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2024届高考生物一轮总复习第十四单元基因工程及生物技术的安全性与伦理问题第1讲全面落实“基因工程及生物技术的安全性与伦理问题”的主干知识教师用书
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第1讲 全面落实“基因工程及生物技术的安全性与伦理问题”的主干知识
1．切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(×)
2．E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(×)
3．载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。(√)
4．用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列。(×)
5．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(×)
6．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(×)
7．在电泳时，DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关，与DNA分子的带电量和带电性质无关。(×)
8．“设计试管婴儿”与“试管婴儿”的技术操作过程是完全相同的。(×)
系统学习(一) 重组DNA技术的基本工具(固基点)
主干知识·记准理清
(一)基因工程的概念
(二)基因工程的基本工具
1．限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
存在
主要存在于原核生物中
作用
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
特性
一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的位点上切割DNA分子
结果
产生黏性末端或平末端
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
种类
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，连接两个DNA片段
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
类型
最常用：质料；其他：噬菌体、动植物病毒等
条件
①稳定并自我复制或整合到受体DNA上，使目的基因稳定存在且数量可扩增；
②具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插放；
③具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选
作用
携带外源DNA片段进入受体细胞
(三)DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
(1)DNA不溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2_mol/L的NaCl溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2．实验步骤
————————————■链教材资料·发展科学思维■————————————
1．(选择性必修3 P71旁栏思考拓展)限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
2．(选择性必修3 P72旁栏思考拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。
提示：不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链的末端。
题点考法·练全练通
考法(一) 考查基因工程的操作工具
1．下面是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图(箭头表示切点，切出的断面为黏性末端)。下列叙述不正确的是( )
A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性
B．限制酶2和3识别的序列都包含6个碱基对
C．限制性酶1和酶3剪出的黏性末端相同
D．能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
解析：选D 由图可知，限制酶2和3识别的序列分别是CCGCGG和GGATCC，均为6个碱基对，B正确；限制酶1和3剪出的黏性末端相同，均为GATC，C正确；限制酶只能识别特定的DNA序列，且具有专一性，因此三种限制酶均不能识别和切割RNA中的核糖核苷酸序列，A正确，D错误。
2．图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ 三种限制酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________________________________________________________________________。
解析：(1)由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因产物。(3)常见的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4 DNA连接酶。
答案：(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 (3)E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶
[归纳拓展] 与DNA有关的几种酶的比较
酶种类
作用底物
作用部位
作用结果
限制酶
DNA分子
磷酸二酯键
将DNA切成两个或多个片段
DNA连接酶
DNA分子片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
脱氧核苷酸
磷酸二酯键
以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到另一条短的单链末端
解旋酶
DNA分子
碱基对中的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
DNA水解酶
DNA分子
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
考法(二) 考查DNA的粗提取与鉴定的原理和操作
3．(2022·山东高考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：选B 低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有某些蛋白质不溶于酒精，在体积分数为95%的冷酒精中与DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
4．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，相关叙述正确的是( )
A．图1中溶液a是去掉上清液的研磨液
B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
解析：选B 图1中溶液a是研磨液静置几分钟后取的上清液，A错误；图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精，C错误；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺出现蓝色，D错误。
系统学习(二) 基因工程的操作程序与应用(释疑点)
基础知识·全面掌握
(一)基因工程的操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
②筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因。
①原理：DNA复制。
②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
③扩增过程。
过程
说明
图解
变性
温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
2．基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成。
(3)基因表达载体的构建过程。
3．将目的基因导入受体细胞
项目
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、花粉管通道法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
4．目的基因的检测与鉴定
检测水平
检测目的
检测方法
分子水平
目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上
PCR
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交
个体水平
转基因生物是否表现出相应的特性
如抗虫、抗病的接种实验
(二) 基因工程的应用
1．基因工程在农牧业方面的应用
①转基因抗虫植物；②转基因抗病植物；③转基因抗除草剂植物；④改良植物的品质；⑤提高动物的生长速率；⑥改善畜产品的品质。
2．基因工程在医药卫生领域的应用
①对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们生产药物。
②让哺乳动物批量生产药物。
③可能使建立移植器官工厂的设想成为现实。
3．基因工程在食品工业方面的应用
利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
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1．(选择性必修3 P78图3-5)PCR反应过程示意图分析：
(1)PCR技术的原理是什么？
提示：体外DNA双链复制。
(2)由图分析可知，在PCR反应过程中需要两种引物，原因是什么？
提示：DNA由两条反向平行的脱氧核苷酸链组成，DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。
2．(选择性必修3 P80正文拓展思考)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？
提示：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。
3．(选择性必修3 P81正文拓展思考)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上？
提示：Ti质粒上T-DNA也称为可转移DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。
重难盲点·讲练疏通
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基因工程的操作步骤
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1．目的基因的获取方法
(1)利用PCR获取和扩增目的基因。
(2)人工合成目的基因。
①逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：
②化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：
(3)从基因文库中获取目的基因。
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
2．目的基因的检测与鉴定方法
(1)载体上标记基因的标记原理。
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞，原理如图所示：
(2)目的基因的检测。
①使用PCR等技术，检测目的基因是否插入转基因生物染色体DNA上及目的基因是否转录出特定mRNA。
②采用抗原—抗体杂交技术，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)，与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。
③采用抗虫、抗病毒等接种实验，进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。
[典例1] 人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。如图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的过程，图中Tetr表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，五种限制酶的识别序列及切割位点如表所示，请回答以下问题：
限制酶
BamHⅠ
HaeⅢ
BclⅠ
Sau3AⅠ
NotⅠ
识别序列及切割位点
(1)①过程常采用的方法是 ______________。
(2)要将人乳铁蛋白基因插入质粒，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是 ________________。构建基因表达载体时，需要将人乳铁蛋白基因嵌入 __________________之间，这样人乳铁蛋白基因才能在乳腺细胞中表达。
(3)据图分析筛选含有重组质粒的受体细胞首先需要在含 ______________(填“四环素”“氨苄青霉素”或“四环素或氨苄青霉素”)的培养基上进行。
(4)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为 ____________，对于该部位，这两种酶 ____________(填“都不能”或“只有一种能”)切开。
[解析] (1)将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法。(2)根据表中五种酶的识别序列及切割位点可知，限制酶Sau3AⅠ还可以切割限制酶BclⅠ和限制酶BamHⅠ的识别序列，因此要将人乳蛋白基因插入载体，在只允许用一种限制酶切割载体和人乳铁蛋白基因的情况下，应选择限制酶Sau3AⅠ。构建基因表达载体时，需要将人乳铁蛋白基因嵌入到启动子和终止子之间，这样人乳铁蛋白基因才能在乳腺细胞中表达。(3)用限制酶Sau3AⅠ切割后会破坏四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的受体细胞可在含有氨苄青霉素的培养基上生存下来。(4)根据表格中各种限制酶的识别序列和切割位点可知，若BamH Ⅰ酶切的DNA末端与Bcl Ⅰ酶切的DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，这两种酶都不能切开。
[答案] (1)显微注射法 (2)Sau3AⅠ 启动子和终止子 (3)氨苄青霉素 (4) 都不能
[对点练习]
1．下列关于基因工程的叙述，正确的是( )
A．培育转基因动物时选择的受体细胞只能是动物的受精卵
B．构建重组质粒时必须选择相同的限制性内切核酸酶处理载体质粒与目的基因
C．经检测发现抗除草剂基因成功导入某抗盐植物，该植物一定具有抗除草剂及抗盐性状
D．用氯化钙处理大肠杆菌，增加其细胞壁的通透性，可提高重组DNA分子的导入成功率
解析：选D 培育转基因动物时选择的受体细胞最好是动物的受精卵，也可以是胚胎干细胞或核移植形成的重组细胞，A错误；构建重组质粒时一般选择相同的限制性内切核酸酶处理载体质粒与目的基因，也可以选择不同的限制酶处理，但必须产生相同的黏性末端，B错误；目的基因成功导入受体细胞后不一定能成功表达，因此经检测发现抗除草剂基因成功导入某抗盐植物，该植物不一定具有抗除草剂及抗盐性状，C错误。
