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高考生物一轮复习选择性必修3第3、4章基因工程、生物技术的安全性和伦理问题课件
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这是一份高考生物一轮复习选择性必修3第3、4章基因工程、生物技术的安全性和伦理问题课件，共60页。PPT课件主要包含了人们的愿望，转基因，遗传性状，编码蛋白质，结构和功能清晰，预期表达产物，②条件，解旋酶，DNA复制，目的基因等内容，欢迎下载使用。
考点一 DNA 重组技术的基本工具1.基因工程的概念。(1)手段：按照_______________，通过___________等技术，
赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：______水平。
(4)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的___________。
2.基因工程的基本工具(3种工具，其中有2种工具酶)。(1)限制性内切核酸酶(限制酶是一类酶，而不是一种酶)。
(1)限制酶的识别序列与被作用的 DNA 序列是不同的。前者一般由 6 个核苷酸组成，少数由 4 个、8 个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。(2)限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是氢键。(3)在切割含目的基因的 DNA 分子时，需用限制酶切割两次此DNA 分子，产生 4 个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都
有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA 连接酶。
环状双链 DNA 分子
限制酶的选择方法根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲
不能选择 Sma Ⅰ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用 Pst Ⅰ和 EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组 DNA 的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用 Sma Ⅰ切割。
检测目的基因是否导入受体细胞
标记基因可用于_________________________________。
考点二 基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取。
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得_______________等的基因，主要是指____________
②筛选目的基因的方法：从相关的已知___________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用 PCR 获取和扩增____________。①原理：__________________。
使 DNA 聚合酶能够从引物的 3′端开始连接脱氧核苷酸
催化合成 DNA 子链
③过程：PCR 过程包括______________________三步。
④PCR 产物的鉴定：常采用________________来鉴定。 (3)在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建_________来获取目的基因。
PCR 技术和 DNA 复制的比较
2.基因表达载体的构建——核心。(1)目的：使目的基因在__________中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
RNA聚合酶识别和结合
启动子≠起始密码子 终止子≠终止密码子(1)启动子是位于基因上游的一段特殊序列，它是 RNA 聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因下游的一段特殊序列，作
(2)起始密码子和终止密码子均位于 mRNA 上，分别控制翻译
目的基因与目的基因连接、目的基因与质粒连接、质粒与质粒连接
3.将目的基因导入受体细胞(只有该步骤没涉及碱基互补配对现象)。
(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的 T-DNA 拼接到受体细胞的染色体 DNA 上；第一次导入是将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 导入受
(2)导入目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体 DNA 上。存在于染色体 DNA 上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定。
考点三 基因工程的应用及蛋白质工程1.基因工程的应用。(1)食品工业方面。
生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如，利用转基因
(2)医药卫生领域。①器官移植：用转基因动物作器官移植的________，例如抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应
②乳腺生物反应器：让外源基因在哺乳动物的______中特异
性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
乳腺生物反应器与工程菌的比较
2.蛋白质工程(第二代基因工程，生产自然界中不存在的蛋白
(1)概念：以蛋白质分子的__________及其与生物功能的关系作为基础，通过_____________基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。(2)操作手段和结果。
蛋白质工程与基因工程的区别和联系
(4)蛋白质工程的应用。
①在医药方面：利用蛋白质工程研发______。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成________，在一定条件下，可以延长
②在工业方面：蛋白质工程被广泛用于改进______________或开发新的工业用酶。③在农业方面：科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物__________的效率，增加粮食的产量。
考点四 生物技术的安全性与伦理问题1.转基因产品的安全性。
(2)对转基因产品安全性的争论。
(3)理性看待转基因技术。
①理性看待转基因技术的前提：清晰地了解转基因技术的________和________规程；看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和________等因素的影响；要靠________的证据和________
的逻辑进行思考和辩论。
②我国对转基因技术的态度：研究上要________，坚持自主创新；推广上要________，做到确保安全；管理上要________，
③我国相关部门制定了一系列的政策、法规并成立相关机构：维护了消费者对转基因产品的__________和________；保证了转基因技术和已经上市的转基因产品的________；为保障农业转基因生物安全提供重要的技术支撑。
2.关注生殖性克隆人。
(1)生殖性克隆人面临的伦理问题。①生殖性克隆和治疗性克隆的比较。
②关于生殖性克隆人的争论。
不赞成、不允许、不支持、
对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。
③我国政府一再重申四不原则：_____________________________________________________。④我国政府重视________________所涉及的伦理问题，主张
不接受任何生殖性克隆人实验
治疗性克隆和生殖性克隆的比较
(2)试管婴儿和设计试管婴儿的比较。
致病能力强，攻击范围广
①致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等。②病毒类：天花病毒、某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等。③__________类：肉毒杆菌毒素等。(2)特点：______________________________。
(3)散布途径：可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。
(4)《禁止生物武器公约》。
①1972 年 4 月，苏联、美国、英国分别在其首都签署了《禁
止生物武器公约》，并于 1975 年 3 月生效。②1984 年 11 月，我国也加入了这一公约。
生物武器及其技术和设备
④2010 年，在第 65 届联合国大会上，我国政府主张全面禁止和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。
③1998 年 6 月，中美两国元首重申了在任何情况下_________________________________，并反对________________________
不生产、不储存生物武器
【基础测评】1.易错诊断(1)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳
(2)外源 DNA 在位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进
(3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常
(4)生物武器用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成
(5)蛋白质工程的目标是对基因的结构进行分子设计。(
答案：(1)√ (2)× (3)√ (4)× (5)×
2.运用基因工程构建的生物反应器可实现药用蛋白的批量生产，目前常用的生物反应器有乳腺生物反应器和膀胱生物反应器，其构建过程如下：构建药用蛋白基因的表达载体，并将表达载体导入动物的受精卵中，然后从这个受精卵发育而成的个体的乳汁
或者尿液中提取药用蛋白。下列相关说法错误的是(
A.构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基
因的启动子等重组在一起
B.在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的细胞中不
C.与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别和年龄
D.将表达载体导入哺乳动物的受精卵时，常采用显微注射技术答案：B
3.干扰素是动物体内的一种蛋白质，可用于治疗病毒的感染和癌症，但干扰素在体外保存很困难，若将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，则在－70 ℃的条件下可保存半年。下列叙述正确
A.题干所述对干扰素进行改造的过程属于蛋白质工程的范畴B.改造后的干扰素保存时间延长与该干扰素中氨基酸的种类和数量发生改变有关C.通过该过程制造的蛋白质都是自然界中已经存在的蛋白质D.该过程能够实现对蛋白质的结构进行设计和改造，不需要依赖基因答案：A
4.关于我国的生物技术研究与应用的叙述，错误的是(A.禁止运用转基因技术改造农作物B.反对生物武器及其技术和设备的扩散C.不赞成、不接受、不进行任何生殖性克隆人实验D.成立相关伦理专家委员会应对重大医学伦理问题答案：A
考向 1 基因工程所需工具
[典例 1](2023 年全国课标卷)某同学拟用限制酶(酶 1、酶 2、酶 3 和酶 4)、DNA 连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(
A.质粒和目的基因都用酶 3 切割，用 E.cli DNA 连接酶连接B.质粒用酶 3 切割、目的基因用酶 1 切割，用 T4 DNA 连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶 1 和酶 2 切割，用 T4 DNA 连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶 2 和酶 4 切割，用 E.cli DNA 连接酶连接
解析：限制酶3切割后的末端是平末端，E.cli DNA连接酶连接的是黏性末端，应用 T4 DNA 连接酶连接，A 错误。据图可知，限制酶 3 切割后的末端是平末端，而限制酶 1 切割后的末端是黏性末端，若用两种酶分别切割质粒和目的基因，会导致DNA连接酶无法连接，B 错误。质粒和目的基因都用酶 1 和酶 2 切割，可避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，且两者均形成黏性末端，此后再用T4 DNA连接酶连接，可构建重组表达载体，效率较高，C 正确。限制酶 4 会破坏质粒上的标记基因(抗生素抗性基因)，故不能选择该酶进行切割，D 错误。
1.(2022 年广东四校联考)人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。下图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的部分过程。图中 TetR 表示四环素抗性基因，AmpR 表示氨苄青霉素抗性基因，四种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题。
(1)一般从 cDNA 文库中获取人乳铁蛋白基因，该文库的建立方法是__________________________________________________
