2021高三统考人教生物一轮（经典版）学案：选修3第10单元　第35讲　基因工程


选修3 现代生物科技专题
第十单元 现代生物科技专题
第35讲　基因工程
[考纲明细]　1.基因工程的诞生(Ⅰ)　2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)　3.基因工程的应用(Ⅱ)　4.蛋白质工程(Ⅰ)　5.实验：DNA的粗提取与鉴定
知识自主梳理
一　　基因工程的概念及基本工具
1．基因工程概念
基因工程的别名
基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作原理
基因重组
操作水平
DNA分子水平
基本过程
剪切→拼接→导入→表达
目的
创造出更符合人们需要的生物类型和生物产品
优点
克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传性状
2．DNA重组技术的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①本质：蛋白质。
②来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
③作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
④结果：产生黏性末端或平末端。
例：如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是—GAATTC—，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是—CCCGGG—，切割位点在C和G之间；说明限制酶具有特异性。


限制酶为何不切割自身DNA?
提示　限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是自身DNA中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
②类型
常用类型
E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
只“缝合”黏性末端
“缝合”黏性末端和平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

③DNA连接酶和限制酶的关系

(3)载体
①载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
②常用载体：质粒。其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
③质粒
a．概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
b．特点：能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
二　　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的获取
目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。
获取方法
(1)从基因文库中获取
①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，可分为基因组文库和部分基因文库(如cDNA文库)。
②构建过程
基因组文库的构建
cDNA文库的构建


(2)利用PCR技术扩增目的基因
①PCR含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
②PCR原理：DNA双链复制。
③前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
④要求
模板：目的基因两条链。
原料：dCTP、dATP、dGTP、dTTP。
酶：热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。
引物：人工合成的两条DNA片段(引物1，引物2)。
⑤PCR反应过程
过程
说明
图解
变性
当温度上升到90～95_℃时，双链DNA解旋为单链

复性
温度下降到55～60_℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

延伸
70～75 ℃时，Taq酶从引物3′端开始进行互补链的合成

⑥方式：指数形式扩增(2n，n为扩增循环的次数)。
⑦结果：短时间内大量扩增目的基因。
(3)人工合成
①前提条件：核苷酸序列已知，基因比较小。
②方法
a．反转录法：目的基因的mRNA单链DNA―→双链DNA(目的基因)
b．化学合成法：通过DNA合成仪直接人工合成
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)操作目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)组成

(3)构建过程


获取目的基因与切割载体时只能用同一种限制酶吗？
提示　不是只能用一种限制酶，也可以用不同的限制酶，只要切割后目的基因和载体的黏性末端相同即可。
3．将目的基因导入受体细胞
(1)将目的基因导入植物细胞
①农杆菌转化法：最常用的方法。
a．受体细胞：植物体细胞或受精卵。
b．操作过程：将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上―→转入农杆菌―→导入植物细胞―→T­DNA上的目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上―→目的基因表达。
②基因枪法：适用于单子叶植物，成本较高。
③花粉管通道法：将目的基因通过花粉管通道导入受体细胞，十分简便经济。
(2)将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射技术。
②受体细胞：动物的受精卵。
③操作过程：将含有目的基因的表达载体提纯―→取卵(受精卵)―→显微注射―→受精卵经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内―→获得具有新性状的动物。

获得转基因动物时，通常选择受精卵做受体细胞的原因？
提示　受精卵全能性高，可使目的基因在相应的组织细胞内表达。
(3)将目的基因导入微生物细胞
①转化方法
a．用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。
b．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子。
②受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。
③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
4．目的基因的检测与鉴定
类型
步骤
检测内容
方法
分子检测
第一步
转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)
第二步
目的基因是否转录出了mRNA
分子杂交技术(DNA和mRNA之间)
第三步
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原—抗体杂交技术
个体生物学水平鉴定
抗虫或抗病接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度
(1)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
(2)在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段。
三　　基因工程的应用
1．转基因植物
植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
2．转基因动物
动物基因工程在动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等方面显示了广阔的应用前景。
3．基因工程药物
(1)来源：转基因的工程菌。
(2)成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
(3)作用：用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。
4．基因治疗
(1)方法：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能。
(2)效果：治疗遗传病的最有效的手段。
(3)分类：体内基因治疗和体外基因治疗。
四　　蛋白质工程
1．概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2．基本途径：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)。
考点题型突破
考点1　　基因工程的操作工具
1．下列关于载体的相关叙述错误的是(　　)
A．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒
B．天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞
C．载体DNA分子上要有一个至多个限制酶切割位点
D．载体上的标记基因有利用筛选含重组DNA的细胞
答案　B
解析　天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造。
2．(2016·全国卷Ⅲ)图a中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图b为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图b所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图c所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是________________________________________________________________________。