2.紫苜蓿是一种重要的牧草。某研究团队拟将耐盐基因HAL1导入紫苜蓿中培育耐盐牧草。具体实验流程如图所示。下列操作错误的是( )
A．可选用氯化钙处理农杆菌，有利于重组Ti质粒导入农杆菌
B．将农杆菌与苜蓿愈伤组织一起培养一段时间后，往往需要添加适量抗生素抑制农杆菌生长
C．为确认转基因苜蓿是否培育成功，需对苜蓿植株进行耐盐检测
D．植物细胞具有全能性，所以诱导形成苜蓿幼苗的成功率与苜蓿愈伤组织的基因型无关
解析：选D 用氯化钙处理农杆菌可使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，这样有利于重组Ti质粒导入，A正确；将农杆菌与苜蓿愈伤组织一起培养一段时间后，需要用抑菌类抗生素抑制农杆菌的生长，以防止农杆菌过度生长对转化组织产生毒害作用，B正确；要判断耐盐性的紫花苜蓿是否培育成功，还需进行个体水平的鉴定，即让转基因紫花苜蓿进行耐盐性试验，C正确；愈伤组织中导入目的基因改变了其遗传物质，所以诱导形成苜蓿幼苗的成功率与苜蓿愈伤组织的基因型有关，D错误。
3．TALEN是一种靶向基因操作技术，该技术利用了TAL靶向识别单元对靶向基因的识别作用和FokI蛋白对靶向基因的切割作用实现了对特定靶向基因的敲除。相关操作如下：
(1)TAL靶向识别单元的构建。TAL靶向识别单元为间隔32个氨基酸的双连氨基酸(即两个相连的氨基酸)序列。不同的双连氨基酸分别与靶向基因中的A、T、C、G有恒定的对应关系，根据靶向基因的碱基序列可以设计出双连氨基酸序列。
(2)目的基因的获取与扩增。根据TAL靶向识别单元中双连氨基酸序列和FokI蛋白的氨基酸序列，可按照__________________________________，最终合成目的基因(写出具体步骤)。再通过PCR技术进行扩增。扩增前，需根据目的基因的核苷酸序列设计出____种引物；扩增时，需先加热至90～95 ℃，再冷却至50～60 ℃，再加热至70～75 ℃，此操作的目的是__________________________________________________。
(3)利用质粒和目的基因构建基因表达载体。在构建的基因表达载体中，启动子应位于基因的上游，它是________________的部位；标记基因的作用是________________________________________________________________________。
(4)目的基因的表达与检测。目的基因进入受体细胞后，在受体细胞中维持稳定和表达的过程，称为________。从分子水平上，通过______方法可检测基因工程操作是否成功。
(5)靶向基因的敲除。TAL靶向识别单元能够识别特定的靶向基因序列，FokI蛋白能够从被识别的靶向基因两端切断磷酸二酯键，从而将靶向基因从原双链DNA上敲除。由此推测，FokI蛋白实际上是一种________。
解析：(2)已知TAL靶向识别单元中双连氨基酸序列和FokI蛋白的氨基酸序列，可先推测出信使RNA序列，再推测出目的基因的核苷酸序列，然后利用化学法以单个核苷酸为原料最终合成目的基因，再通过PCR技术进行扩增。PCR扩增前，需根据目的基因的核苷酸序列设计出2种引物；扩增时，需先加热至90～95 ℃使DNA变性后解聚为单链，再冷却至50～60 ℃使引物结合到互补DNA链上，再加热至70～75 ℃促进DNA聚合酶发挥作用，开始互补链的合成。(3)在构建的基因表达载体中，有启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位；标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。(4)目的基因进入受体细胞后，在受体细胞中维持稳定和表达的过程，称为转化。分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入目的基因：PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。(5)FokI蛋白能够从被识别的靶向基因两端切断磷酸二酯键，从而将靶向基因从原双链DNA上敲除。由此推测，FokI蛋白实际上是一种限制性内切核酸酶。
答案：(2)先推测出信使RNA序列，再推测出目的基因的脱氧核苷酸序列，利用化学法以单个核苷酸为原料 2 加热使DNA变性后解聚为单链，冷却使引物结合到互补DNA链上，再加热促进DNA聚合酶发挥作用，开始互补链的合成 (3)RNA聚合酶识别和结合 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (4)转化 抗原—抗体杂交(或PCR技术) (5)限制性内切核酸酶(限制酶)
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分析基因工程的应用
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乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别
比较内容
乳腺生物反应器
工程菌
含义
指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白
指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系
受体基因结构与人类基因结构差异
动物基因结构与人类的基因结构基本相同
细菌和酵母菌的基因结构与人类有较大差异
基因表达
合成的药物蛋白与天然蛋白质相同
细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞
动物受精卵
微生物细胞
目的基因导入方式
显微注射法
Ca2＋处理法
生产条件
不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大
需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取
从动物乳汁中提取
从微生物细胞或其培养液中提取
[典例2] (2021·广东高考)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有________________________________(答出两种即可)。
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有____________________(答出两种即可)。
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法是
________________________________________________________________________。
(4)依上图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是________________。在分子水平上，可以通过改变____________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
[解析] (1)分析题干，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析法、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用Ca2＋处理大肠杆菌，使其成为易于接受外来DNA分子的感受态细胞。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)依题图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
[答案] (1)基因文库中获取、人工合成法 (2)盐析法、酶解法或高温变性法 (3)感受态 抗原—抗体杂交技术 (4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
[对点练习]
4．核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。如图为针对某种RNA病毒抗原(S蛋白)研制DNA疫苗和RNA疫苗的思路。下列相关叙述正确的是( )
A．该疫苗中核酸可作为抗原刺激人体产生体液免疫
B．步骤①中对S蛋白基因进行扩增，需要用到DNA聚合酶和解旋酶
C．步骤②构建重组表达载体，其S基因应插入载体，只需不破坏标记基因
D．核酸疫苗能在人体细胞中成功表达S蛋白，说明了生物界共用一套密码子
解析：选D 该疫苗中核酸用来编码抗原蛋白，核酸本身不能作为抗原刺激人体产生体液免疫，A错误；步骤①中对S蛋白基因进行扩增，利用的是PCR技术，该过程需要用到耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶，B错误；步骤②构建重组表达载体，其S基因应插入载体，不能破坏标记基因、启动子序列和终止子序列等，C错误；核酸疫苗中的核酸源自病毒等病原体，其在人体细胞中能成功表达S蛋白，说明了生物界共用一套密码子，D正确。
5．应用生物工程技术可获得人们需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题：
(1)要获得抗虫基因，可采用____________________等方法，基因工程的核心是_____________________。
(2)如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是____________，原因是______________________。若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其用________处理，使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
(3)在培育转人生长激素基因牛的过程中，①过程需要的工具酶是__________________，②过程常用的方法是______________。
(4)转人生长激素基因牛可通过分泌的乳汁来生产人生长激素，在基因表达载体中，人生长激素基因的首端必须含有______________。
解析：(1)获得目的基因的方法有PCR技术扩增、人工合成等，基因工程的核心是构建基因表达载体。(2)动物受精卵具有全能性，能发育成完整个体，要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是受精卵。若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其用Ca2＋处理，使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(3)①是目的基因与载体结合的过程，需要限制酶、DNA连接酶；②是重组质粒导入受体细胞的过程，常用的方法是显微注射法。(4)基因表达载体的首端必须含有启动子。
答案：(1)PCR技术扩增、人工合成 构建基因表达载体 (2)受精卵 动物受精卵具有全能性 Ca2＋
(3)限制酶、DNA连接酶 显微注射法 (4)启动子
6．(2023·南昌模拟)蓝细菌中的ictB蛋白能高效转运和浓缩CO2从而提高细胞光合速率。我国科学家构建了叶片特异性启动子Cab(叶绿体捕光色素蛋白Cab基因启动子)驱动的蓝细菌ictB基因表达载体，并通过农杆菌转化法获得了转ictB基因水稻，大大提高了水稻的产量。在ictB基因载体的构建中，含Cab启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图1所示。请回答下列问题：
(1)为使重组DNA分子能定向插入T-DNA中，可用PCR的方法在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端添加的序列所对应的限制酶是________，N端添加的序列所对应的限制酶是__________。经过酶切的重组DNA分子和Ti质粒进行连接时，可选用______________________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要________种酶。
(2)将农杆菌液浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入________进行筛选，最终获得多个水稻株系a1、a2、a3、a4。对a1～a4四个水稻株系的ictB蛋白表达量进行测定，结果如图2，其中a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是________________________________。检测应选用的植物器官是________，原因是____________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)据图可知，ictB基因中有BamHⅠ的酶切位点，故不能选择BamHⅠ，又因为Sau3AⅠ也可识别BamHⅠ的酶切位点，故也不能选择该酶，又由于SpeⅠ能切割Cab启动子，也不能选择，故只能选择BglⅠ和EcoRⅤ，再根据启动子的方向可知，M端添加的序列所对应的限制酶是BglⅠ，N端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅤ；由于EcoRⅤ酶切后是平末端，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端，故经过酶切的重组DNA分子和Ti质粒进行连接时，可选用T4 DNA连接酶；添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要4种酶，分别是BglⅠ、EcoRⅤ、T4 DNA连接酶和Sau3AⅠ(切割载体，BglⅠ与Sau3AⅠ切割后的黏性末端一样)。
(2)由图1可知潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T-DNA上，随T-DNA整合到水稻细胞的染色体DNA上，所以将农杆菌浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，筛选出的愈伤组织可(再)分化形成丛芽，最终获得多个转基因水稻株系；蛋白质的表达量与基因的表达有关，故a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是其没有导入目的基因或者目的基因没有表达；由于Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择性的在叶片中表达，故检测应选用的植物器官是叶片。
答案：(1)Bgl Ⅰ EcoR Ⅴ T4 DNA连接酶 4 (2)潮霉素 a4水稻株系中目的基因未表达 叶片 Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择性的在叶片中表达
系统学习(三) 蛋白质工程及DNA片段的扩增及电泳鉴定(固基点)
主干知识·记准理清
(一)蛋白质工程的原理和应用
1．蛋白质工程的概念
基础
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
目的
合成满足人类生产和生活需求的蛋白质
手段
基因改造或基因合成
2.蛋白质工程的基本原理
3．蛋白质工程的应用
(1)医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
(2)其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。
(3)农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，增强防治病虫害的效果。
(二)DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验基础