________________________________________________________
_______________________________________________________。
(2)为构建重组载体，应选择____________酶对目的基因和质粒进行切割。将上述酶切后得到 DNA 末端连接起来，连接部位的6 个碱基对序列为____________________。
(3)以大肠杆菌为受体细胞，将酶切后的连接产物导入受体细胞。为筛选出导入目的基因的受体菌，首先需要将得到的上述大肠杆菌接种到含________培养基(A)上，一段时间后，将 A 上生长的菌落拓印到含______培养基(B)上，在 B 上能生长的_______(填“是”或“不是”)成功导入重组质的受体菌。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能表达，其最可能的原因是_____________________________________________________。
解析：(1)cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。一般从 cDNA 文库中获取人乳铁蛋白基因，该文库的建立方法是人体发育某个时期的 mRNA 经反转录产生 DNA 片段，与载体连接后导入受体菌群体储存。(2)根据表中 4 种酶的识别序列及切割位点可知，BamHⅠ酶和 BclⅠ酶识别的序列相同，可以切出相同的黏性末端，因此可选择这 2 种酶对目的基因和质粒进行切割。将上述酶切后得到 DNA 末端连接起来，连接部位的 6 个
。(3)用 BamHⅠ酶切割后
会破坏四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生存下来，一段时间后，将 A 上生长的菌落拓印到含四环素培养基(B)上，在 B 上能生长的不是成功导入重组质的受体菌。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能表达，其最可能的原因是用 BamHⅠ酶和 BclⅠ酶切形成的黏性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接。
答案：(1)人体发育某个时期的 mRNA 经反转录产生 DNA 片
段，与载体连接后导入受体菌群体储存
(2)BamHⅠ和 BclⅠ
(3)氨苄青霉素 四环素 不是 用BamHⅠ酶和BclⅠ酶切割
形成的黏性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
考向 2 PCR 技术的应用
[典例 2](2021 年山东高考)人类γ基因启动子上游调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是________，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_____________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于____________________，理由是_____________________________________________________________。
解析：(1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子 P 的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的 R 端与荧光蛋白基因中限制酶 Mun Ⅰ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和 Xh Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不
能被限制酶Mun Ⅰ和Xh Ⅰ所识别，故应该选用添加限制酶EcRⅠ和限制酶 Sal Ⅰ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ识别并切割后的黏性末端与限制酶 EcR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 EcRⅠ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是 Sal Ⅰ；荧光蛋白基因中含有限制酶 EcR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ和 Xh Ⅰ切割。综上所述，对载体使用限制酶 Mun Ⅰ和Xh Ⅰ切割，对扩增后的产物用限制酶 EcR Ⅰ和限制酶Sal Ⅰ识
别序列，然后在 DNA 连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用 Taq 酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 6 种酶，分别是 Taq 酶、限制酶 EcR Ⅰ、限制酶 Sal Ⅰ、限制酶 Mun Ⅰ、限制酶 Xh Ⅰ、DNA 连接酶。(2)受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要 RNA 聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含F1～F6与 R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体
细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的 BCL11A 基因表达，产生 BCL11A 蛋白，BCL11A 蛋白与 BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F4 与引物 R 之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F5 的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1)Sal Ⅰ EcR Ⅰ 6(2)F7 与 R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
(3)引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6 与 R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
获取目的基因方法的选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以
通过 DNA 合成仪利用化学方法直接人工合成。
(3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基
因又比较大，可以通过 PCR 技术扩增目的基因。
2.(2023 年河北高考)单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶(ME)基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。回答下列问题。
(1)根据 DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的________差
异获得硅藻粗提 DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、_______和________等。本研究中目的基因为_____________。(3)PCR 扩增时引物通过______________原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图 1 所示的两条引物，对非转基因硅藻品系 A 和转 ME 基因硅藻候选品系 B 进行 PCR 检测，扩增产物电泳结果见图 2。其中，样品 1 为本实验的________组，样品 2有特异性扩增产物，结果表明_____________________________。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图 3 为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系 A，品系 B 的胞内脂质含量平均水平明显________。同时，还需测定____________以比较在相同发酵条件下品系 A 与B 的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量 ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生 NADH。研究表明，品系 B 线粒体中 ME 含量显著高于品系 A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中 NADH 水平升高，_______________，最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为____________________________________。(答出两点即可)
解析：(1)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离 DNA 和蛋白质。因此，根据 DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的粗提 DNA 可以作为 PCR 扩增目的基因的模板。(2)基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有特殊序列结构的 DNA片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果酸酶(ME)基因。(3)PCR 是一项根据 DNA 半保
留复制原理，在体外提供参与 DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与 DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组 DNA 作为 PCR 模板，而在实验组中以转 ME 基因的硅藻细胞基因组 DNA 作为模板。如此比较两个实验扩增结果可以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测 ME 基因序列是否整合到硅藻细胞基因组中。(4)硅藻细胞内的
脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图 3 分析可知，相对于非转基因硅藻细胞品系 A，转基因硅藻细胞品系 B 的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系 A与 B 的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高产生物柴油的优良硅藻细胞品系。(5)细胞内脂质的合成需要大量 ATP。苹果酸酶(ME)可催化苹果酸生成 NADH。研究表明，品系 B 线粒体中 ME 含量显著高于品系 A。据此分析可知，ME 基因的超表达导致线粒体中的
NADH 水平升高，NADH 进一步通过有氧呼吸产生大量 ATP，最终促进细胞内脂质的合成。(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为，能够通过发酵大量生产、不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。
答案：(1)溶解度(2)启动子 终止子(不分顺序) 苹果酸酶基因(或“ME 基因”)
引物间的载体序列整合到硅藻细胞
基因组中(或“ME 基因序列整合到硅藻细胞基因组中”)(4)增加 细胞数量(5)有氧呼吸生成的 ATP 增多(6)节约土地资源、不受季节和气候限制(或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”)
考向 3 基因工程的基本操作程序
[典例 3](2021 年广东高考)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了 4 步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
(1)研究人员采用 PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有____________________。(答出两种即可)
(2)高质量的 DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量 DNA 模板时必须除去蛋白，方法有_________________________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌 BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行 4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备__________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有__________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将 4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是________________。在分子水平上，可以通过改变__________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了 PCR 技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的 DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量 DNA 模板时必须除去蛋白，可根据 DNA 和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌 BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行 4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态
