稀释涂布平板法，涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂菌液，A项正确；乙图的操作对应平板划线法，无法用于微生物的计数，B项正确；乙图平板中划了5个区域，因此操作过程中接种环需要灼烧6次，C项错误；乙图中每次划线的起点是上一次划线的末端，D项正确。
解疑答惑
思考·讨论⇨P16
1．提示：培养基的配方中应含有微生物生长所需的营养要素——碳源、氮源、水、无机盐等。由于绝大多数微生物都能利用葡萄糖，分解尿素的细菌也能利用葡萄糖，因此可以用葡萄糖作为碳源，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，在培养基中加入尿素为唯一氮源，使培养基具有了选择作用。该培养基以尿素作为唯一氮源，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。
2．提示：该培养基与普通培养基相比较，共同点是都以有机碳(如葡萄糖)作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。
探究·实践⇨P18
结果分析与评价
1．提示：对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
2．提示：如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
3．提示：如果选取的是同一种土样，统计的结果应该接近，如果相差太大，可能培养基污染或混入了其他含氮物质，也可能是操作失误。
进一步探究
提示：由于细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。因此，可通过检测培养基中pH的变化来判断该反应是否发生。鉴定方法可以在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某细菌后，若pH升高，指示剂将变红，从而鉴定该细菌能分解尿素。
到社会中去⇨P20
提示：教材中几个实验都可采用稀释涂布平板法进行活菌计数，实验流程相似，大致都可分为以下几个步骤：
在相应环境中取样→制备培养基→梯度稀释与涂布平板→培养与观察→菌落计数。在对照实验设置方面，都需要设置一个未接种的普通培养基作为对照，以检测培养基是否被杂菌污染。第4个实验由于是土壤中真菌的分离与计数，可能要用到选择培养基，所以还需设置一个接种的普通培养基作对照，以检测选择培养基是否有选择作用。
练习与应用⇨P20
一、概念检测
1．(1)√
(2)√
(3)√
2．D
二、拓展应用
1．提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
2．(1)提示：首先进行土壤取样。在富含纤维素的潮湿土壤中用无菌小铁铲铲去表层土，迅速铲取土样，装入无菌信封内密封。其次，进行选择培养。将土壤稀释液接种到选择培养基中进行培养，以增加纤维素分解菌的浓度。然后进行梯度稀释，将稀释后的样品涂布到鉴别纤维素分解菌的固体培养基上，在培养的过程中，纤维素分解菌产生纤维素酶，将纤维素分解成纤维二糖、葡萄糖。这些产物不能与刚果红结合形成红色复合物，在培养基上就形成了以纤维素分解菌为中心的透明圈，用接种环或接种针挑选产生透明圈的菌落就是纤维素分解菌的菌落。
(2)提示：打算到富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌。因为根据生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。
(3)提示：这一做法可行，通过人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境，使纤维素分解菌聚集。滤纸富含纤维素，将滤纸埋在土壤中，纤维素分解菌就会在滤纸上聚集，分解纤维素，可以从腐烂滤纸中筛选纤维素分解菌。
训练巩固·课堂达标
1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( C )
注：“＋”表示加入，“－”表示不加
解析：分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有碳源，且以尿素作为唯一的氮源，故不能添加硝酸盐。
2．测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是( C )
A．细菌个体小，真菌个体大B．细菌易稀释，真菌不易稀释
C．细菌在土壤中数量比真菌多D．随机的，没有原因
解析：土壤中的微生物大约70%～90%是细菌，真菌的数量要比细菌少。样品的稀释度越高，在平板上生成的菌落数目就越少。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，适于平板计数，所以细菌的稀释倍数要高于真菌的稀释倍数。综上分析，C项正确。
3．选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是( D )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
解析：不含有机物的培养基可以选择自养微生物，缺少氮元素的培养基可以选择固氮微生物，含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。
4．(不定项)(2022·山东日照高三期末)屠宰场废弃血污不经过处理直接排放，会对环境造成污染。传统的处理方法有填埋法和焚烧法等。填埋法易造成地表环境、地下水资源污染。焚烧法处理也会造成大气污染，且废弃物中所含的蛋白资源不能得到有效利用。研究人员以屠宰场血污堆积土壤为分离基质，利用血平板培养基(添加了动物血液)，分离出了高效降解血红蛋白的菌株，并初步用于降解废弃血液、生产氨基酸液态肥料。下列叙述正确的是( ACD )
A．上述菌株分离、纯化过程中用到了稀释涂布平板法和平板划线法
B．对分离、纯化得到的菌株培养后进行计数，只能采用稀释涂布平板法
C．平板培养基上添加了动物血液，透明圈大的菌落分泌的蛋白酶的活性往往较高
D．利用该菌株降解废弃血液可在保护环境的同时实现资源的可持续利用
解析：根据题图中培养皿上的菌落可知，分离、纯化过程中先后用到了稀释涂布平板法和平板划线法，A项正确；对分离、纯化得到的菌株培养后进行计数，除了采用稀释涂布平板法，还可以用显微镜直接计数法，B项错误；平板培养基上添加了动物血液，能降解血红蛋白的菌株周围会出现透明圈，且透明圈大的菌落分泌的蛋白酶的活性往往较高，C项正确；根据题干信息可知，利用该菌株可降解废弃血液，同时生产氨基酸液态肥料，可在保护环境的同时实现资源的可持续利用，D项正确。
选择培养原理
具体处理
分离菌种
利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养
不加含碳有机物的无碳培养基
分离自养型微生物
无氮培养基
分离自生固氮微生物
利用微生物(目的菌)对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者
石油作为唯一碳源的培养基
分离能消除石油污染的微生物
尿素作为唯一氮源的培养基
分离能分解尿素的微生物
在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长
加入青霉素等抗生素
分离酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌、放线菌的生长
加入高浓度的食盐
分离金黄色葡萄球菌
在高盐环境中
可分离耐盐菌，其他菌在高盐浓度下易失水而不能生存
在高温环境中
可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存
原料
①
②
③
④
蛋白胨
10g
10g
10g
10g
乳糖
5g
5g
5g
5g
蔗糖
5g
5g
5g
5g
K2HPO4
2g
2g
2g
2g
伊红
0.4g
亚甲蓝
0.065g
琼脂
10g
20g
NaCl
20g
蒸馏水
1000mL
1000mL
1000mL
1000mL
项目
显微镜直接计数法
稀释涂布平板法(间接计数法)
原理
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计数一定容积的样品中微生物的数量
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌
主要用具
显微镜、细菌计数板(或血细胞计数板)
培养基
计数数据
菌体本身
培养基上的菌落数
优点
计数方便、操作简单
计数的是活菌
缺点
死菌、活菌都计算在内
操作较复杂，有一定误差
计算公式
每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10000×稀释倍数
每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
工具
接种环
涂布器
分离
单菌
落的
原理
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落
特点
可以分离得到单菌落，且操作简单，但不宜计数
可以分离得到单菌落，可以计数，但操作复杂
稀释度
104
105
106
107
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
菌落数/平板
内容
现象
结论
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
选择培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高
培养基中混入其他氮源
选择培养基
的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
样品的稀
释操作
得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
选项
尿素
琼脂
葡萄糖
硝酸盐
A
＋
＋
＋
＋
B
－
－
－
－
C
＋
＋
＋
－
D
＋
－
－
＋
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高中生物人教版 (2019)选择性必修3二 微生物的选择培养和计数第2课时导学案： 这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3二 微生物的选择培养和计数第2课时导学案，共13页。