(1)PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
2．PCR实验操作步骤
3．DNA的测定
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。
————————————■链教材资料·发展科学思维■————————————
1．(选择性必修3 P94正文拓展分析)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？
提示：应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因有：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。
2．(选择性必修3 P85“结果分析与评价”)电泳鉴定时未出现特异性条带的原因有哪些？
提示：模板DNA出现污染；Taq DNA聚合酶出现质量问题；引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体；复性时的温度过低；PCR循环次数过多；等等。
题点考法·练全练通
考法(一) 考查蛋白质工程的原理和应用
1．某种病毒通过其表面刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)与人体细胞表面的ACE2受体相互作用，侵入人体细胞。研究人员设计并合成了一种自然界不存在的LCB1蛋白药物，可识别并紧密结合S蛋白的RBD，以干扰该病毒的感染。下列叙述错误的是( )
A．LCB1可能与ACE2受体的某些区域结构类似
B．LCB1可以依据S蛋白的RBD结构进行设计
C．LCB1是通过细胞中原有的基因表达产生的
D．LCB1设计和合成是通过蛋白质工程实现的
解析：选C 由题干信息可知，S蛋白的RBD与人体细胞表面的ACE2受体相互作用；而LCB1可识别并紧密结合S蛋白的RBD，阻止S蛋白的RBD与ACE2受体结合，这说明LCB1可能与ACE2受体的某些区域结构类似，LCB1可以依据S蛋白的RBD结构进行设计，A、B正确；LCB1是人工设计并合成的一种自然界不存在的蛋白质，故LCB1并不是通过细胞中原有的基因表达产生的，而基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，故LCB1设计和合成是通过蛋白质工程实现的，C错误，D正确。
2．近年来，蛋白质工程与基因工程的结合使得干扰素生物工程的研究取得了更大的进展。回答下列有关生物工程生产干扰素的问题。
(1)根据人们对干扰素结构和功能上的需求，将干扰素的第17位半胱氨酸替换成丝氨酸，这种生物工程属于________________。
(2)可通过点突变技术使干扰素基因中的碱基对发生改变，将改造后的基因与载体构建成__________后导入大肠杆菌生产干扰素。干扰素是一种糖蛋白，在大肠杆菌内不能加糖基团，这是因为________________________________________________________。用家蚕来生产干扰素更为理想，生产过程中，用到了家蚕核型多角体病毒(NPV)，NPV的作用是充当基因工程的________。
(3)人们设想，如果能将干扰素基因导入哺乳动物的受精卵，再将受精卵进行______________至桑葚胚或囊胚阶段，然后进行____________。可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，人们把这种转基因动物称为______________。若该设想变为现实，则干扰素的活性及产量均会大幅提高。
解析：(1)根据人们对干扰素结构和功能上的需求，将干扰素的第17位半胱氨酸替换成丝氨酸，即改造蛋白质，因此这种生物工程属于蛋白质工程。(2)将改造后的基因与载体构建成基因表达载体。干扰素是一种糖蛋白，在大肠杆菌内不能加糖基团，原因是糖基团是在内质网中加入的，而大肠杆菌为原核生物，细胞中无内质网。家蚕核型多角体病毒(NPV)可以充当基因工程的载体。(3)将目的基因导入哺乳动物的受精卵，再将受精卵进行早期胚胎培养至桑葚胚或囊胚阶段，然后进行胚胎移植，可以获得转基因动物。可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，这种转基因动物称为乳腺生物反应器。
答案：(1)蛋白质工程 (2)基因表达载体 糖基团是在内质网中加入的，大肠杆菌为原核生物，细胞中无内质网 载体 (3)早期胚胎培养 胚胎移植 乳腺生物反应器
[归纳拓展] 蛋白质工程与基因工程的区别和联系
项目
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新基因→获得所需要的蛋白质
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
考法(二) 考查DNA片段的扩增及电泳鉴定
3．下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR利用了DNA的热变性原理
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
解析：选C 缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存，使用前，将所需试剂从冰箱取出，放在冰块上缓慢融化，C错误。
4．下列有关电泳的叙述，错误的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度
C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
解析：选C 进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。
5．在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述中，不正确的是( )
A．该载体最可能为环状DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D．限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
解析：选D 当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
系统学习(四) 生物技术的安全性和伦理问题(固基点)
主干知识·记准理清
1．转基因产品的安全性
2．关注生殖性克隆人
(1)治疗性克隆和生殖性克隆的比较。
项目
治疗性克隆
生殖性克隆
概念
利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的
通过克隆技术产生独立生存的新个体
目的
用于医学研究或治疗疾病
用于生育，产生新个体
水平
细胞水平
个体水平
联系
都属于无性生殖，产生的新个体或新组织的遗传物质均不发生变化
(2)生殖性克隆人面临的伦理问题。
①生殖性克隆人“有违人类尊严”。
②生殖性克隆人是人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人。
③克隆技术还不成熟，生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题。
(3)重要过程。
3．试管婴儿与设计试管婴儿的异同点
(1)不同点。
①所用技术手段：设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断(如诊断血型、诊断性别、诊断HLA的类型等)，试管婴儿不需进行遗传学诊断。
如下图，设计试管婴儿比试管婴儿多了d过程：
②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗。
(2)相同点。
都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
4．生物武器
(1)种类。
①致病菌类：例如，炭疽杆菌、霍乱弧菌等。
②病毒类：天花病毒，某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等。
③生化毒剂类：肉毒杆菌毒素等。
(2)特点：致病能力强，攻击范围广。
(3)散布途径：可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。
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1．(选择性必修3 P106正文发掘)生殖性克隆与治疗性克隆最主要的区别是什么？
提示：克隆的目的不同，生殖性克隆的目的是用于生育，产生新个体；治疗性克隆的目的是治疗人类疾病。
2．(选择性必修3 P112正文发掘)我国对待生物武器的态度与转基因产品安全性的态度有何不同？
提示：对待生物武器的态度是在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。对待转基因产品安全性的态度是趋利避害，而不能因噎废食。
题点考法·练全练通
考法(一) 考查生物技术的安全性
1．下列哪项是转基因生物存在安全性问题的证据？( )
A．世界上数亿计的人口食用转基因农作物
B．转基因生物合成的营养物质与天然品种“没有差别”
C．转基因生物合成的某些蛋白质可能对某些人造成过敏反应
D．转基因产品经过了多环节、严谨的安全性评价
解析：选C 转基因生物合成的某些蛋白质可能对某些人造成过敏反应，是转基因生物存在安全性问题的证据，C符合题意。
2．为了防止转基因作物的目的基因通过花粉转移给自然界中的其他植物，科学家设法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中，其原因是( )
A．叶绿体基因组不会进入到生殖细胞中
B．受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞
C．转基因植物与其他植物间不能通过花粉发生基因交流
D．植物杂交的后代不会出现一定的性状分离比
解析：选B 受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞，精子中几乎不含叶绿体基因组，即叶绿体中的目的基因不会通过花粉传递给下一代，将目的基因导入叶绿体基因组中可防止造成基因污染，B正确。
考法(二) 考查生物技术的伦理问题
3．(2023·浙江1月选考)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是( )
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
解析：选D 试管婴儿是允许的，A错误；治疗性克隆需要监控和审查，B错误；生殖性克隆存在伦理道德方面的风险，C错误；我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，D正确。
4．第三代试管婴儿技术也称胚胎植入前遗传学诊断(PGD)，是在试管婴儿技术基础上出现的。精子和卵子形成受精卵发育成早期胚胎后，要在植入子宫前进行基因检测，再进行胚胎移植。目前PGD能诊断一些单基因缺陷引发的疾病，如血友病等。回答有关问题：
(1)试管婴儿技术包括____________、早期胚胎培养和胚胎移植。
(2)试管婴儿技术操作时，首先要采集“卵子”。在采集“卵子”之前，需要给母亲注射适量的促性腺激素。目的是__________________。从母亲的卵巢中采集的“卵子”________(填“能”或“不能”)直接参与受精作用。在精子入卵后，会立即发生______________，拒绝其他精子再进入卵内。
(3)受精卵发育成4或8细胞胚时，若要进行血友病基因检测，可采用的检测技术有____________________________(答出2点)。
(4)胚胎移植的实质是_______________________________________________________。
(5)随着第三代试管婴儿技术的不断发展，将为不孕及基因缺陷患者带来福音。如果滥用该技术，将会对社会产生负面影响，滥用的表现有________________________________________________________________________。
解析：(1)试管婴儿技术包括体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。(2)试管婴儿技术操作时，给母亲注射适量的促性腺激素，目的是促进母亲超数排卵，获得更多的卵细胞。从卵巢中采集的“卵子”不能直接参与受精作用，需在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。在精子入卵后，卵细胞膜会立即发生卵细胞膜反应，拒绝其他精子再进入卵内。(3)对胚胎细胞进行基因检测，可采用PCR技术对目标基因进行扩增，或制备分子探针进行(DNA)分子杂交进行检测。(4)胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理状态下空间位置的转移。(5)滥用第三代试管婴儿技术的表现主要为设计婴儿的性别。
答案：(1)体外受精 (2)促进母亲超数排卵 不能 卵细胞膜反应 (3)(DNA)分子杂交、PCR (4)早期胚胎在相同生理状态下空间位置的转移 (5)设计婴儿的性别
[课时验收评价]
1．若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，其原因不包括( )
A．目的基因无法插入受体细胞DNA
B．目的基因无法复制
C．目的基因无转录所需的启动部位
D．目的基因与受体细胞遗传信息传递方式不同
解析：选D 不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点，无表达所需的启动子。
2．下列有关生物技术与伦理的说法错误的是( )
A．生命科学的发展必须受伦理的规范和制约
B．实施生命科学研究必须遵循：自主、不伤害、善行和公正的原则
C．关注伦理问题，就是完全限制生命科学的发展
D．对于生物技术应科学地控制，合理地使用，使它的发展对人类最有益
解析：选C 关注伦理问题，并不是完全限制生命科学的发展。对于生物技术，人类所面临的关键问题是如何科学地进行控制，并合理地使用，使它的发展对人类最有益。
3．蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，有广阔的发展前景。下列关于蛋白质工程的叙述正确的是( )
A．由于需要对蛋白质直接改造，因此操作更难
B．由于蛋白质不能遗传，因此蛋白质工程的产物不能大量生产
C．蛋白质工程也需要设计出相应的基因
D．蛋白质工程发展得已经非常成熟，在各个领域有广泛应用
解析：选C 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，是在分子水平上对基因分子直接进行操作，使其遗传物质发生改变，可以遗传给下一代，A、B错误；蛋白质工程对基因分子直接进行操作，需要推测出应有的氨基酸序列，设计出相应的基因，C正确；蛋白质工程的发展并不成熟，仍需一段时间提升，其目前并不能在各个领域广泛应用，D错误。
4．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化其水解。将几丁质酶基因转入菊花体内，可增强其抗真菌病的能力。下列有关叙述错误的是( )
A．将几丁质酶基因插入Ti质粒的TDNA上构建表达载体
B．可通过显微注射法将农杆菌导入菊花受体细胞
C．可用PCR等技术检测目的基因是否成功导入
D．可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度
解析：选B Ti质粒的TDNA可以转移到受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体DNA上，根据这一特点，构建表达载体时，应该将目的基因即几丁质酶基因插入到Ti质粒的TDNA上，A正确；可通过农杆菌转化法将农杆菌导入菊花受体细胞，显微注射法常用于将目的基因导入动物受精卵中，B错误；可用PCR等技术检测目的基因是否成功导入受体细胞，C正确；根据题干信息“几丁质酶基因转入菊花体内，可增强其抗真菌病的能力”，故可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度，D正确。