细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的 DNA 分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原－抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
答案：(1)基因文库中获取、人工合成法(2)盐析法、酶解法或高温变性(3)感受态 抗原—抗体杂交技术
(4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
3.(2022 年广东高考)“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含 CO2 等温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用 PCR 技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。(2)研究者构建了一种表达载体 pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是___________________________________________________________________________________________________________，终止子的作用是________________________________________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于__________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析：(1)利用 PCR 技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的 3′端延伸子链。(2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生
长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
(2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞
转录，使转录在需要的地方停下来(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长
不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工
(4)废物的资源化业废气中的二氧化碳
考向 4 基因工程的应用
[典例 4](2022年广东深圳一模)人体中血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等，同时参与维持血浆正常的渗透压，在临床上应用广泛。但从人体中直接提取的血清白蛋白含量少，且易受污染，生物反应器可以解决此项难题。回答下列问题。
(1)从人体获取的血清白蛋白基因可通过________技术进行扩增，扩增后的血清白蛋白基因与启动子、________和________等构建成基因表达载体。构建乳腺生物反应器时选用的是乳腺蛋白基因的启动子，其目的是___________________________________
(2)科学家将构建好的基因表达载体通过________技术导入奶牛的受精卵中。受精卵继续培养至胚胎。当胚胎发育至______阶段，取其________做 DNA 分析来进行性别鉴定，筛选出发育状态良好的______(填“雌”或“雄”)性胚胎进行移植，使其生长发育成转基因动物，将来可从牛奶中提取得到大量的人血清白蛋白。(3)有人提议将乳腺蛋白基因的启动子换成 urplakinⅡ基因的启动子(高效促进目的蛋白在膀胱特异性表达及分泌)，可增加血清白蛋白的产量。请分析产量高的原因________________________________________________________________________________。
解析：(1)利用 PCR 技术可扩增血清白蛋白基因。扩增后的血清白蛋白基因与启动子、终止子、标记基因等构建成基因表达载体。而且目的基因必须插入到启动子和终止子之间。由于基因的选择性表达，要想基因特异性地只在乳腺细胞中表达，选用的是乳腺蛋白基因的启动子，其目的是使目的基因在动物体内的乳腺细胞中表达，从而在乳汁中获取所需产品。(2)将重组质粒导入动物细胞通常使用显微注射技术，所以基因表达载体通过显微注射技术导入奶牛的受精卵中进行体外培养。受精卵继续培养至胚胎。
当胚胎发育至囊胚阶段，取滋养层细胞做 DNA 分析来进行性别鉴定，目的产物要从乳汁中获取，所以筛选出发育状态良好的雌性胚胎进行移植，使其生长发育成转基因动物。(3)雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大，因此将乳腺蛋白基因的启动子换成 urplakinⅡ基因的启动子，可增加血清白蛋白的产量。
的乳腺细胞中表达，从而在乳汁中获取所需产品(2)显微注射 囊胚 滋养层细胞 雌(3)雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大
4.(2023 年广东高考)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型 DAI 基因发生一个碱基 G到 A 的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题。
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型 DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与__________植株的种子大小相近。
(2)用 PCR 反应扩增 DAI 基因，用限制性核酸内切酶对 PCR产物和__________进行切割，用 DNA 连接酶将两者连接。为确保插入的 DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备________________________。
(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图 1)。用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化 T0 代植株并自交，将 T1 代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了____________________________。
②T1 代阳性植株自交所得的 T2 代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约____%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的 T2 代阳性植株__________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的 T3 代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用 PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见图 2，在图 2 电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
解析：(1)突变体是野生型 DAI 基因发生隐性突变产生的，因此采用农杆菌转化法将野生型 DAI 基因(显性基因)转入突变体植株，若突变体表型确由该基因突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近，即表现显性性状。(2)构建基因表达载体时，通过 PCR 扩增的 DAI 基因和载体需要用限制酶进行切割，然后用 DNA 连接酶将两者连接起来。其中在 DAI 基因的上游序列添加启动子，在 DAI 基因的下游序列添加终止子，以利于 DAI 基因正常表达。(3)①由图 1 可知，T0 代植株用农杆菌转化
法(T-DNA 携带 DAI 基因和卡那霉素抗性基因)进行了处理，若自交产生的 T1 代种子播种在含有卡那霉素的选择培养基上出现能够正常生长的个体，说明其基因组中插入了 DAI 基因和卡那霉素抗性基因。②T1 代阳性植株细胞中染色体上含有 DAI 基因，由于题干“选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株”，因此 T1 代阳性植株自交所得的 T2 代种子按单株收种并
播种于选择培养基，阳性∶阴性＝3∶1，故选择阳性率约 75%
的培养基中幼苗继续培养。③将②中选出的 T2 代阳性植株自交所得的 T3 代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择单株种植在选择性培养基上阳性率达到 100%的幼苗作为目标转基因植株，因为这时所有的幼苗都含有 DAI 基因。分析图 2 可知，突变型基因是由野生基因中某一位置的碱基 G 替换为碱基 A 造成的，因此其基因长度都是 150 bp，由于野生型基因中没有限制酶 X 的切割位点，而突变型基因中含有限制酶 X 的切割位点，会将突变型基因切割成 50 bp 和 100 bp 两个片段，即电泳图中野生型基因只有 150 bp一个条带，而突变型基因有 50 bp 和 100 bp 两个条带。
(2)载体 启动子和终止子
(3)①DAI 基因和卡那霉素抗性基因 ②75 ③自交 100
考向 5 蛋白质工程
[典例 5](2022 年湖南高考)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题。
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质 a 是____________，物质b 是_______。在生产过程中，物质 b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是___________________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有______________、______________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是_______________________
________________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是___________________________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
解析：(1)据分析可知，物质 a 是多肽链中的氨基酸序列，物质 b 是 mRNA。在生产过程中，物质 b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA 双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解
时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程
改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取 3 支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入 1、2、3 号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
答案：(1)多肽链中的氨基酸序列 mRNA 密码子的简并性
通过 DNA 合成仪用化学方
(2)从基因文库中获取目的基因法直接人工合成 DNA 双链复制
提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不
同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏(4)取 3 支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
5.(2022 年海南海口模拟)利用木聚糖酶进行纸浆漂白，可以大幅度减少氯化物的用量，减轻造纸工业对环境的污染。纸浆漂白需要在高温碱性条件下进行，因此需要耐热耐碱的木聚糖酶。根据生产需要，科学家对已知氨基酸序列的木聚糖酶进行改造，获得了耐高温耐碱的新木聚糖酶，减少了纸浆漂白时木聚糖酶的用量，提高了生产效率。回答下列问题。
(1)蛋白质工程的目标是根据人们对______________的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。与蛋白质工程相比，基因工程原则上只能生产________，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要。
