2024届苏教版高中生物一轮复习基因工程的基本工具和基本操作程序课件

这是一份2024届苏教版高中生物一轮复习基因工程的基本工具和基本操作程序课件，共60页。PPT课件主要包含了重温真题经典再现，限时强化练，基础·精细梳理，疑难·精准突破，典例·精心深研，基因工程概述，基因工程的理论基础，2DNA连接酶，3载体，情境推理·探究等内容，欢迎下载使用。
课标内容　(1)阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。(2)阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。(3)DNA的粗提取与鉴定实验。(4)利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
基因工程的基本操作程序
重组DNA技术的基本工具
DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
考点一　重组DNA技术的基本工具
2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。　　　
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。　　　
1.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是___________________________________________(答出两点即可)。
对靶细胞具有较高的转化效率；对细胞无害
2.限制性内切核酸酶EcRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcRⅠ切割后所形成的黏性末端。
3.软米基因会导致水稻稻米合成直链淀粉含量降低呈现软米特征，人们大多喜欢软米的口感，为获得高产软米粳型水稻，软米基因Wxmq与蜡质基因Wx互为等位基因，序列长度相同均为557碱基对(bp)，但基因内部出现了限制酶NlaⅢ识别位点，用限制酶NlaⅢ处理不同植株的DNA片段，获得电泳图如下，分析可知含有纯合软米基因的植株为哪几个？(填植株编号)
提示　1、4、5、9、10。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcR Ⅰ两种限制酶。
2.标记基因的作用标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：
1.(2023·江苏盐城调研)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，ne表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(　　)
考向　围绕基因工程的基本工具，考查科学思维
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNAB.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
解析　切割目的基因时，用BamH Ⅰ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和Hind Ⅲ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用Pst Ⅰ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。
2.(2021·全国乙卷，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中__________________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
EcR Ⅰ、Pst Ⅰ
EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是_____________。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能__________；质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________________________________________________________。(4)表达载体含有启动子，启动子是指________________________________________________________________________________________________________。
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
解析　(1)由题图可以看出，EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.cli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
考点二　基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
耐高温的DNA聚合酶
①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。　　　
2.基因表达载体的构建——核心
　受体细胞中是否含有目的基因
提醒　启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
3.将目的基因导入受体细胞只有该步骤没涉及碱基互补配对原则
(1)农杆菌特点①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T­-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T­-DNA导入受体细胞。(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。　　　
4.目的基因的检测与鉴定
1. 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
①第1组：____________________________________________________________；②第2组：___________________________________________________________。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2.如果将某种抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递遵循孟德尔分离定律。判断依据是___________________________________________________________。
仅一条染色体含有抗性基因，另一条没有其等位基因
3.利用大肠杆菌可生产出人的胰岛素，联系前面各种细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可用大肠杆菌吗？提示　不可用。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的内质网、高尔基体等结构，无法对核糖体合成的肽链进行加工。
1.(2022·南通四模)递减PCR是常规PCR技术的发展，下图表示递减PCR各阶段温度及时间控制。下列相关叙述错误的是(　　)
A.PCR反应体系中应加入TaqDNA聚合酶、模板DNA、4种脱氧核苷酸、引物、缓冲液等物质B.第1阶段的目的是使模板DNA充分解旋，减少DNA复杂结构对扩增的影响C.第2阶段中复性温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第3阶段提供更多正确的模板D.第4阶段72 ℃下维持10 min，主要目的是使子链与互补模板链结合形成双螺旋
解析　PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，PCR反应体系中应加入Taq DNA聚合酶(催化DNA子链的形成)、模板DNA、4种脱氧核苷酸(原料)、引物、缓冲液等物质，A正确；分析题图可知，第1阶段是在96 ℃条件下处理4 min，该阶段的目的是使模板DNA在高温下充分解旋，得到单链DNA，以减少DNA复杂结构对扩增的影响，B正确；第2阶段中复性温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第3阶段提供更多正确的模板，C正确；72 ℃下维持10 min，主要目的是使与模板互补的DNA链延伸，以形成新的脱氧核苷酸链，D错误。
2.(2022·全国乙卷，38)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题：
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的____________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明_____________________________。(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是____________________________________________________________________。
曾感染新冠病毒，已康复
已感染新冠病毒，是患者
获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
解析　(1)以病毒RNA为模板合成cDNA是逆转录过程，这一过程需要的酶是逆转录酶。获得cDNA后可通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为确保PCR扩增获得的是特异性序列，从而确保新冠病毒核酸检测的准确性，设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，即变性(超过90 ℃)→复性(50 ℃左右)→延伸(72 ℃左右)，其中温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明他体内没有新冠病毒，但曾感染新冠病毒，已经康复；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明他体内已感染新冠病毒，是患者。(4)基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
跳出题海　 如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考点三　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。　　　
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础
(2)PCR实验操作步骤
(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为________的紫外灯下被检测出来。
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快。　　　
1.(2023·江苏启东中学检测)如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述正确的是(　　)
A.图1中的溶液a是NaCl溶液B.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶C.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显D.图2中试管1的作用是证明2ml·L－1的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
解析　图1所示操作为析出DNA，溶液a是研磨液过滤静置后得到的上清液，不是NaCl溶液，A错误；加入预冷的酒精的目的是析出DNA、去除溶于酒精的蛋白质等杂质，原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精，B错误；图2所示操作中的错误是试管中的液面高于水浴的液面，导致试管受热不均匀，C正确；图2中试管1的作用是作为对照，排除NaCl溶液对实验结果的干扰，D错误。
2.(2023·河北衡水调研)下列有关电泳的叙述，不正确的是(　　)A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率C.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定解析　DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳，即带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A正确，C错误。
1.(2019·江苏卷，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(　　)A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNAD.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
解析　哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和细胞器，不能提取到DNA；鸡血细胞具有细胞核和各种细胞器，用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量差异很大，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。