5．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别为：— AATTG—和— AATTC—。如图表示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程，下列相关叙述错误的是( )
A．用限制酶EcoRⅠ切割目的基因，同时用限制酶MunⅠ切割质粒
B．两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对
C．限制酶能使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
D．将重组质粒同时用2种限制酶切割则会形成2种DNA片段
解析：选D 由图可知，目的基因两侧都是限制酶EcoRⅠ的切割位点，因此应选用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子；质粒中含有限制酶MunⅠ和EcoRⅠ的切割位点，但EcoRⅠ的切割位点位于标记基因中，用其切割会破坏标记基因，因此为保证重组质粒表达载体的准确构建，应选用限制酶MunⅠ切割质粒，A正确。将重组质粒同时用2种限制酶切割，则会形成3种DNA片段，D错误。
6．利用人胰岛B细胞构建cDNA 文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．该文库保存的人类基因没有完整的基因结构
B．探针通常用荧光或者放射性同位素进行标记
C．不能用PCR技术从该文库筛选出目的基因
D．该基因文库还可能存在呼吸酶的相关基因
解析：选C 由于cDNA文库是以mRNA为模板，经逆转录酶催化，在体外逆转录成cDNA，所以形成的cDNA中只包含基因结构中编码区的部分序列，即该文库保存的人类基因没有完整的基因结构，A正确；探针是可以与被检测的目的基因序列进行碱基互补配对的带标记的单链DNA片段，标记可以是荧光或者放射性同位素，B正确；凡是在胰岛B细胞内表达的基因，都可以用PCR技术从该文库筛选出目的基因，C错误；由于呼吸酶基因在胰岛B细胞内能够表达，所以该基因文库还可能存在呼吸酶的相关基因，D正确。
7．OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示)，利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是( )
A．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量
B．四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板
C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞
D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译
解析：选A 可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高，A正确；由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLO1启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同，四个基因转录时并不都以DNA的同一条单链为模板，B错误；卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C错误；由题意知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入到水稻细胞中染色体的DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，D错误。
8．矮牵牛花瓣紫色的深浅由花青素的含量高低决定，花青素由查耳酮合酶(CHS)催化合成。为获得紫色更深的矮牵牛，科研人员将CHS基因导入野生型紫花矮牵牛叶肉细胞中，得到的转基因植株花色反而出现了浅紫色。下列叙述正确的是( )
A．可以从矮牵牛的幼嫩叶肉细胞中用逆转录酶和PCR技术相结合，获取CHS基因
B．农杆菌转化法和基因枪法都可以将获得的CHS基因直接导入叶肉细胞中完成转化过程
C．可以用同位素标记的CHS基因检测目的基因是否成功导入叶肉细胞
D．转基因植株花色为浅紫色的原因可能是CHS基因与载体反向连接，转录出的mRNA与内源基因的mRNA互补
解析：选D CHS基因只在花瓣细胞中表达，因此可以从矮牵牛的花瓣细胞中用逆转录酶和PCR技术相结合，获取CHS基因，A错误；将目的基因导入受体细胞前都需要先构建基因表达载体，因此农杆菌转化法和基因枪法都不可以将获得的CHS基因直接导入叶肉细胞中完成转化过程，B错误；叶肉细胞本身就含有CHS基因，因此不可以用同位素标记的CHS基因检测目的基因是否成功导入叶肉细胞，C错误。
9．科学研究发现Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，通过与其相应的配体结合调控细胞增殖、分化和凋亡等。为了研究Notch基因表达产物的功能，科学家构建含Notch基因的重组质粒，并在大肠杆菌中表达。下列相关分析错误的是( )
A．可以用逆转录的方法和PCR技术获得Notch基因
B．利用PCR技术扩增目的基因时，高温代替了解旋酶的功能
C．可通过核酸分子杂交的方法判断导入的基因是否成功表达
D．基因表达载体的构建是基因工程的核心
解析：选C 获取目的基因的方法有从基因文库中获取、利用PCR扩增、人工合成等，故可以用逆转录的方法和PCR技术获得Notch基因，A正确；利用PCR技术扩增目的基因时，高温变性可以将DNA双链打开，代替解旋酶的功能，B正确；判断导入的基因是否成功表达，需要用抗原—抗体杂交技术，C错误。
10．构建基因表达载体时，可利用碱性磷酸单酯酶催化载体的5′-P变成5′-OH，如图所示。将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′-OH与3′-OH不能连接而形成切口(nick)。下列说法错误的是( )
A．经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化
B．外源DNA也必须用碱性磷酸单酯酶处理
C．T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端
D．重组DNA经过2次复制可得到不含nick的子代DNA
解析：选B 将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′-OH与3′-OH不能连接而形成切口(nick)，因此经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化，A正确；外源DNA不能用碱性磷酸单酯酶处理，如用碱性磷酸单酯酶处理，载体与外源DNA不能连接形成重组DNA，B错误；T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，C正确；DNA是半保留复制，重组DNA经过2次复制，可得到2个不含nick的子代DNA，D正确。
11．B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞(2n)和精子(n)中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下图实验(Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，融合基因表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能)。下列相关叙述错误的是( )
A．由于DNA聚合酶不能合成导致B基因在水稻卵细胞中不能转录
B．过程①中TDNA以双链形式整合到受体细胞的染色体DNA上
C．过程②转化筛选水稻愈伤组织时，需在培养基中加入潮霉素
D．可通过检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光来鉴定B基因是否表达
解析：选A 转录过程不需要DNA聚合酶，需要RNA聚合酶，A错误；由图可知，过程①中TDNA以双链形式整合到受体细胞的染色体DNA上，B正确；由图可知，TDNA上含有潮霉素抗性基因，因此过程②转化筛选水稻愈伤组织时，需在培养基中加入潮霉素，C正确；由图可知B基因与Luc基因连接形成BLuc融合基因，因此可通过检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光来鉴定B基因是否表达，D正确。
12．(2022·湖南高考)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是________，物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是__________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有____________________、____________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是_________________________________________________________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的__________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路__________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)据题图分析可知，物质a是氨基酸序列(多肽链)，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几种密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)实验设计思路见答案。
答案：(1)氨基酸序列(多肽链) mRNA 密码子的简并性 (2)从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA双链复制 (3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一只动物(如家兔)的血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固情况
13．幽门螺杆菌是一种很容易传染的细菌，尤其是家庭内部成员之间，发生交叉感染的概率很高。幽门螺杆菌感染与胃炎、消化道溃疡、胃癌等主要上消化道疾病密切相关。某高校研发的幽门螺杆菌疫苗为基因工程疫苗，其有效成分是该菌表面的一种蛋白质。请回答下列有关问题：
(1)细菌表面的蛋白质可作为________，刺激人体的免疫系统产生相关生理反应。
(2)在疫苗的制备过程中，可通过细菌表面蛋白质的氨基酸序列推测出目的基因的______________序列，人工合成该目的基因，再利用__________技术对目的基因进行扩增。
(3)基因工程的核心步骤是________________的构建，该过程构建的产物中除了目的基因外，还必须有启动子、终止子和____________。
(4)目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持并表达的过程，称为________。利用动物乳腺生物反应器生产该疫苗时，需用____________技术将目的基因导入动物的受精卵中，再利用胚胎工程将受精卵培育成转基因动物，若该转基因动物的乳腺细胞没有分泌出目标蛋白质，其原因可能是_______________________________________________(答出两点即可)。
解析：(1)细菌表面的蛋白质可作为抗原，刺激人体的免疫系统产生相关特异性免疫。(2)在疫苗的制备过程中，可通过细菌表面蛋白质的氨基酸序列推测出目的基因的脱氧核苷酸序列，人工合成该目的基因，再利用PCR技术对目的基因进行扩增。(3)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，必须含有目的基因、启动子、终止子和标记基因。(4)目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持并表达的过程，称为转化。利用动物乳腺生物反应器生产该疫苗时，需用显微注射技术将目的基因导入动物的受精卵中，再利用胚胎工程将受精卵培育成转基因动物，若该转基因动物的乳腺细胞没有分泌出目标蛋白质，其原因可能是目的基因未导入受体细胞、目的基因不能在转基因生物的乳腺细胞内表达。
答案：(1)抗原 (2)脱氧核苷酸 PCR (3)基因表达载体 标记基因 (4)转化 显微注射 目的基因未导入受体细胞、目的基因不能在转基因生物的乳腺细胞内表达
14．长期高血糖可引发血管细胞衰老。科研人员为研究S蛋白在因高血糖引发的血管细胞衰老中的作用，以腺病毒为载体将编码S蛋白的S基因导入血管细胞，实现S蛋白在血管细胞中的大量表达。
(1)腺病毒的遗传物质为DNA，其复制需要E1、E2、E3基因共同完成。为将S基因导入腺病毒，科研人员首先构建了含S基因的重组质粒，如图1所示。在构建含S基因的重组质粒时，通过________________________的方法可鉴定重组质粒是否插入了S基因。将图1中含S基因的重组质粒用__________酶切割后，获得改造后的腺病毒DNA；将其导入A细胞(A细胞含有E3基因，可表达E3蛋白)，如图2所示。腺病毒DNA在A细胞内能够____________________________________________，从而产生大量重组腺病毒，腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上。
(2)综合上述信息，从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(写出2点)。
(3)用含S基因的重组腺病毒分别感染正常人及糖尿病患者的血管细胞，使S蛋白在血管细胞中大量表达。对正常人、糖尿病患者及二者转入S基因后血管细胞中能促进细胞衰老的I蛋白进行检测，结果如图3所示(颜色越深代表表达量越高)。可用________________方法检测I蛋白的表达量，实验结果显示______________血管细胞中I蛋白表达量最高，推测S蛋白对高血糖引发的血管细胞衰老的作用及机制是________________________________________________________________________。
解析：(1)在构建含S基因的重组质粒时，通过设计S基因特异的引物进行PCR的方法可鉴定重组质粒是否插入了S基因。根据图1中限制酶的切割位点可知，图1中含S基因的重组质粒用PacⅠ酶切割后，获得改造后的腺病毒DNA；腺病毒DNA在A细胞内能够复制并指导腺病毒外壳蛋白的合成从而产生大量重组腺病毒，腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上。(2)综合上述信息，从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点是重组腺病毒只能在A细胞中复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不含致病基因。(3)检测I蛋白的表达量可用抗原—抗体杂交的方法，图3中显示糖尿病患者血管细胞中I蛋白表达量最高，推测S蛋白对高血糖引发的血管细胞衰老的作用及机制是S蛋白通过降低I蛋白的含量，抑制高血糖引发的血管细胞衰老。