(2)在蛋白质工程和基因工程中常用大肠杆菌作为受体细胞，原因是大肠杆菌__________________________________________
(答出两点)。分离纯化大肠杆菌时，可使用接种环采用________法将聚集的菌种逐步分离并培养成单菌落；实验室中利用选择培养基筛选微生物的原理是_________________________________________________________________________________________。
(3)人工合成的新木聚糖酶的基因在导入受体细胞前要先构建________，以使目的基因能够表达和发挥作用。若要将重组大肠杆菌分泌的耐热耐碱木聚糖酶应用于造纸工业生产，除了需要研究木聚糖酶的产量外，还需要检测木聚糖酶的________。
(4)有研究表明，在木聚糖酶中特定部位引入精氨酸可以增加木聚糖酶中的离子键数目，从而增加该酶在碱性环境中的稳定性。利用蛋白质工程技术改造木聚糖酶，其基本思路是_____________
_______________________________________________________。根据新木聚糖酶的氨基酸序列设计新木聚糖酶的基因，会设计出多种脱氧核苷酸序列，原因是_____________________________________________________________________________________。
解析：(1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。与蛋白质工程相比，基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。(2)由于大肠杆菌为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少，所以在蛋白质工程和基因工程中常用大肠杆菌作为受体细胞。采用平板划线法分离纯化大肠杆菌时，使用的接种工具为接种环。实验室
中利用选择培养基筛选微生物的原理是：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。(3)人工合成的新木聚糖酶的基因在导入受体细胞前，需要先将其与载体结合，构建基因表达载体，以使目的基因能够表达和发挥作用。在将重组大肠杆菌分泌的耐热耐碱的木聚糖酶应用于造纸工业生产前，需要研究该木聚糖酶的产量并对木聚糖酶的生物活性(或催化效率)进行检测。(4)利用蛋白质工程技术改造木聚糖酶，其基本思路是：根据需要对耐碱的木聚糖酶的功能特点，设计新木聚糖酶中特定
部位引入精氨酸以后的氨基酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用 DNA 合成仪合成新木聚糖酶基因。由于密码子具有简并现象(或存在多种密码子决定同一种氨基酸的现象)，导致根据新木聚糖酶的氨基酸序列设计的新木聚糖酶的基因会有多种脱氧核苷酸序列。
答案：(1)蛋白质功能 自然界中已存在的蛋白质(2)为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少 平板划线
人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长
(3)基因表达载体 生物活性(或催化效率)
(4)根据需要对耐碱的木聚糖酶的功能特点，设计新木聚糖酶中特定部位引入精氨酸以后的氨基酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用 DNA 合成仪合成新木聚糖酶基因 密码子具有简并现象(或存在多种密码子决定同一种氨基酸的现象)
考向 6 生物技术的安全性和伦理问题
[典例 6](2022 年北京高考)生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质(E 物质)污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在 E 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白(GFP)等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E 物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是________。(2)为监测 E 物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中 ERE 和酵母来源的 UAS 是两种诱导型启动子，分别被 E 物质－受体复合物和酵母来源的 Gal4 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案 1 相比，方案 2 的主要优势是_____________________________________________________________，因而被用于制备监测鱼(MO)。
(3)现拟制备一种不育的监测鱼 SM，用于实际监测。SM 需经MO 和另一亲本(X)杂交获得。欲获得 X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：________。
①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子(P 生)
④使基因仅在肌细胞表达的启动子(P 肌)
Ⅱ.基因：________
C.雌激素受体基因(ER)
D.仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)
(4)SM 不育的原因是：成体 SM 自身产生雌激素，与受体结合
后____________造成不育。
(5)使拟用于实际监测的 SM 不育的目的是________________
_________________________________________。
解析：(1)将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。(2)由图可知，方案 1 中的 E 物质—受体复合物激活 ERE，使 GFP基因表达，方案 2 中的 E 物质—受体复合物先激活 ERE 获得 Gal4蛋白，然后 Gal4 蛋白激活 UAS 启动子，使 GFP 基因表达，方案2 中的 GFP 蛋白表达量大，更灵敏。(3)MO 和另一亲本(X)杂交获得 SM，MO 是方案 2 获得的，所以亲本 X 启动子选择 UAS。要
获得 SM 是不育个体，MO 是可育的，所以 X 必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)。(4)成体 SM 自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活 ERE 诱导 Gal4 表达，Gal4 与 UAS 启动子结合诱导 dg 表达，使生殖细胞凋亡。(5)监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要 SM 不育。
答案：(1)显微注射(2)监测灵敏度更高(3) ② D
(4)激活 ERE 诱导 Gal4 表达，Gal4 结合 UAS 诱导 dg 表达，
(5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
【考向集训】6.(2023 年北京高考)抗虫作物对害虫的生存产生压力，会使害虫种群抗性基因频率迅速提高，导致作物的抗虫效果逐渐减弱。为使转基因抗虫棉保持抗虫效果，农业生产上会采取一系列措施。
以下措施不能实现上述目标的是(
A.在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子B.大面积种植转基因抗虫棉，并施用杀虫剂C.转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植D.转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带
解析：在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子，则常规种子长成的普通植株能为敏感性(不抗虫)个体提供生存空间，增加与抗虫个体的竞争，避免抗性基因频率升高过快，提高了抗虫棉的抗虫持久性，A 正确。大面积种植转基因抗虫棉、施用杀虫剂，都会进一步选择并保存抗性强的个体，导致敏感性个体死亡，从而加快害虫种群抗性基因频率提高，不利于抗虫棉的抗虫持久性，B 错误。将转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植以及转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带，作用机理相似，可以使敏感型个体存活，敏感性个体能与抗性强的棉铃虫进行竞争，不会导致抗性基因频率升高过快，提高了抗虫棉的抗虫持久性，C、D 正确。
DNA 的粗提取与鉴定、DNA 片段的扩增及电泳鉴定1.DNA 的粗提取与鉴定。
2 ml/L NaCl
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧 DNA
分子的断裂，导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无 DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
2.DNA 片段的扩增及电泳鉴定。
①PCR 原理：_______________原理。
a.概念：是指带电分子在______的作用下发生迁移的过程。b.原理：在一定的 pH 下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上______________，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷______的电极移动。
c.作用过程：由于各种分子的带电性质差异、大小不同、形状不同，在电场作用下会产生不同的______速率，从而实现各种分
d.方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。PCR 的产物一般通过___________________来鉴定。
①PCR 实验操作步骤。
②鉴定 PCR 产物→琼脂糖凝胶电泳法→配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝
胶置于________下观察和照相。
[典例 1](2023 年广东高考)“DNA 粗提取与鉴定”实验的基
本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(A.裂解：使细胞破裂释放出 DNA 等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高 DNA 的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
解析：细胞吸水涨破，释放 DNA 等物质，A 正确。DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同，DNA 在2 ml/L 的氯化钠中溶解度最高，依此原理可分离出其他杂质，B正确。DNA 不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，反复多次可提纯 DNA，C 正确。加入二苯胺后，还需沸水浴处理才能出现蓝色，D 错误。
[典例 2](2022 年山东青岛一模)DNA 琼脂糖凝胶电泳的分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的 DNA 片段。下列
A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定 DNA 分子的混合物B.双链 DNA 分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大C.凝胶制备中加入的核酸染料能与 DNA 分子结合，用于分离后 DNA 的检测D.凝胶中的 DNA 分子通过染色，可在波长为 300 nm 的紫外灯下被检测出来
解析：琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离，可用于分离、鉴定 DNA 分子的混合物，A正确。凝胶中 DNA 分子的迁移速率与 DNA 分子的大小有关，双链 DNA 分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B 错误。凝胶制备中加入的核酸染料能与 DNA 分子结合，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来，用于分离后 DNA 的检测，C 正确。DNA 分子的大小和构象等有关，凝胶中的 DNA 分子通过染色，可以在波长为 300 nm 的紫外灯下被检测出来，D 正确。
【举一反三】1.(2022 年山东高考)关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下
A.过滤液沉淀过程在 4 ℃冰箱中进行是为了防止 DNA 降解B.离心研磨液是为了加速 DNA 的沉淀C.在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的 DNA 中可能含有蛋白质
解析：过滤液沉淀过程在 4 ℃冰箱中进行可以使酶的活性降低，可以防止 DNA 降解，A 正确。离心研磨液是为了加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质等的沉淀，B 错误。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C 正确。粗提取的 DNA 中可能含有蛋白质，D 正确。
2.(2023 年江苏苏州期初)下列关于琼脂糖凝胶电泳的叙述，错