(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________________。
答案　(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可)
(3)E·coli DNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶(其他合理答案也可)
解析　(1)分析图a可知，限制酶Sau3A Ⅰ与BamH Ⅰ切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。
(2)构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能被转录。
(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。

与DNA相关的六种酶的比较
名称
作用部位
底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
磷酸二酯键
DNA片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
以单链DNA为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
DNA
将双链DNA分子局部解旋为单链
RNA聚合酶
磷酸二酯键
核糖核苷酸
以DNA一条链为模板，将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
考点2　　基因工程的基本操作程序
1．(2017·江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得________用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的____________________位点。设计引物时需要避免引物之间发生________，而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号：①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。
答案　(1)逆转录　cDNA
(2)限制性核酸内切酶识别　碱基互补配对
(3)变性
(4)引物与模板　GC含量高
(5)②③
解析　(4)退火温度过高，会破坏引物与模板的碱基配对。因A、T之间形成两个氢键，G、C之间形成三个氢键，G、C含量高的引物与模板之间氢键多，稳定性高，破坏氢键需要更多的能量，所以可以设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高，或者设计的引物不合适，不能与模板结合。因此可采取的改进措施有降低退火温度、重新设计引物等。
2．(2019·成都一诊)用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示。回答下列问题：

(1)①过程所需的酶是________。从cDNA文库中获取的目的基因________(填“有”或“无”)启动子。实现②过程常用________技术，运用该技术的前提是要有________________________，以便合成引物。
(2)过程③将重组表达载体导入大肠杆菌时，首先用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是____________________________。然后将________________溶于缓冲液中与该大肠杆菌混合，在一定温度下完成转化。
(3)过程④可利用________技术鉴定CarE基因是否已导入大肠杆菌。
答案　(1)逆转录酶　无　PCR　一段已知目的基因的核苷酸序列
(2)使大肠杆菌处于较易吸收周围环境中DNA分子的生理状态　重组表达载体(重组质粒)
(3)DNA分子杂交
解析　(1)过程①是以mRNA为模板合成cDNA的逆转录(反转录)过程，此过程需要逆转录酶的参与。mRNA中无启动子的转录片段，所以从cDNA文库中获取的目的基因无启动子。过程②可表示使用PCR技术扩增目的基因的过程，运用该技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。
(2)过程③表示将重组表达载体导入大肠杆菌。用Ca2＋处理大肠杆菌的目的是使大肠杆菌处于较易吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体溶于缓冲液中与该大肠杆菌混合，在一定温度下完成转化。
(3)过程④是目的基因的检测与鉴定，可利用DNA分子杂交技术鉴定目的基因(即CarE基因)是否导入大肠杆菌。