答案：(1)设计S基因特异的引物进行PCR PacⅠ 复制并指导腺病毒外壳蛋白的合成 (2)重组腺病毒只能在A细胞中复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不含致病基因 (3)抗原—抗体杂交 糖尿病患者(或“2组”) S蛋白通过降低I蛋白的含量，抑制高血糖引发的血管细胞衰老
1．切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(×)
2．E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(×)
3．载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。(√)
4．用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列。(×)
5．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(×)
6．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(×)
7．在电泳时，DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关，与DNA分子的带电量和带电性质无关。(×)
8．“设计试管婴儿”与“试管婴儿”的技术操作过程是完全相同的。(×)
系统学习(一) 重组DNA技术的基本工具(固基点)
主干知识·记准理清
(一)基因工程的概念
(二)基因工程的基本工具
1．限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
存在
主要存在于原核生物中
作用
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
特性
一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的位点上切割DNA分子
结果
产生黏性末端或平末端
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
种类
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，连接两个DNA片段
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
类型
最常用：质料；其他：噬菌体、动植物病毒等
条件
①稳定并自我复制或整合到受体DNA上，使目的基因稳定存在且数量可扩增；
②具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插放；
③具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选
作用
携带外源DNA片段进入受体细胞
(三)DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
(1)DNA不溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2_mol/L的NaCl溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2．实验步骤
————————————■链教材资料·发展科学思维■————————————
1．(选择性必修3 P71旁栏思考拓展)限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
2．(选择性必修3 P72旁栏思考拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。
提示：不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链的末端。
题点考法·练全练通
考法(一) 考查基因工程的操作工具
1．下面是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图(箭头表示切点，切出的断面为黏性末端)。下列叙述不正确的是( )
A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性
B．限制酶2和3识别的序列都包含6个碱基对
C．限制性酶1和酶3剪出的黏性末端相同
D．能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
解析：选D 由图可知，限制酶2和3识别的序列分别是CCGCGG和GGATCC，均为6个碱基对，B正确；限制酶1和3剪出的黏性末端相同，均为GATC，C正确；限制酶只能识别特定的DNA序列，且具有专一性，因此三种限制酶均不能识别和切割RNA中的核糖核苷酸序列，A正确，D错误。
2．图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ 三种限制酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________________________________________________________________________。
解析：(1)由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因产物。(3)常见的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4 DNA连接酶。
答案：(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 (3)E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶
[归纳拓展] 与DNA有关的几种酶的比较
酶种类
作用底物
作用部位
作用结果
限制酶
DNA分子
磷酸二酯键
将DNA切成两个或多个片段
DNA连接酶
DNA分子片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
脱氧核苷酸
磷酸二酯键
以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到另一条短的单链末端
解旋酶
DNA分子
碱基对中的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
DNA水解酶
DNA分子
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
考法(二) 考查DNA的粗提取与鉴定的原理和操作
3．(2022·山东高考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：选B 低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有某些蛋白质不溶于酒精，在体积分数为95%的冷酒精中与DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
4．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，相关叙述正确的是( )
A．图1中溶液a是去掉上清液的研磨液
B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
解析：选B 图1中溶液a是研磨液静置几分钟后取的上清液，A错误；图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精，C错误；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺出现蓝色，D错误。
系统学习(二) 基因工程的操作程序与应用(释疑点)
基础知识·全面掌握
(一)基因工程的操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
②筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因。
①原理：DNA复制。
②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
③扩增过程。
过程
说明
图解
变性
温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
2．基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成。
(3)基因表达载体的构建过程。
3．将目的基因导入受体细胞
项目
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、花粉管通道法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
4．目的基因的检测与鉴定
检测水平
检测目的
检测方法
分子水平
目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上
PCR
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交
个体水平
转基因生物是否表现出相应的特性
如抗虫、抗病的接种实验
(二) 基因工程的应用
1．基因工程在农牧业方面的应用
①转基因抗虫植物；②转基因抗病植物；③转基因抗除草剂植物；④改良植物的品质；⑤提高动物的生长速率；⑥改善畜产品的品质。
2．基因工程在医药卫生领域的应用
①对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们生产药物。
②让哺乳动物批量生产药物。
③可能使建立移植器官工厂的设想成为现实。
3．基因工程在食品工业方面的应用
利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
————————————■链教材资料·发展科学思维■————————————
1．(选择性必修3 P78图3-5)PCR反应过程示意图分析：
(1)PCR技术的原理是什么？
提示：体外DNA双链复制。
(2)由图分析可知，在PCR反应过程中需要两种引物，原因是什么？
提示：DNA由两条反向平行的脱氧核苷酸链组成，DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。
2．(选择性必修3 P80正文拓展思考)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？
提示：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。
3．(选择性必修3 P81正文拓展思考)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上？
提示：Ti质粒上T-DNA也称为可转移DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。
重难盲点·讲练疏通
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基因工程的操作步骤
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1．目的基因的获取方法
(1)利用PCR获取和扩增目的基因。
(2)人工合成目的基因。
①逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：
②化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：
(3)从基因文库中获取目的基因。
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
2．目的基因的检测与鉴定方法
(1)载体上标记基因的标记原理。
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞，原理如图所示：
(2)目的基因的检测。
①使用PCR等技术，检测目的基因是否插入转基因生物染色体DNA上及目的基因是否转录出特定mRNA。
②采用抗原—抗体杂交技术，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)，与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。
③采用抗虫、抗病毒等接种实验，进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。
[典例1] 人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。如图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的过程，图中Tetr表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，五种限制酶的识别序列及切割位点如表所示，请回答以下问题：
限制酶
BamHⅠ
HaeⅢ
BclⅠ
Sau3AⅠ
NotⅠ
识别序列及切割位点
(1)①过程常采用的方法是 ______________。
(2)要将人乳铁蛋白基因插入质粒，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是 ________________。构建基因表达载体时，需要将人乳铁蛋白基因嵌入 __________________之间，这样人乳铁蛋白基因才能在乳腺细胞中表达。
(3)据图分析筛选含有重组质粒的受体细胞首先需要在含 ______________(填“四环素”“氨苄青霉素”或“四环素或氨苄青霉素”)的培养基上进行。
(4)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为 ____________，对于该部位，这两种酶 ____________(填“都不能”或“只有一种能”)切开。
[解析] (1)将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法。(2)根据表中五种酶的识别序列及切割位点可知，限制酶Sau3AⅠ还可以切割限制酶BclⅠ和限制酶BamHⅠ的识别序列，因此要将人乳蛋白基因插入载体，在只允许用一种限制酶切割载体和人乳铁蛋白基因的情况下，应选择限制酶Sau3AⅠ。构建基因表达载体时，需要将人乳铁蛋白基因嵌入到启动子和终止子之间，这样人乳铁蛋白基因才能在乳腺细胞中表达。(3)用限制酶Sau3AⅠ切割后会破坏四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的受体细胞可在含有氨苄青霉素的培养基上生存下来。(4)根据表格中各种限制酶的识别序列和切割位点可知，若BamH Ⅰ酶切的DNA末端与Bcl Ⅰ酶切的DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，这两种酶都不能切开。
[答案] (1)显微注射法 (2)Sau3AⅠ 启动子和终止子 (3)氨苄青霉素 (4) 都不能
[对点练习]
1．下列关于基因工程的叙述，正确的是( )
A．培育转基因动物时选择的受体细胞只能是动物的受精卵
B．构建重组质粒时必须选择相同的限制性内切核酸酶处理载体质粒与目的基因
C．经检测发现抗除草剂基因成功导入某抗盐植物，该植物一定具有抗除草剂及抗盐性状
D．用氯化钙处理大肠杆菌，增加其细胞壁的通透性，可提高重组DNA分子的导入成功率
解析：选D 培育转基因动物时选择的受体细胞最好是动物的受精卵，也可以是胚胎干细胞或核移植形成的重组细胞，A错误；构建重组质粒时一般选择相同的限制性内切核酸酶处理载体质粒与目的基因，也可以选择不同的限制酶处理，但必须产生相同的黏性末端，B错误；目的基因成功导入受体细胞后不一定能成功表达，因此经检测发现抗除草剂基因成功导入某抗盐植物，该植物不一定具有抗除草剂及抗盐性状，C错误。
2.紫苜蓿是一种重要的牧草。某研究团队拟将耐盐基因HAL1导入紫苜蓿中培育耐盐牧草。具体实验流程如图所示。下列操作错误的是( )