A.加热熔化的琼脂糖完全冷却后加入适量的核酸染料B.电泳缓冲液加入电泳槽时，需没过凝胶 1 mm 为宜C.可调容量的微量移液器应先做容量设定再安装枪头D.停止电泳后应将凝胶置于紫外灯下，观察和照相
考点一 DNA 重组技术的基本工具1.基因工程的概念。(1)手段：按照_______________，通过___________等技术，
赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：______水平。
(4)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的___________。
2.基因工程的基本工具(3种工具，其中有2种工具酶)。(1)限制性内切核酸酶(限制酶是一类酶，而不是一种酶)。
(1)限制酶的识别序列与被作用的 DNA 序列是不同的。前者一般由 6 个核苷酸组成，少数由 4 个、8 个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。(2)限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是氢键。(3)在切割含目的基因的 DNA 分子时，需用限制酶切割两次此DNA 分子，产生 4 个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都
有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA 连接酶。
环状双链 DNA 分子
限制酶的选择方法根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲
不能选择 Sma Ⅰ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用 Pst Ⅰ和 EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组 DNA 的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用 Sma Ⅰ切割。
检测目的基因是否导入受体细胞
标记基因可用于_________________________________。
考点二 基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取。
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得_______________等的基因，主要是指____________
②筛选目的基因的方法：从相关的已知___________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用 PCR 获取和扩增____________。①原理：__________________。
使 DNA 聚合酶能够从引物的 3′端开始连接脱氧核苷酸
催化合成 DNA 子链
③过程：PCR 过程包括______________________三步。
④PCR 产物的鉴定：常采用________________来鉴定。 (3)在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建_________来获取目的基因。
PCR 技术和 DNA 复制的比较
2.基因表达载体的构建——核心。(1)目的：使目的基因在__________中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
RNA聚合酶识别和结合
启动子≠起始密码子 终止子≠终止密码子(1)启动子是位于基因上游的一段特殊序列，它是 RNA 聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因下游的一段特殊序列，作
(2)起始密码子和终止密码子均位于 mRNA 上，分别控制翻译
目的基因与目的基因连接、目的基因与质粒连接、质粒与质粒连接
3.将目的基因导入受体细胞(只有该步骤没涉及碱基互补配对现象)。
(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的 T-DNA 拼接到受体细胞的染色体 DNA 上；第一次导入是将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 导入受
(2)导入目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体 DNA 上。存在于染色体 DNA 上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定。
考点三 基因工程的应用及蛋白质工程1.基因工程的应用。(1)食品工业方面。
生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如，利用转基因
(2)医药卫生领域。①器官移植：用转基因动物作器官移植的________，例如抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应
②乳腺生物反应器：让外源基因在哺乳动物的______中特异
性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
乳腺生物反应器与工程菌的比较
2.蛋白质工程(第二代基因工程，生产自然界中不存在的蛋白
(1)概念：以蛋白质分子的__________及其与生物功能的关系作为基础，通过_____________基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。(2)操作手段和结果。
蛋白质工程与基因工程的区别和联系
(4)蛋白质工程的应用。
①在医药方面：利用蛋白质工程研发______。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成________，在一定条件下，可以延长
②在工业方面：蛋白质工程被广泛用于改进______________或开发新的工业用酶。③在农业方面：科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物__________的效率，增加粮食的产量。
考点四 生物技术的安全性与伦理问题1.转基因产品的安全性。
(2)对转基因产品安全性的争论。
(3)理性看待转基因技术。
①理性看待转基因技术的前提：清晰地了解转基因技术的________和________规程；看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和________等因素的影响；要靠________的证据和________
的逻辑进行思考和辩论。
②我国对转基因技术的态度：研究上要________，坚持自主创新；推广上要________，做到确保安全；管理上要________，
③我国相关部门制定了一系列的政策、法规并成立相关机构：维护了消费者对转基因产品的__________和________；保证了转基因技术和已经上市的转基因产品的________；为保障农业转基因生物安全提供重要的技术支撑。
2.关注生殖性克隆人。
(1)生殖性克隆人面临的伦理问题。①生殖性克隆和治疗性克隆的比较。
②关于生殖性克隆人的争论。
不赞成、不允许、不支持、
对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。
③我国政府一再重申四不原则：_____________________________________________________。④我国政府重视________________所涉及的伦理问题，主张
不接受任何生殖性克隆人实验
治疗性克隆和生殖性克隆的比较
(2)试管婴儿和设计试管婴儿的比较。
致病能力强，攻击范围广
①致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等。②病毒类：天花病毒、某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等。③__________类：肉毒杆菌毒素等。(2)特点：______________________________。
(3)散布途径：可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。
(4)《禁止生物武器公约》。
①1972 年 4 月，苏联、美国、英国分别在其首都签署了《禁
止生物武器公约》，并于 1975 年 3 月生效。②1984 年 11 月，我国也加入了这一公约。
生物武器及其技术和设备
④2010 年，在第 65 届联合国大会上，我国政府主张全面禁止和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。
③1998 年 6 月，中美两国元首重申了在任何情况下_________________________________，并反对________________________
不生产、不储存生物武器
【基础测评】1.易错诊断(1)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳
(2)外源 DNA 在位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进
(3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常
(4)生物武器用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成
(5)蛋白质工程的目标是对基因的结构进行分子设计。(
答案：(1)√ (2)× (3)√ (4)× (5)×
2.运用基因工程构建的生物反应器可实现药用蛋白的批量生产，目前常用的生物反应器有乳腺生物反应器和膀胱生物反应器，其构建过程如下：构建药用蛋白基因的表达载体，并将表达载体导入动物的受精卵中，然后从这个受精卵发育而成的个体的乳汁
或者尿液中提取药用蛋白。下列相关说法错误的是(
A.构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基
因的启动子等重组在一起
B.在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的细胞中不
C.与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别和年龄
D.将表达载体导入哺乳动物的受精卵时，常采用显微注射技术答案：B
3.干扰素是动物体内的一种蛋白质，可用于治疗病毒的感染和癌症，但干扰素在体外保存很困难，若将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，则在－70 ℃的条件下可保存半年。下列叙述正确
A.题干所述对干扰素进行改造的过程属于蛋白质工程的范畴B.改造后的干扰素保存时间延长与该干扰素中氨基酸的种类和数量发生改变有关C.通过该过程制造的蛋白质都是自然界中已经存在的蛋白质D.该过程能够实现对蛋白质的结构进行设计和改造，不需要依赖基因答案：A
4.关于我国的生物技术研究与应用的叙述，错误的是(A.禁止运用转基因技术改造农作物B.反对生物武器及其技术和设备的扩散C.不赞成、不接受、不进行任何生殖性克隆人实验D.成立相关伦理专家委员会应对重大医学伦理问题答案：A
考向 1 基因工程所需工具
[典例 1](2023 年全国课标卷)某同学拟用限制酶(酶 1、酶 2、酶 3 和酶 4)、DNA 连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(
A.质粒和目的基因都用酶 3 切割，用 E.cli DNA 连接酶连接B.质粒用酶 3 切割、目的基因用酶 1 切割，用 T4 DNA 连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶 1 和酶 2 切割，用 T4 DNA 连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶 2 和酶 4 切割，用 E.cli DNA 连接酶连接
解析：限制酶3切割后的末端是平末端，E.cli DNA连接酶连接的是黏性末端，应用 T4 DNA 连接酶连接，A 错误。据图可知，限制酶 3 切割后的末端是平末端，而限制酶 1 切割后的末端是黏性末端，若用两种酶分别切割质粒和目的基因，会导致DNA连接酶无法连接，B 错误。质粒和目的基因都用酶 1 和酶 2 切割，可避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，且两者均形成黏性末端，此后再用T4 DNA连接酶连接，可构建重组表达载体，效率较高，C 正确。限制酶 4 会破坏质粒上的标记基因(抗生素抗性基因)，故不能选择该酶进行切割，D 错误。
1.(2022 年广东四校联考)人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。下图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的部分过程。图中 TetR 表示四环素抗性基因，AmpR 表示氨苄青霉素抗性基因，四种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题。
(1)一般从 cDNA 文库中获取人乳铁蛋白基因，该文库的建立方法是__________________________________________________
________________________________________________________
_______________________________________________________。
(2)为构建重组载体，应选择____________酶对目的基因和质粒进行切割。将上述酶切后得到 DNA 末端连接起来，连接部位的6 个碱基对序列为____________________。