3．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________________________________________________；并且____________和____________________________________________的细胞也是不能区分的，其原因是________________________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于______________。
答案　(1)能自我复制、具有标记基因
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素
(3)受体细胞
解析　(1)质粒作为载体应具备的基本条件有：能自我复制、具有标记基因、含有一至多个限制酶切割位点等。
(2)由题意可知，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因，所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因(四环素抗性基因被破坏)，所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能，所以可用含有四环素的培养基，筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。
(3)噬菌体属于病毒，病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自于受体细胞。
4．(2019·河南省九师联盟高三质检)内皮抑素是从血管内皮细胞瘤中分离出的一种内源性血管生成抑制因子，能特异性地抑制内皮细胞增殖和迁移。某小组为获得内皮抑素，构建分泌型内皮抑素基因表达载体，并在C6细胞(大鼠源性胶质瘤细胞)中表达。具体操作如下：
(1)构建分泌型内皮抑素基因表达载体
①采用相关技术提取1日龄SD大鼠大脑半球组织中的总RNA，检测RNA质量和浓度。
②内皮抑素cDNA的获得：以上述提取的RNA为模板，通过________过程获得cDNA，并利用PCR技术体外扩增cDNA。PCR技术中除需目的基因作为模板外，还需要的条件有____________________________和控制温度等。
③为避免目的基因和载体自身环化，酶切目的基因和载体时，可用____________________酶切割，以保证目的基因和载体两侧具有____________________。
(2)目的基因在C6细胞中表达(将目的基因导入C6细胞中，并表达)
①培养C6细胞时，为防止杂菌污染，同时检测目的基因是否导入受体细胞，可在培养基中加入一定量的________。
②若要检测目的基因是否成功整合到受体细胞的DNA上，可采用________________技术。
③导入C6细胞中的目的基因成功表达后，可能会使C6细胞在大鼠体内的________________受到抑制。
答案　(1)②逆转录　热稳定DNA聚合酶(Taq酶)、两种引物、四种脱氧核苷酸　③两种限制性核酸内切(限制)　不同的黏性末端
(2)①抗生素　②DNA分子杂交　③增殖和迁移
解析　(1)遗传信息从RNA到DNA的过程叫逆转录。PCR技术中除需目的基因作为模板外，还需要的条件有热稳定DNA聚合酶(Taq酶)、两种引物、四种脱氧核苷酸和控制温度等。为避免目的基因和载体自身环化，酶切目的基因和载体时，可用双酶切法，即两种限制性核酸内切(限制)酶切割，以保证目的基因两侧和载体上具有不同的黏性末端。
(2)在培养细胞时，为防止杂菌污染，同时检测目的基因是否导入受体细胞，可在培养基中加入一定量的抗生素。若要检测目的基因是否成功整合到受体细胞的DNA上，可采用DNA分子杂交技术。根据题干信息可知，导入C6细胞中的目的基因成功表达后，会使C6细胞在大鼠体内的增殖和迁移受到抑制。

1.基因表达载体构建时限制酶的选择

(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ、PstⅠ和EcoRⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致(也可以是能形成相同黏性末端的不同限制酶)，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。
2．基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
3.如何筛选出含有目的基因的受体细胞


(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
(3)筛选方法：将转化后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考点3　　基因工程的应用及蛋白质工程
题型一 基因工程的应用
1．(2019·山东聊城二模)普通番茄细胞中含有PG基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶(简称PG)，PG能破坏细胞壁使番茄软化不耐贮藏。科学家将抗PG基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。如图表示抗PG基因的作用原理，回答下列问题：

(1)据图回答该转基因番茄具有抗软化、保鲜时间长的原理是______________________________。
(2)为培育抗软化番茄，应采用________技术将抗PG基因进行体外扩增。在该技术的反应体系中除模板、引物、原料外，还需要加入________，这个基因的表达需要________等不可缺少的调控组件。
(3)将抗PG基因插入Ti质粒的________上构建基因表达载体，通过农杆菌转化法将抗PG基因导入番茄细胞，为检验抗PG基因是否成功表达，在个体生物学水平上应检测____________________________________。
(4)为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入________(填“细胞核”或“细胞质”)。
答案　(1)抗PG基因能阻止PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG
(2)PCR(多聚酶链式反应)　热稳定DNA聚合酶(Taq酶)　启动子、终止子
(3)T－DNA　转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短
(4)细胞质
解析　(1)据题图可知，抗PG基因转录成的mRNA能够与PG基因转录成的mRNA结合，阻止了PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG，不能破坏细胞壁而使转基因番茄抗软化且保鲜时间延长。
(2)采用PCR技术将抗PG基因进行体外扩增；PCR过程所需要的条件有：模板(抗PG基因)、引物、原料、热稳定DNA聚合酶；启动子、终止子等是基因表达不可缺少的调控组件。
(3)将抗PG基因插入Ti质粒的T－DNA上构建基因表达载体，通过农杆菌转化法将抗PG基因导入番茄细胞，为检验抗PG基因是否成功表达，在个体生物学水平上应检测转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短。
(4)花粉中的雄配子几乎不含质基因，所以为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入细胞质。

有关基因工程应用的四个易错点
(1)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。
(2)Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。
(3)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。
(4)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器。操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。
题型二 蛋白质工程
2．(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和__________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
答案　(1)氨基酸序列(或结构)
(2)P　P1　DNA和RNA(或遗传物质)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列　功能
解析　(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程对构成蛋白质的氨基酸序列进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。
(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。所获得的基因表达遵循中心法则，中心法则的全部内容包括DNA和RNA复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即DNA→RNA，RNA→DNA，RNA→蛋白质。
(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。