A．可选用氯化钙处理农杆菌，有利于重组Ti质粒导入农杆菌
B．将农杆菌与苜蓿愈伤组织一起培养一段时间后，往往需要添加适量抗生素抑制农杆菌生长
C．为确认转基因苜蓿是否培育成功，需对苜蓿植株进行耐盐检测
D．植物细胞具有全能性，所以诱导形成苜蓿幼苗的成功率与苜蓿愈伤组织的基因型无关
解析：选D 用氯化钙处理农杆菌可使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，这样有利于重组Ti质粒导入，A正确；将农杆菌与苜蓿愈伤组织一起培养一段时间后，需要用抑菌类抗生素抑制农杆菌的生长，以防止农杆菌过度生长对转化组织产生毒害作用，B正确；要判断耐盐性的紫花苜蓿是否培育成功，还需进行个体水平的鉴定，即让转基因紫花苜蓿进行耐盐性试验，C正确；愈伤组织中导入目的基因改变了其遗传物质，所以诱导形成苜蓿幼苗的成功率与苜蓿愈伤组织的基因型有关，D错误。
3．TALEN是一种靶向基因操作技术，该技术利用了TAL靶向识别单元对靶向基因的识别作用和FokI蛋白对靶向基因的切割作用实现了对特定靶向基因的敲除。相关操作如下：
(1)TAL靶向识别单元的构建。TAL靶向识别单元为间隔32个氨基酸的双连氨基酸(即两个相连的氨基酸)序列。不同的双连氨基酸分别与靶向基因中的A、T、C、G有恒定的对应关系，根据靶向基因的碱基序列可以设计出双连氨基酸序列。
(2)目的基因的获取与扩增。根据TAL靶向识别单元中双连氨基酸序列和FokI蛋白的氨基酸序列，可按照__________________________________，最终合成目的基因(写出具体步骤)。再通过PCR技术进行扩增。扩增前，需根据目的基因的核苷酸序列设计出____种引物；扩增时，需先加热至90～95 ℃，再冷却至50～60 ℃，再加热至70～75 ℃，此操作的目的是__________________________________________________。
(3)利用质粒和目的基因构建基因表达载体。在构建的基因表达载体中，启动子应位于基因的上游，它是________________的部位；标记基因的作用是________________________________________________________________________。
(4)目的基因的表达与检测。目的基因进入受体细胞后，在受体细胞中维持稳定和表达的过程，称为________。从分子水平上，通过______方法可检测基因工程操作是否成功。
(5)靶向基因的敲除。TAL靶向识别单元能够识别特定的靶向基因序列，FokI蛋白能够从被识别的靶向基因两端切断磷酸二酯键，从而将靶向基因从原双链DNA上敲除。由此推测，FokI蛋白实际上是一种________。
解析：(2)已知TAL靶向识别单元中双连氨基酸序列和FokI蛋白的氨基酸序列，可先推测出信使RNA序列，再推测出目的基因的核苷酸序列，然后利用化学法以单个核苷酸为原料最终合成目的基因，再通过PCR技术进行扩增。PCR扩增前，需根据目的基因的核苷酸序列设计出2种引物；扩增时，需先加热至90～95 ℃使DNA变性后解聚为单链，再冷却至50～60 ℃使引物结合到互补DNA链上，再加热至70～75 ℃促进DNA聚合酶发挥作用，开始互补链的合成。(3)在构建的基因表达载体中，有启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位；标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。(4)目的基因进入受体细胞后，在受体细胞中维持稳定和表达的过程，称为转化。分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入目的基因：PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。(5)FokI蛋白能够从被识别的靶向基因两端切断磷酸二酯键，从而将靶向基因从原双链DNA上敲除。由此推测，FokI蛋白实际上是一种限制性内切核酸酶。
答案：(2)先推测出信使RNA序列，再推测出目的基因的脱氧核苷酸序列，利用化学法以单个核苷酸为原料 2 加热使DNA变性后解聚为单链，冷却使引物结合到互补DNA链上，再加热促进DNA聚合酶发挥作用，开始互补链的合成 (3)RNA聚合酶识别和结合 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (4)转化 抗原—抗体杂交(或PCR技术) (5)限制性内切核酸酶(限制酶)
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分析基因工程的应用
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乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别
比较内容
乳腺生物反应器
工程菌
含义
指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白
指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系
受体基因结构与人类基因结构差异
动物基因结构与人类的基因结构基本相同
细菌和酵母菌的基因结构与人类有较大差异
基因表达
合成的药物蛋白与天然蛋白质相同
细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞
动物受精卵
微生物细胞
目的基因导入方式
显微注射法
Ca2＋处理法
生产条件
不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大
需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取
从动物乳汁中提取
从微生物细胞或其培养液中提取
[典例2] (2021·广东高考)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有________________________________(答出两种即可)。
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有____________________(答出两种即可)。
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法是
________________________________________________________________________。
(4)依上图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是________________。在分子水平上，可以通过改变____________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
[解析] (1)分析题干，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析法、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用Ca2＋处理大肠杆菌，使其成为易于接受外来DNA分子的感受态细胞。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)依题图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
[答案] (1)基因文库中获取、人工合成法 (2)盐析法、酶解法或高温变性法 (3)感受态 抗原—抗体杂交技术 (4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
[对点练习]
4．核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。如图为针对某种RNA病毒抗原(S蛋白)研制DNA疫苗和RNA疫苗的思路。下列相关叙述正确的是( )
A．该疫苗中核酸可作为抗原刺激人体产生体液免疫
B．步骤①中对S蛋白基因进行扩增，需要用到DNA聚合酶和解旋酶
C．步骤②构建重组表达载体，其S基因应插入载体，只需不破坏标记基因
D．核酸疫苗能在人体细胞中成功表达S蛋白，说明了生物界共用一套密码子
解析：选D 该疫苗中核酸用来编码抗原蛋白，核酸本身不能作为抗原刺激人体产生体液免疫，A错误；步骤①中对S蛋白基因进行扩增，利用的是PCR技术，该过程需要用到耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶，B错误；步骤②构建重组表达载体，其S基因应插入载体，不能破坏标记基因、启动子序列和终止子序列等，C错误；核酸疫苗中的核酸源自病毒等病原体，其在人体细胞中能成功表达S蛋白，说明了生物界共用一套密码子，D正确。
5．应用生物工程技术可获得人们需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题：
(1)要获得抗虫基因，可采用____________________等方法，基因工程的核心是_____________________。
(2)如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是____________，原因是______________________。若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其用________处理，使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
(3)在培育转人生长激素基因牛的过程中，①过程需要的工具酶是__________________，②过程常用的方法是______________。
(4)转人生长激素基因牛可通过分泌的乳汁来生产人生长激素，在基因表达载体中，人生长激素基因的首端必须含有______________。
解析：(1)获得目的基因的方法有PCR技术扩增、人工合成等，基因工程的核心是构建基因表达载体。(2)动物受精卵具有全能性，能发育成完整个体，要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是受精卵。若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其用Ca2＋处理，使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(3)①是目的基因与载体结合的过程，需要限制酶、DNA连接酶；②是重组质粒导入受体细胞的过程，常用的方法是显微注射法。(4)基因表达载体的首端必须含有启动子。
答案：(1)PCR技术扩增、人工合成 构建基因表达载体 (2)受精卵 动物受精卵具有全能性 Ca2＋
(3)限制酶、DNA连接酶 显微注射法 (4)启动子
6．(2023·南昌模拟)蓝细菌中的ictB蛋白能高效转运和浓缩CO2从而提高细胞光合速率。我国科学家构建了叶片特异性启动子Cab(叶绿体捕光色素蛋白Cab基因启动子)驱动的蓝细菌ictB基因表达载体，并通过农杆菌转化法获得了转ictB基因水稻，大大提高了水稻的产量。在ictB基因载体的构建中，含Cab启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图1所示。请回答下列问题：
(1)为使重组DNA分子能定向插入T-DNA中，可用PCR的方法在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端添加的序列所对应的限制酶是________，N端添加的序列所对应的限制酶是__________。经过酶切的重组DNA分子和Ti质粒进行连接时，可选用______________________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要________种酶。
(2)将农杆菌液浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入________进行筛选，最终获得多个水稻株系a1、a2、a3、a4。对a1～a4四个水稻株系的ictB蛋白表达量进行测定，结果如图2，其中a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是________________________________。检测应选用的植物器官是________，原因是____________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)据图可知，ictB基因中有BamHⅠ的酶切位点，故不能选择BamHⅠ，又因为Sau3AⅠ也可识别BamHⅠ的酶切位点，故也不能选择该酶，又由于SpeⅠ能切割Cab启动子，也不能选择，故只能选择BglⅠ和EcoRⅤ，再根据启动子的方向可知，M端添加的序列所对应的限制酶是BglⅠ，N端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅤ；由于EcoRⅤ酶切后是平末端，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端，故经过酶切的重组DNA分子和Ti质粒进行连接时，可选用T4 DNA连接酶；添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要4种酶，分别是BglⅠ、EcoRⅤ、T4 DNA连接酶和Sau3AⅠ(切割载体，BglⅠ与Sau3AⅠ切割后的黏性末端一样)。
(2)由图1可知潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T-DNA上，随T-DNA整合到水稻细胞的染色体DNA上，所以将农杆菌浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，筛选出的愈伤组织可(再)分化形成丛芽，最终获得多个转基因水稻株系；蛋白质的表达量与基因的表达有关，故a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是其没有导入目的基因或者目的基因没有表达；由于Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择性的在叶片中表达，故检测应选用的植物器官是叶片。
答案：(1)Bgl Ⅰ EcoR Ⅴ T4 DNA连接酶 4 (2)潮霉素 a4水稻株系中目的基因未表达 叶片 Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择性的在叶片中表达
系统学习(三) 蛋白质工程及DNA片段的扩增及电泳鉴定(固基点)
主干知识·记准理清
(一)蛋白质工程的原理和应用
1．蛋白质工程的概念
基础
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
目的
合成满足人类生产和生活需求的蛋白质
手段
基因改造或基因合成
2.蛋白质工程的基本原理
3．蛋白质工程的应用
(1)医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
(2)其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。
(3)农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，增强防治病虫害的效果。
(二)DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验基础
(1)PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
2．PCR实验操作步骤
3．DNA的测定
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。