(3)以大肠杆菌为受体细胞，将酶切后的连接产物导入受体细胞。为筛选出导入目的基因的受体菌，首先需要将得到的上述大肠杆菌接种到含________培养基(A)上，一段时间后，将 A 上生长的菌落拓印到含______培养基(B)上，在 B 上能生长的_______(填“是”或“不是”)成功导入重组质的受体菌。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能表达，其最可能的原因是_____________________________________________________。
解析：(1)cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。一般从 cDNA 文库中获取人乳铁蛋白基因，该文库的建立方法是人体发育某个时期的 mRNA 经反转录产生 DNA 片段，与载体连接后导入受体菌群体储存。(2)根据表中 4 种酶的识别序列及切割位点可知，BamHⅠ酶和 BclⅠ酶识别的序列相同，可以切出相同的黏性末端，因此可选择这 2 种酶对目的基因和质粒进行切割。将上述酶切后得到 DNA 末端连接起来，连接部位的 6 个
。(3)用 BamHⅠ酶切割后
会破坏四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生存下来，一段时间后，将 A 上生长的菌落拓印到含四环素培养基(B)上，在 B 上能生长的不是成功导入重组质的受体菌。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能表达，其最可能的原因是用 BamHⅠ酶和 BclⅠ酶切形成的黏性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接。
答案：(1)人体发育某个时期的 mRNA 经反转录产生 DNA 片
段，与载体连接后导入受体菌群体储存
(2)BamHⅠ和 BclⅠ
(3)氨苄青霉素 四环素 不是 用BamHⅠ酶和BclⅠ酶切割
形成的黏性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
考向 2 PCR 技术的应用
[典例 2](2021 年山东高考)人类γ基因启动子上游调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是________，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_____________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于____________________，理由是_____________________________________________________________。
解析：(1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子 P 的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的 R 端与荧光蛋白基因中限制酶 Mun Ⅰ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和 Xh Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不
能被限制酶Mun Ⅰ和Xh Ⅰ所识别，故应该选用添加限制酶EcRⅠ和限制酶 Sal Ⅰ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ识别并切割后的黏性末端与限制酶 EcR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 EcRⅠ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是 Sal Ⅰ；荧光蛋白基因中含有限制酶 EcR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ和 Xh Ⅰ切割。综上所述，对载体使用限制酶 Mun Ⅰ和Xh Ⅰ切割，对扩增后的产物用限制酶 EcR Ⅰ和限制酶Sal Ⅰ识
别序列，然后在 DNA 连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用 Taq 酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 6 种酶，分别是 Taq 酶、限制酶 EcR Ⅰ、限制酶 Sal Ⅰ、限制酶 Mun Ⅰ、限制酶 Xh Ⅰ、DNA 连接酶。(2)受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要 RNA 聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含F1～F6与 R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体
细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的 BCL11A 基因表达，产生 BCL11A 蛋白，BCL11A 蛋白与 BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F4 与引物 R 之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F5 的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1)Sal Ⅰ EcR Ⅰ 6(2)F7 与 R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
(3)引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6 与 R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
获取目的基因方法的选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以
通过 DNA 合成仪利用化学方法直接人工合成。
(3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基
因又比较大，可以通过 PCR 技术扩增目的基因。
2.(2023 年河北高考)单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶(ME)基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。回答下列问题。
(1)根据 DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的________差
异获得硅藻粗提 DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、_______和________等。本研究中目的基因为_____________。(3)PCR 扩增时引物通过______________原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图 1 所示的两条引物，对非转基因硅藻品系 A 和转 ME 基因硅藻候选品系 B 进行 PCR 检测，扩增产物电泳结果见图 2。其中，样品 1 为本实验的________组，样品 2有特异性扩增产物，结果表明_____________________________。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图 3 为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系 A，品系 B 的胞内脂质含量平均水平明显________。同时，还需测定____________以比较在相同发酵条件下品系 A 与B 的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量 ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生 NADH。研究表明，品系 B 线粒体中 ME 含量显著高于品系 A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中 NADH 水平升高，_______________，最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为____________________________________。(答出两点即可)
解析：(1)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离 DNA 和蛋白质。因此，根据 DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的粗提 DNA 可以作为 PCR 扩增目的基因的模板。(2)基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有特殊序列结构的 DNA片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果酸酶(ME)基因。(3)PCR 是一项根据 DNA 半保
留复制原理，在体外提供参与 DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与 DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组 DNA 作为 PCR 模板，而在实验组中以转 ME 基因的硅藻细胞基因组 DNA 作为模板。如此比较两个实验扩增结果可以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测 ME 基因序列是否整合到硅藻细胞基因组中。(4)硅藻细胞内的
脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图 3 分析可知，相对于非转基因硅藻细胞品系 A，转基因硅藻细胞品系 B 的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系 A与 B 的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高产生物柴油的优良硅藻细胞品系。(5)细胞内脂质的合成需要大量 ATP。苹果酸酶(ME)可催化苹果酸生成 NADH。研究表明，品系 B 线粒体中 ME 含量显著高于品系 A。据此分析可知，ME 基因的超表达导致线粒体中的
NADH 水平升高，NADH 进一步通过有氧呼吸产生大量 ATP，最终促进细胞内脂质的合成。(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为，能够通过发酵大量生产、不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。
答案：(1)溶解度(2)启动子 终止子(不分顺序) 苹果酸酶基因(或“ME 基因”)
引物间的载体序列整合到硅藻细胞
基因组中(或“ME 基因序列整合到硅藻细胞基因组中”)(4)增加 细胞数量(5)有氧呼吸生成的 ATP 增多(6)节约土地资源、不受季节和气候限制(或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”)
考向 3 基因工程的基本操作程序
[典例 3](2021 年广东高考)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了 4 步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
(1)研究人员采用 PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有____________________。(答出两种即可)
(2)高质量的 DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量 DNA 模板时必须除去蛋白，方法有_________________________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌 BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行 4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备__________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有__________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将 4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是________________。在分子水平上，可以通过改变__________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了 PCR 技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的 DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量 DNA 模板时必须除去蛋白，可根据 DNA 和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌 BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行 4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态