蛋白质工程与基因工程的比较
项目
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列(基因)
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
生产自然界中没有的蛋白质
生产自然界中已有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现
实验16　DNA的粗提取与鉴定

1．DNA粗提取和鉴定的原理
(1)提取思路：利用DNA和其他物质在理化性质方面的差异，提取DNA。
(2)DNA的理化性质(提取和鉴定原理)：
①DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同

②DNA不溶于酒精；
③对酶、高温和洗涤剂的耐受性强；
④DNA＋二苯胺试剂蓝色。
2．DNA粗提取和鉴定的操作流程


1．(2019·扬州江都中学段考)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水
B．向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了释放出DNA
C．向浓盐溶液中加蒸馏水是为了析出DNA
D．用菜花替代鸡血做实验，其实验操作步骤相同
答案　D
解析　DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水，A正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了让鸡血细胞吸水涨破，从而释放出DNA，B正确；向溶解DNA的浓盐溶液中加蒸馏水是为了降低DNA的溶解度，进而析出DNA，C正确；用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤不完全相同，如植物细胞有细胞壁，破碎细胞时需要充分搅拌和研磨并加入食盐和洗涤剂，D错误。
2．下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验依据原理的叙述，错误的是(　　)
A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白质能溶于酒精溶液，可将DNA与蛋白质分离
B．利用高温能使蛋白质变性，却对DNA没有影响的特性，可将DNA与蛋白质分离
C．二苯胺与DNA沸水浴呈现蓝色可用于DNA的鉴定
D．在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分离
答案　B
解析　高温能使蛋白质、DNA变性，蛋白质在60～80 ℃发生变性，DNA在80 ℃以上变性。
3．下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　)
选项
试剂
操作
作用
A
柠檬酸钠溶液
与鸡血混合
防止血液凝固
B
蒸馏水
与鸡血细胞混合
保持细胞形状
C
蒸馏水
加入到溶解有DNA的NaCl溶液中
析出蛋白质
D
冷却的酒精
加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中
产生特定的颜色反应
答案　A
解析　蒸馏水与鸡血细胞混合的目的是使红细胞吸水涨破，释放出核物质，B错误；将蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C错误；加入冷却酒精的目的是进一步析出DNA，D错误。

DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
加蒸馏水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布过滤4次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
方向真题体验
1．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是____________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)基因组文库　cDNA文库
(2)解旋酶　加热至90～95 ℃　氢键
(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析　(1)基因工程中的基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，通过解旋酶解开DNA双链。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，通过高温(90～95 ℃)使反应体系中的模板DNA解链为单链。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。
(3)大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，故在PCR反应中要用能耐高温的Taq酶。
2．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是____________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证__________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的________________________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
答案　(1)E1和E4　甲的完整　甲与载体正确连接
(2)转录　翻译
(3)细胞核　去核卵母细胞
(4)核DNA
解析　(1)甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1－GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶是E1和E4。
(2)构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白(GFP)”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。
(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。
(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
3．(2018·天津高考)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原基因等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。
A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起________免疫，增强免疫保护效果。
答案　(1)PCR　多肽(或蛋白质)
(2)载体　总RNA
(3)非天然氨基酸(Uaa)　D
(4)细胞
解析　(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列，则改造后的基因转录合成的mRNA中，终止密码子提前出现，将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。
(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定，以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)由(2)知，转基因宿主细胞含有特殊tRNA基因转录的tRNA，该tRNA的反密码子可与终止密码子配对，并可携带非天然氨基酸(Uaa)，所以培养基中需补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒的基因进行转录时利用的是宿主细胞的酶，识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。
(4)因该病毒疫苗侵染人体细胞，故可引起细胞免疫。
4．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了__________________________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞，而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是____________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
答案　(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
(2)转化　外壳蛋白(噬菌体蛋白)　细菌
(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
解析　(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。
(2)用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，可以增大细胞膜的通透性，使重组的质粒更容易导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞。噬菌体主要寄生在细菌体内，而不能寄生在其他细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
5．(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是
_______________________________________________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是________________________________________________________________________。
答案　(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
(3)繁殖快、容易培养
(4)蛋白A的抗体
(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
解析　(1)人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因A有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制，故无法表达出蛋白A。
(2)噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主细胞，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主细胞。家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。
(3)与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。
(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，可用相应的抗体即蛋白A的抗体进行抗原—抗体杂交。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜等产生的基因整合到了R型细菌的DNA分子中并成功得以表达。也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。