————————————■链教材资料·发展科学思维■————————————
1．(选择性必修3 P94正文拓展分析)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？
提示：应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因有：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。
2．(选择性必修3 P85“结果分析与评价”)电泳鉴定时未出现特异性条带的原因有哪些？
提示：模板DNA出现污染；Taq DNA聚合酶出现质量问题；引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体；复性时的温度过低；PCR循环次数过多；等等。
题点考法·练全练通
考法(一) 考查蛋白质工程的原理和应用
1．某种病毒通过其表面刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)与人体细胞表面的ACE2受体相互作用，侵入人体细胞。研究人员设计并合成了一种自然界不存在的LCB1蛋白药物，可识别并紧密结合S蛋白的RBD，以干扰该病毒的感染。下列叙述错误的是( )
A．LCB1可能与ACE2受体的某些区域结构类似
B．LCB1可以依据S蛋白的RBD结构进行设计
C．LCB1是通过细胞中原有的基因表达产生的
D．LCB1设计和合成是通过蛋白质工程实现的
解析：选C 由题干信息可知，S蛋白的RBD与人体细胞表面的ACE2受体相互作用；而LCB1可识别并紧密结合S蛋白的RBD，阻止S蛋白的RBD与ACE2受体结合，这说明LCB1可能与ACE2受体的某些区域结构类似，LCB1可以依据S蛋白的RBD结构进行设计，A、B正确；LCB1是人工设计并合成的一种自然界不存在的蛋白质，故LCB1并不是通过细胞中原有的基因表达产生的，而基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，故LCB1设计和合成是通过蛋白质工程实现的，C错误，D正确。
2．近年来，蛋白质工程与基因工程的结合使得干扰素生物工程的研究取得了更大的进展。回答下列有关生物工程生产干扰素的问题。
(1)根据人们对干扰素结构和功能上的需求，将干扰素的第17位半胱氨酸替换成丝氨酸，这种生物工程属于________________。
(2)可通过点突变技术使干扰素基因中的碱基对发生改变，将改造后的基因与载体构建成__________后导入大肠杆菌生产干扰素。干扰素是一种糖蛋白，在大肠杆菌内不能加糖基团，这是因为________________________________________________________。用家蚕来生产干扰素更为理想，生产过程中，用到了家蚕核型多角体病毒(NPV)，NPV的作用是充当基因工程的________。
(3)人们设想，如果能将干扰素基因导入哺乳动物的受精卵，再将受精卵进行______________至桑葚胚或囊胚阶段，然后进行____________。可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，人们把这种转基因动物称为______________。若该设想变为现实，则干扰素的活性及产量均会大幅提高。
解析：(1)根据人们对干扰素结构和功能上的需求，将干扰素的第17位半胱氨酸替换成丝氨酸，即改造蛋白质，因此这种生物工程属于蛋白质工程。(2)将改造后的基因与载体构建成基因表达载体。干扰素是一种糖蛋白，在大肠杆菌内不能加糖基团，原因是糖基团是在内质网中加入的，而大肠杆菌为原核生物，细胞中无内质网。家蚕核型多角体病毒(NPV)可以充当基因工程的载体。(3)将目的基因导入哺乳动物的受精卵，再将受精卵进行早期胚胎培养至桑葚胚或囊胚阶段，然后进行胚胎移植，可以获得转基因动物。可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，这种转基因动物称为乳腺生物反应器。
答案：(1)蛋白质工程 (2)基因表达载体 糖基团是在内质网中加入的，大肠杆菌为原核生物，细胞中无内质网 载体 (3)早期胚胎培养 胚胎移植 乳腺生物反应器
[归纳拓展] 蛋白质工程与基因工程的区别和联系
项目
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新基因→获得所需要的蛋白质
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
考法(二) 考查DNA片段的扩增及电泳鉴定
3．下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR利用了DNA的热变性原理
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
解析：选C 缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存，使用前，将所需试剂从冰箱取出，放在冰块上缓慢融化，C错误。
4．下列有关电泳的叙述，错误的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度
C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
解析：选C 进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。
5．在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述中，不正确的是( )
A．该载体最可能为环状DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D．限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
解析：选D 当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
系统学习(四) 生物技术的安全性和伦理问题(固基点)
主干知识·记准理清
1．转基因产品的安全性
2．关注生殖性克隆人
(1)治疗性克隆和生殖性克隆的比较。
项目
治疗性克隆
生殖性克隆
概念
利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的
通过克隆技术产生独立生存的新个体
目的
用于医学研究或治疗疾病
用于生育，产生新个体
水平
细胞水平
个体水平
联系
都属于无性生殖，产生的新个体或新组织的遗传物质均不发生变化
(2)生殖性克隆人面临的伦理问题。
①生殖性克隆人“有违人类尊严”。
②生殖性克隆人是人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人。
③克隆技术还不成熟，生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题。
(3)重要过程。
3．试管婴儿与设计试管婴儿的异同点
(1)不同点。
①所用技术手段：设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断(如诊断血型、诊断性别、诊断HLA的类型等)，试管婴儿不需进行遗传学诊断。
如下图，设计试管婴儿比试管婴儿多了d过程：
②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗。
(2)相同点。
都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
4．生物武器
(1)种类。
①致病菌类：例如，炭疽杆菌、霍乱弧菌等。
②病毒类：天花病毒，某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等。
③生化毒剂类：肉毒杆菌毒素等。
(2)特点：致病能力强，攻击范围广。
(3)散布途径：可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。
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1．(选择性必修3 P106正文发掘)生殖性克隆与治疗性克隆最主要的区别是什么？
提示：克隆的目的不同，生殖性克隆的目的是用于生育，产生新个体；治疗性克隆的目的是治疗人类疾病。
2．(选择性必修3 P112正文发掘)我国对待生物武器的态度与转基因产品安全性的态度有何不同？
提示：对待生物武器的态度是在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。对待转基因产品安全性的态度是趋利避害，而不能因噎废食。
题点考法·练全练通
考法(一) 考查生物技术的安全性
1．下列哪项是转基因生物存在安全性问题的证据？( )
A．世界上数亿计的人口食用转基因农作物
B．转基因生物合成的营养物质与天然品种“没有差别”
C．转基因生物合成的某些蛋白质可能对某些人造成过敏反应
D．转基因产品经过了多环节、严谨的安全性评价
解析：选C 转基因生物合成的某些蛋白质可能对某些人造成过敏反应，是转基因生物存在安全性问题的证据，C符合题意。
2．为了防止转基因作物的目的基因通过花粉转移给自然界中的其他植物，科学家设法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中，其原因是( )
A．叶绿体基因组不会进入到生殖细胞中
B．受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞
C．转基因植物与其他植物间不能通过花粉发生基因交流
D．植物杂交的后代不会出现一定的性状分离比
解析：选B 受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞，精子中几乎不含叶绿体基因组，即叶绿体中的目的基因不会通过花粉传递给下一代，将目的基因导入叶绿体基因组中可防止造成基因污染，B正确。
考法(二) 考查生物技术的伦理问题
3．(2023·浙江1月选考)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是( )
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
解析：选D 试管婴儿是允许的，A错误；治疗性克隆需要监控和审查，B错误；生殖性克隆存在伦理道德方面的风险，C错误；我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，D正确。
4．第三代试管婴儿技术也称胚胎植入前遗传学诊断(PGD)，是在试管婴儿技术基础上出现的。精子和卵子形成受精卵发育成早期胚胎后，要在植入子宫前进行基因检测，再进行胚胎移植。目前PGD能诊断一些单基因缺陷引发的疾病，如血友病等。回答有关问题：
(1)试管婴儿技术包括____________、早期胚胎培养和胚胎移植。
(2)试管婴儿技术操作时，首先要采集“卵子”。在采集“卵子”之前，需要给母亲注射适量的促性腺激素。目的是__________________。从母亲的卵巢中采集的“卵子”________(填“能”或“不能”)直接参与受精作用。在精子入卵后，会立即发生______________，拒绝其他精子再进入卵内。
(3)受精卵发育成4或8细胞胚时，若要进行血友病基因检测，可采用的检测技术有____________________________(答出2点)。
(4)胚胎移植的实质是_______________________________________________________。
(5)随着第三代试管婴儿技术的不断发展，将为不孕及基因缺陷患者带来福音。如果滥用该技术，将会对社会产生负面影响，滥用的表现有________________________________________________________________________。
解析：(1)试管婴儿技术包括体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。(2)试管婴儿技术操作时，给母亲注射适量的促性腺激素，目的是促进母亲超数排卵，获得更多的卵细胞。从卵巢中采集的“卵子”不能直接参与受精作用，需在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。在精子入卵后，卵细胞膜会立即发生卵细胞膜反应，拒绝其他精子再进入卵内。(3)对胚胎细胞进行基因检测，可采用PCR技术对目标基因进行扩增，或制备分子探针进行(DNA)分子杂交进行检测。(4)胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理状态下空间位置的转移。(5)滥用第三代试管婴儿技术的表现主要为设计婴儿的性别。
答案：(1)体外受精 (2)促进母亲超数排卵 不能 卵细胞膜反应 (3)(DNA)分子杂交、PCR (4)早期胚胎在相同生理状态下空间位置的转移 (5)设计婴儿的性别
[课时验收评价]
1．若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，其原因不包括( )
A．目的基因无法插入受体细胞DNA
B．目的基因无法复制
C．目的基因无转录所需的启动部位
D．目的基因与受体细胞遗传信息传递方式不同
解析：选D 不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点，无表达所需的启动子。
2．下列有关生物技术与伦理的说法错误的是( )
A．生命科学的发展必须受伦理的规范和制约
B．实施生命科学研究必须遵循：自主、不伤害、善行和公正的原则
C．关注伦理问题，就是完全限制生命科学的发展
D．对于生物技术应科学地控制，合理地使用，使它的发展对人类最有益
解析：选C 关注伦理问题，并不是完全限制生命科学的发展。对于生物技术，人类所面临的关键问题是如何科学地进行控制，并合理地使用，使它的发展对人类最有益。
3．蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，有广阔的发展前景。下列关于蛋白质工程的叙述正确的是( )
A．由于需要对蛋白质直接改造，因此操作更难
B．由于蛋白质不能遗传，因此蛋白质工程的产物不能大量生产
C．蛋白质工程也需要设计出相应的基因
D．蛋白质工程发展得已经非常成熟，在各个领域有广泛应用
解析：选C 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，是在分子水平上对基因分子直接进行操作，使其遗传物质发生改变，可以遗传给下一代，A、B错误；蛋白质工程对基因分子直接进行操作，需要推测出应有的氨基酸序列，设计出相应的基因，C正确；蛋白质工程的发展并不成熟，仍需一段时间提升，其目前并不能在各个领域广泛应用，D错误。
4．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化其水解。将几丁质酶基因转入菊花体内，可增强其抗真菌病的能力。下列有关叙述错误的是( )
A．将几丁质酶基因插入Ti质粒的TDNA上构建表达载体
B．可通过显微注射法将农杆菌导入菊花受体细胞
C．可用PCR等技术检测目的基因是否成功导入
D．可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度
解析：选B Ti质粒的TDNA可以转移到受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体DNA上，根据这一特点，构建表达载体时，应该将目的基因即几丁质酶基因插入到Ti质粒的TDNA上，A正确；可通过农杆菌转化法将农杆菌导入菊花受体细胞，显微注射法常用于将目的基因导入动物受精卵中，B错误；可用PCR等技术检测目的基因是否成功导入受体细胞，C正确；根据题干信息“几丁质酶基因转入菊花体内，可增强其抗真菌病的能力”，故可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度，D正确。