细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的 DNA 分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原－抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
答案：(1)基因文库中获取、人工合成法(2)盐析法、酶解法或高温变性(3)感受态 抗原—抗体杂交技术
(4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
3.(2022 年广东高考)“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含 CO2 等温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用 PCR 技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。(2)研究者构建了一种表达载体 pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是___________________________________________________________________________________________________________，终止子的作用是________________________________________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于__________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析：(1)利用 PCR 技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的 3′端延伸子链。(2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生
长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
(2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞
转录，使转录在需要的地方停下来(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长
不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工
(4)废物的资源化业废气中的二氧化碳
考向 4 基因工程的应用
[典例 4](2022年广东深圳一模)人体中血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等，同时参与维持血浆正常的渗透压，在临床上应用广泛。但从人体中直接提取的血清白蛋白含量少，且易受污染，生物反应器可以解决此项难题。回答下列问题。
(1)从人体获取的血清白蛋白基因可通过________技术进行扩增，扩增后的血清白蛋白基因与启动子、________和________等构建成基因表达载体。构建乳腺生物反应器时选用的是乳腺蛋白基因的启动子，其目的是___________________________________
(2)科学家将构建好的基因表达载体通过________技术导入奶牛的受精卵中。受精卵继续培养至胚胎。当胚胎发育至______阶段，取其________做 DNA 分析来进行性别鉴定，筛选出发育状态良好的______(填“雌”或“雄”)性胚胎进行移植，使其生长发育成转基因动物，将来可从牛奶中提取得到大量的人血清白蛋白。(3)有人提议将乳腺蛋白基因的启动子换成 urplakinⅡ基因的启动子(高效促进目的蛋白在膀胱特异性表达及分泌)，可增加血清白蛋白的产量。请分析产量高的原因________________________________________________________________________________。
解析：(1)利用 PCR 技术可扩增血清白蛋白基因。扩增后的血清白蛋白基因与启动子、终止子、标记基因等构建成基因表达载体。而且目的基因必须插入到启动子和终止子之间。由于基因的选择性表达，要想基因特异性地只在乳腺细胞中表达，选用的是乳腺蛋白基因的启动子，其目的是使目的基因在动物体内的乳腺细胞中表达，从而在乳汁中获取所需产品。(2)将重组质粒导入动物细胞通常使用显微注射技术，所以基因表达载体通过显微注射技术导入奶牛的受精卵中进行体外培养。受精卵继续培养至胚胎。
当胚胎发育至囊胚阶段，取滋养层细胞做 DNA 分析来进行性别鉴定，目的产物要从乳汁中获取，所以筛选出发育状态良好的雌性胚胎进行移植，使其生长发育成转基因动物。(3)雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大，因此将乳腺蛋白基因的启动子换成 urplakinⅡ基因的启动子，可增加血清白蛋白的产量。
的乳腺细胞中表达，从而在乳汁中获取所需产品(2)显微注射 囊胚 滋养层细胞 雌(3)雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大
4.(2023 年广东高考)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型 DAI 基因发生一个碱基 G到 A 的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题。
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型 DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与__________植株的种子大小相近。
(2)用 PCR 反应扩增 DAI 基因，用限制性核酸内切酶对 PCR产物和__________进行切割，用 DNA 连接酶将两者连接。为确保插入的 DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备________________________。
(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图 1)。用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化 T0 代植株并自交，将 T1 代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了____________________________。
②T1 代阳性植株自交所得的 T2 代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约____%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的 T2 代阳性植株__________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的 T3 代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用 PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见图 2，在图 2 电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
解析：(1)突变体是野生型 DAI 基因发生隐性突变产生的，因此采用农杆菌转化法将野生型 DAI 基因(显性基因)转入突变体植株，若突变体表型确由该基因突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近，即表现显性性状。(2)构建基因表达载体时，通过 PCR 扩增的 DAI 基因和载体需要用限制酶进行切割，然后用 DNA 连接酶将两者连接起来。其中在 DAI 基因的上游序列添加启动子，在 DAI 基因的下游序列添加终止子，以利于 DAI 基因正常表达。(3)①由图 1 可知，T0 代植株用农杆菌转化
法(T-DNA 携带 DAI 基因和卡那霉素抗性基因)进行了处理，若自交产生的 T1 代种子播种在含有卡那霉素的选择培养基上出现能够正常生长的个体，说明其基因组中插入了 DAI 基因和卡那霉素抗性基因。②T1 代阳性植株细胞中染色体上含有 DAI 基因，由于题干“选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株”，因此 T1 代阳性植株自交所得的 T2 代种子按单株收种并
播种于选择培养基，阳性∶阴性＝3∶1，故选择阳性率约 75%
的培养基中幼苗继续培养。③将②中选出的 T2 代阳性植株自交所得的 T3 代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择单株种植在选择性培养基上阳性率达到 100%的幼苗作为目标转基因植株，因为这时所有的幼苗都含有 DAI 基因。分析图 2 可知，突变型基因是由野生基因中某一位置的碱基 G 替换为碱基 A 造成的，因此其基因长度都是 150 bp，由于野生型基因中没有限制酶 X 的切割位点，而突变型基因中含有限制酶 X 的切割位点，会将突变型基因切割成 50 bp 和 100 bp 两个片段，即电泳图中野生型基因只有 150 bp一个条带，而突变型基因有 50 bp 和 100 bp 两个条带。
(2)载体 启动子和终止子
(3)①DAI 基因和卡那霉素抗性基因 ②75 ③自交 100
考向 5 蛋白质工程
[典例 5](2022 年湖南高考)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题。
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质 a 是____________，物质b 是_______。在生产过程中，物质 b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是___________________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有______________、______________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是_______________________
________________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是___________________________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
解析：(1)据分析可知，物质 a 是多肽链中的氨基酸序列，物质 b 是 mRNA。在生产过程中，物质 b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA 双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解
时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程
改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取 3 支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入 1、2、3 号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
答案：(1)多肽链中的氨基酸序列 mRNA 密码子的简并性
通过 DNA 合成仪用化学方
(2)从基因文库中获取目的基因法直接人工合成 DNA 双链复制
提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不
同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏(4)取 3 支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
5.(2022 年海南海口模拟)利用木聚糖酶进行纸浆漂白，可以大幅度减少氯化物的用量，减轻造纸工业对环境的污染。纸浆漂白需要在高温碱性条件下进行，因此需要耐热耐碱的木聚糖酶。根据生产需要，科学家对已知氨基酸序列的木聚糖酶进行改造，获得了耐高温耐碱的新木聚糖酶，减少了纸浆漂白时木聚糖酶的用量，提高了生产效率。回答下列问题。
(1)蛋白质工程的目标是根据人们对______________的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。与蛋白质工程相比，基因工程原则上只能生产________，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要。
(2)在蛋白质工程和基因工程中常用大肠杆菌作为受体细胞，原因是大肠杆菌__________________________________________
(答出两点)。分离纯化大肠杆菌时，可使用接种环采用________法将聚集的菌种逐步分离并培养成单菌落；实验室中利用选择培养基筛选微生物的原理是_________________________________________________________________________________________。
(3)人工合成的新木聚糖酶的基因在导入受体细胞前要先构建________，以使目的基因能够表达和发挥作用。若要将重组大肠杆菌分泌的耐热耐碱木聚糖酶应用于造纸工业生产，除了需要研究木聚糖酶的产量外，还需要检测木聚糖酶的________。
(4)有研究表明，在木聚糖酶中特定部位引入精氨酸可以增加木聚糖酶中的离子键数目，从而增加该酶在碱性环境中的稳定性。利用蛋白质工程技术改造木聚糖酶，其基本思路是_____________
_______________________________________________________。根据新木聚糖酶的氨基酸序列设计新木聚糖酶的基因，会设计出多种脱氧核苷酸序列，原因是_____________________________________________________________________________________。
解析：(1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。与蛋白质工程相比，基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。(2)由于大肠杆菌为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少，所以在蛋白质工程和基因工程中常用大肠杆菌作为受体细胞。采用平板划线法分离纯化大肠杆菌时，使用的接种工具为接种环。实验室
中利用选择培养基筛选微生物的原理是：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。(3)人工合成的新木聚糖酶的基因在导入受体细胞前，需要先将其与载体结合，构建基因表达载体，以使目的基因能够表达和发挥作用。在将重组大肠杆菌分泌的耐热耐碱的木聚糖酶应用于造纸工业生产前，需要研究该木聚糖酶的产量并对木聚糖酶的生物活性(或催化效率)进行检测。(4)利用蛋白质工程技术改造木聚糖酶，其基本思路是：根据需要对耐碱的木聚糖酶的功能特点，设计新木聚糖酶中特定
部位引入精氨酸以后的氨基酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用 DNA 合成仪合成新木聚糖酶基因。由于密码子具有简并现象(或存在多种密码子决定同一种氨基酸的现象)，导致根据新木聚糖酶的氨基酸序列设计的新木聚糖酶的基因会有多种脱氧核苷酸序列。
答案：(1)蛋白质功能 自然界中已存在的蛋白质(2)为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少 平板划线
人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长
(3)基因表达载体 生物活性(或催化效率)
(4)根据需要对耐碱的木聚糖酶的功能特点，设计新木聚糖酶中特定部位引入精氨酸以后的氨基酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用 DNA 合成仪合成新木聚糖酶基因 密码子具有简并现象(或存在多种密码子决定同一种氨基酸的现象)
考向 6 生物技术的安全性和伦理问题
[典例 6](2022 年北京高考)生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质(E 物质)污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在 E 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白(GFP)等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E 物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是________。(2)为监测 E 物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中 ERE 和酵母来源的 UAS 是两种诱导型启动子，分别被 E 物质－受体复合物和酵母来源的 Gal4 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案 1 相比，方案 2 的主要优势是_____________________________________________________________，因而被用于制备监测鱼(MO)。
(3)现拟制备一种不育的监测鱼 SM，用于实际监测。SM 需经MO 和另一亲本(X)杂交获得。欲获得 X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：________。
①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子(P 生)
④使基因仅在肌细胞表达的启动子(P 肌)
Ⅱ.基因：________
C.雌激素受体基因(ER)
D.仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)
(4)SM 不育的原因是：成体 SM 自身产生雌激素，与受体结合
后____________造成不育。
(5)使拟用于实际监测的 SM 不育的目的是________________
_________________________________________。
解析：(1)将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。(2)由图可知，方案 1 中的 E 物质—受体复合物激活 ERE，使 GFP基因表达，方案 2 中的 E 物质—受体复合物先激活 ERE 获得 Gal4蛋白，然后 Gal4 蛋白激活 UAS 启动子，使 GFP 基因表达，方案2 中的 GFP 蛋白表达量大，更灵敏。(3)MO 和另一亲本(X)杂交获得 SM，MO 是方案 2 获得的，所以亲本 X 启动子选择 UAS。要
获得 SM 是不育个体，MO 是可育的，所以 X 必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)。(4)成体 SM 自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活 ERE 诱导 Gal4 表达，Gal4 与 UAS 启动子结合诱导 dg 表达，使生殖细胞凋亡。(5)监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要 SM 不育。
答案：(1)显微注射(2)监测灵敏度更高(3) ② D
(4)激活 ERE 诱导 Gal4 表达，Gal4 结合 UAS 诱导 dg 表达，
(5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
【考向集训】6.(2023 年北京高考)抗虫作物对害虫的生存产生压力，会使害虫种群抗性基因频率迅速提高，导致作物的抗虫效果逐渐减弱。为使转基因抗虫棉保持抗虫效果，农业生产上会采取一系列措施。
以下措施不能实现上述目标的是(
A.在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子B.大面积种植转基因抗虫棉，并施用杀虫剂C.转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植D.转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带
解析：在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子，则常规种子长成的普通植株能为敏感性(不抗虫)个体提供生存空间，增加与抗虫个体的竞争，避免抗性基因频率升高过快，提高了抗虫棉的抗虫持久性，A 正确。大面积种植转基因抗虫棉、施用杀虫剂，都会进一步选择并保存抗性强的个体，导致敏感性个体死亡，从而加快害虫种群抗性基因频率提高，不利于抗虫棉的抗虫持久性，B 错误。将转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植以及转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带，作用机理相似，可以使敏感型个体存活，敏感性个体能与抗性强的棉铃虫进行竞争，不会导致抗性基因频率升高过快，提高了抗虫棉的抗虫持久性，C、D 正确。
DNA 的粗提取与鉴定、DNA 片段的扩增及电泳鉴定1.DNA 的粗提取与鉴定。
2 ml/L NaCl
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧 DNA
分子的断裂，导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无 DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
2.DNA 片段的扩增及电泳鉴定。
①PCR 原理：_______________原理。
a.概念：是指带电分子在______的作用下发生迁移的过程。b.原理：在一定的 pH 下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上______________，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷______的电极移动。
c.作用过程：由于各种分子的带电性质差异、大小不同、形状不同，在电场作用下会产生不同的______速率，从而实现各种分
d.方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。PCR 的产物一般通过___________________来鉴定。
①PCR 实验操作步骤。
②鉴定 PCR 产物→琼脂糖凝胶电泳法→配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝
胶置于________下观察和照相。
[典例 1](2023 年广东高考)“DNA 粗提取与鉴定”实验的基
本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(A.裂解：使细胞破裂释放出 DNA 等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高 DNA 的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
解析：细胞吸水涨破，释放 DNA 等物质，A 正确。DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同，DNA 在2 ml/L 的氯化钠中溶解度最高，依此原理可分离出其他杂质，B正确。DNA 不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，反复多次可提纯 DNA，C 正确。加入二苯胺后，还需沸水浴处理才能出现蓝色，D 错误。
[典例 2](2022 年山东青岛一模)DNA 琼脂糖凝胶电泳的分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的 DNA 片段。下列
A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定 DNA 分子的混合物B.双链 DNA 分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大C.凝胶制备中加入的核酸染料能与 DNA 分子结合，用于分离后 DNA 的检测D.凝胶中的 DNA 分子通过染色，可在波长为 300 nm 的紫外灯下被检测出来
解析：琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离，可用于分离、鉴定 DNA 分子的混合物，A正确。凝胶中 DNA 分子的迁移速率与 DNA 分子的大小有关，双链 DNA 分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B 错误。凝胶制备中加入的核酸染料能与 DNA 分子结合，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来，用于分离后 DNA 的检测，C 正确。DNA 分子的大小和构象等有关，凝胶中的 DNA 分子通过染色，可以在波长为 300 nm 的紫外灯下被检测出来，D 正确。
【举一反三】1.(2022 年山东高考)关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下
A.过滤液沉淀过程在 4 ℃冰箱中进行是为了防止 DNA 降解B.离心研磨液是为了加速 DNA 的沉淀C.在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的 DNA 中可能含有蛋白质
解析：过滤液沉淀过程在 4 ℃冰箱中进行可以使酶的活性降低，可以防止 DNA 降解，A 正确。离心研磨液是为了加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质等的沉淀，B 错误。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C 正确。粗提取的 DNA 中可能含有蛋白质，D 正确。
2.(2023 年江苏苏州期初)下列关于琼脂糖凝胶电泳的叙述，错
A.加热熔化的琼脂糖完全冷却后加入适量的核酸染料B.电泳缓冲液加入电泳槽时，需没过凝胶 1 mm 为宜C.可调容量的微量移液器应先做容量设定再安装枪头D.停止电泳后应将凝胶置于紫外灯下，观察和照相
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