5．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别为：— AATTG—和— AATTC—。如图表示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程，下列相关叙述错误的是( )
A．用限制酶EcoRⅠ切割目的基因，同时用限制酶MunⅠ切割质粒
B．两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对
C．限制酶能使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
D．将重组质粒同时用2种限制酶切割则会形成2种DNA片段
解析：选D 由图可知，目的基因两侧都是限制酶EcoRⅠ的切割位点，因此应选用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子；质粒中含有限制酶MunⅠ和EcoRⅠ的切割位点，但EcoRⅠ的切割位点位于标记基因中，用其切割会破坏标记基因，因此为保证重组质粒表达载体的准确构建，应选用限制酶MunⅠ切割质粒，A正确。将重组质粒同时用2种限制酶切割，则会形成3种DNA片段，D错误。
6．利用人胰岛B细胞构建cDNA 文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．该文库保存的人类基因没有完整的基因结构
B．探针通常用荧光或者放射性同位素进行标记
C．不能用PCR技术从该文库筛选出目的基因
D．该基因文库还可能存在呼吸酶的相关基因
解析：选C 由于cDNA文库是以mRNA为模板，经逆转录酶催化，在体外逆转录成cDNA，所以形成的cDNA中只包含基因结构中编码区的部分序列，即该文库保存的人类基因没有完整的基因结构，A正确；探针是可以与被检测的目的基因序列进行碱基互补配对的带标记的单链DNA片段，标记可以是荧光或者放射性同位素，B正确；凡是在胰岛B细胞内表达的基因，都可以用PCR技术从该文库筛选出目的基因，C错误；由于呼吸酶基因在胰岛B细胞内能够表达，所以该基因文库还可能存在呼吸酶的相关基因，D正确。
7．OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示)，利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是( )
A．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量
B．四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板
C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞
D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译
解析：选A 可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高，A正确；由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLO1启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同，四个基因转录时并不都以DNA的同一条单链为模板，B错误；卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C错误；由题意知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入到水稻细胞中染色体的DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，D错误。
8．矮牵牛花瓣紫色的深浅由花青素的含量高低决定，花青素由查耳酮合酶(CHS)催化合成。为获得紫色更深的矮牵牛，科研人员将CHS基因导入野生型紫花矮牵牛叶肉细胞中，得到的转基因植株花色反而出现了浅紫色。下列叙述正确的是( )
A．可以从矮牵牛的幼嫩叶肉细胞中用逆转录酶和PCR技术相结合，获取CHS基因
B．农杆菌转化法和基因枪法都可以将获得的CHS基因直接导入叶肉细胞中完成转化过程
C．可以用同位素标记的CHS基因检测目的基因是否成功导入叶肉细胞
D．转基因植株花色为浅紫色的原因可能是CHS基因与载体反向连接，转录出的mRNA与内源基因的mRNA互补
解析：选D CHS基因只在花瓣细胞中表达，因此可以从矮牵牛的花瓣细胞中用逆转录酶和PCR技术相结合，获取CHS基因，A错误；将目的基因导入受体细胞前都需要先构建基因表达载体，因此农杆菌转化法和基因枪法都不可以将获得的CHS基因直接导入叶肉细胞中完成转化过程，B错误；叶肉细胞本身就含有CHS基因，因此不可以用同位素标记的CHS基因检测目的基因是否成功导入叶肉细胞，C错误。
9．科学研究发现Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，通过与其相应的配体结合调控细胞增殖、分化和凋亡等。为了研究Notch基因表达产物的功能，科学家构建含Notch基因的重组质粒，并在大肠杆菌中表达。下列相关分析错误的是( )
A．可以用逆转录的方法和PCR技术获得Notch基因
B．利用PCR技术扩增目的基因时，高温代替了解旋酶的功能
C．可通过核酸分子杂交的方法判断导入的基因是否成功表达
D．基因表达载体的构建是基因工程的核心
解析：选C 获取目的基因的方法有从基因文库中获取、利用PCR扩增、人工合成等，故可以用逆转录的方法和PCR技术获得Notch基因，A正确；利用PCR技术扩增目的基因时，高温变性可以将DNA双链打开，代替解旋酶的功能，B正确；判断导入的基因是否成功表达，需要用抗原—抗体杂交技术，C错误。
10．构建基因表达载体时，可利用碱性磷酸单酯酶催化载体的5′-P变成5′-OH，如图所示。将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′-OH与3′-OH不能连接而形成切口(nick)。下列说法错误的是( )
A．经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化
B．外源DNA也必须用碱性磷酸单酯酶处理
C．T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端
D．重组DNA经过2次复制可得到不含nick的子代DNA
解析：选B 将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′-OH与3′-OH不能连接而形成切口(nick)，因此经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化，A正确；外源DNA不能用碱性磷酸单酯酶处理，如用碱性磷酸单酯酶处理，载体与外源DNA不能连接形成重组DNA，B错误；T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，C正确；DNA是半保留复制，重组DNA经过2次复制，可得到2个不含nick的子代DNA，D正确。
11．B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞(2n)和精子(n)中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下图实验(Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，融合基因表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能)。下列相关叙述错误的是( )
A．由于DNA聚合酶不能合成导致B基因在水稻卵细胞中不能转录
B．过程①中TDNA以双链形式整合到受体细胞的染色体DNA上
C．过程②转化筛选水稻愈伤组织时，需在培养基中加入潮霉素
D．可通过检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光来鉴定B基因是否表达
解析：选A 转录过程不需要DNA聚合酶，需要RNA聚合酶，A错误；由图可知，过程①中TDNA以双链形式整合到受体细胞的染色体DNA上，B正确；由图可知，TDNA上含有潮霉素抗性基因，因此过程②转化筛选水稻愈伤组织时，需在培养基中加入潮霉素，C正确；由图可知B基因与Luc基因连接形成BLuc融合基因，因此可通过检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光来鉴定B基因是否表达，D正确。
12．(2022·湖南高考)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是________，物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是__________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有____________________、____________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是_________________________________________________________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的__________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路__________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)据题图分析可知，物质a是氨基酸序列(多肽链)，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几种密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)实验设计思路见答案。
答案：(1)氨基酸序列(多肽链) mRNA 密码子的简并性 (2)从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA双链复制 (3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一只动物(如家兔)的血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固情况
13．幽门螺杆菌是一种很容易传染的细菌，尤其是家庭内部成员之间，发生交叉感染的概率很高。幽门螺杆菌感染与胃炎、消化道溃疡、胃癌等主要上消化道疾病密切相关。某高校研发的幽门螺杆菌疫苗为基因工程疫苗，其有效成分是该菌表面的一种蛋白质。请回答下列有关问题：
(1)细菌表面的蛋白质可作为________，刺激人体的免疫系统产生相关生理反应。
(2)在疫苗的制备过程中，可通过细菌表面蛋白质的氨基酸序列推测出目的基因的______________序列，人工合成该目的基因，再利用__________技术对目的基因进行扩增。
(3)基因工程的核心步骤是________________的构建，该过程构建的产物中除了目的基因外，还必须有启动子、终止子和____________。
(4)目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持并表达的过程，称为________。利用动物乳腺生物反应器生产该疫苗时，需用____________技术将目的基因导入动物的受精卵中，再利用胚胎工程将受精卵培育成转基因动物，若该转基因动物的乳腺细胞没有分泌出目标蛋白质，其原因可能是_______________________________________________(答出两点即可)。
解析：(1)细菌表面的蛋白质可作为抗原，刺激人体的免疫系统产生相关特异性免疫。(2)在疫苗的制备过程中，可通过细菌表面蛋白质的氨基酸序列推测出目的基因的脱氧核苷酸序列，人工合成该目的基因，再利用PCR技术对目的基因进行扩增。(3)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，必须含有目的基因、启动子、终止子和标记基因。(4)目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持并表达的过程，称为转化。利用动物乳腺生物反应器生产该疫苗时，需用显微注射技术将目的基因导入动物的受精卵中，再利用胚胎工程将受精卵培育成转基因动物，若该转基因动物的乳腺细胞没有分泌出目标蛋白质，其原因可能是目的基因未导入受体细胞、目的基因不能在转基因生物的乳腺细胞内表达。
答案：(1)抗原 (2)脱氧核苷酸 PCR (3)基因表达载体 标记基因 (4)转化 显微注射 目的基因未导入受体细胞、目的基因不能在转基因生物的乳腺细胞内表达
14．长期高血糖可引发血管细胞衰老。科研人员为研究S蛋白在因高血糖引发的血管细胞衰老中的作用，以腺病毒为载体将编码S蛋白的S基因导入血管细胞，实现S蛋白在血管细胞中的大量表达。
(1)腺病毒的遗传物质为DNA，其复制需要E1、E2、E3基因共同完成。为将S基因导入腺病毒，科研人员首先构建了含S基因的重组质粒，如图1所示。在构建含S基因的重组质粒时，通过________________________的方法可鉴定重组质粒是否插入了S基因。将图1中含S基因的重组质粒用__________酶切割后，获得改造后的腺病毒DNA；将其导入A细胞(A细胞含有E3基因，可表达E3蛋白)，如图2所示。腺病毒DNA在A细胞内能够____________________________________________，从而产生大量重组腺病毒，腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上。
(2)综合上述信息，从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(写出2点)。
(3)用含S基因的重组腺病毒分别感染正常人及糖尿病患者的血管细胞，使S蛋白在血管细胞中大量表达。对正常人、糖尿病患者及二者转入S基因后血管细胞中能促进细胞衰老的I蛋白进行检测，结果如图3所示(颜色越深代表表达量越高)。可用________________方法检测I蛋白的表达量，实验结果显示______________血管细胞中I蛋白表达量最高，推测S蛋白对高血糖引发的血管细胞衰老的作用及机制是________________________________________________________________________。
解析：(1)在构建含S基因的重组质粒时，通过设计S基因特异的引物进行PCR的方法可鉴定重组质粒是否插入了S基因。根据图1中限制酶的切割位点可知，图1中含S基因的重组质粒用PacⅠ酶切割后，获得改造后的腺病毒DNA；腺病毒DNA在A细胞内能够复制并指导腺病毒外壳蛋白的合成从而产生大量重组腺病毒，腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上。(2)综合上述信息，从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点是重组腺病毒只能在A细胞中复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不含致病基因。(3)检测I蛋白的表达量可用抗原—抗体杂交的方法，图3中显示糖尿病患者血管细胞中I蛋白表达量最高，推测S蛋白对高血糖引发的血管细胞衰老的作用及机制是S蛋白通过降低I蛋白的含量，抑制高血糖引发的血管细胞衰老。
答案：(1)设计S基因特异的引物进行PCR PacⅠ 复制并指导腺病毒外壳蛋白的合成 (2)重组腺病毒只能在A细胞中复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不含致病基因 (3)抗原—抗体杂交 糖尿病患者(或“2组”) S蛋白通过降低I蛋白的含量，抑制高血糖引发的血管细胞衰老
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