2.(2021·江苏卷，23改编)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增①提取真菌细胞________________________，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致__________________________________________。
基因m转录出来的mRNA
蛋白M上不含tag标签
(2)重组质粒的构建①将Sma Ⅰ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进________________________，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及_____________酶等，完成质粒的环化。②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma Ⅰ切开，则Sma Ⅰ的酶切位点可能在_______________________________。
基因m的连接处、基因m的内部
(3)融合蛋白的表达①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A－m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是______________________________________________________________________________________________________________________________________。②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明_____________________________________，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落
融合基因表达(或融合基因正确解码)
解析　(1)①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。(2)①从图上看，载体A只有一个Sma Ⅰ的酶切位点，故被Sma Ⅰ切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma Ⅰ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的
DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。②重组质粒中，载体A被Sma Ⅰ切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma Ⅰ切开，则Sma Ⅰ的酶切位点可能在基因m的连接处、基因m内部。(3)①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或融合基因正确解码)。
3.(2020·江苏卷，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcR Ⅰ是一种__________________________酶，它通过识别特定的_____________切割特定位点。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成______________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化_______________________________。
限制性内切核酸(或限制)　
以DNA为模板的DNA链的延伸　
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________(从引物①②③④中选择，填编号)。
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。A.5′－AACTATGCG┈┈AGCCCTT－3′B.5′－AATTCCATG┈┈CTGAATT－3′C.5′－GCAATGCGT┈┈TCGGGAA－3′D.5′－TTGATACGC┈┈CGAGTAC－3′
解析　(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的EcR Ⅰ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′—羟基和5′—磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，TaqDNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcR Ⅰ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为－AATT，3′端序列应为－TTAA，B正确。
4.(2019·江苏卷，33)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在___________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是__________________、__________________。
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是____________________。
解析　(1)EcR V酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处，产生的是平末端。(2)DNA连接酶对平末端的连接效率较低，因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则，处理后的载体质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸；要将处理后的质粒与目的基因连接起来，需要用DNA连接酶。(3)由于四环素抗性基因中含有EcR V酶识别的序列及切割位点，所以形成的重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常。根据表中结果可知，A类菌落抗氨苄青霉素和四环素，说明A菌落中导入的是P0质粒；B类菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素，说明B类菌落中导入的是重组质粒；C类菌落既不抗氨苄青霉素，也不抗四环素，说明C类菌落中没有导入质粒。
(4)由于处理后的P2质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶的脱氧核苷酸，而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以目的基因在和P2质粒连接时可能会出现两种情况：正向连接和反向连接。分析图2可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50 bp＋300 bp＋100 bp＝450 bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和P2质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300 bp＋100 bp＝400 bp的片段。
5.(2018·江苏卷，32改编)为生产具有特定性能的α－淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α－淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α－淀粉酶，实验流程如图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α－淀粉酶基因前，需先获得细菌的_________________。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的___________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是___________________________________________。(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_______的设定与引物有关，_______的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)①变性温度　②复性温度　③延伸温度　④变性时间　⑤复性时间　⑥延伸时间
使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连
(4)如图表示筛选获得的工程菌中编码α－淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。(5)获得工程菌表达的α－淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如表所示：
根据上述实验结果，初步判断该α－淀粉酶活性最高的条件为______________________________________。
pH为8.5，缓冲液为50 mmL/L Tris－HCl
解析　(1)利用PCR技术扩增α－淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。(2)构建重组DNA分子时，需用限制性内切核酸酶处理目的基因和载体，故需要在引物的5′端添加限制性酶切位点，且常在两条引物上设计添加不同的限制性酶切位点，这样可以使DNA片段按照一定方向插入表达载体，防止目的基因或载体自身的黏性末端之间相互连接以及目的基因与载体反向连接。(3)利用PCR技术进行扩增时，复性温度的设定是成败的关键，复性温度过高会使引物无法与模板的碱基配对，所以复性温度的设定与引物有关；延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子由mRNA上相邻的3个碱基组成，所以该片段的24个碱基包含8个密码子。该片段后面的第一个碱基为U，所以后面的密码子最多可能有4×4＝16(种)，根据题干信息及题中给出的mRNA序列可知，虚线框后第一个密码子不可能是终止密码子，所以实际最多有13种密码子。(5)由表格数据可知，该α－淀粉酶活性最高的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mml/L Tris－HCl。
考点一　重组DNA技术的基本工具1.(2023·山东日照期中)四种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述错误的是(　　)
A.上图中EcR Ⅰ、Pst Ⅰ两种酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接B.图中Sma Ⅰ、EcR V两种酶切割后的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶连接C.DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段连接的化学键是磷酸二酯键D.限制酶能识别特定的核苷酸序列，具有专一性，不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端
解析　不同的限制酶切割也可能形成相同的黏性末端，D错误。
2.(2023·北京海淀区模拟)科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.农杆菌的T－DNA与番木瓜基因发生重组B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性
解析　构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；抗病毒蛋白基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部，插入抗病毒蛋白基因C后，重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏，含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性，C错误；转基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故转基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D错误。
考点二　基因工程的基本操作程序3.(2023·北京民族大学附中期末)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　)
A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
解析　⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D错误。
4.(2023·山东济宁联考)图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是(　　)
A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
解析　通过PCR获取目的基因时，两种引物分别和目的基因的两条单链结合，并沿相反的方向合成子链，故选用引物甲和引物丙，A正确；由甲图可知，选用BamHⅠ会破坏两种抗性基因，结合乙图可确定应选择BclⅠ和HindⅢ剪切，B正确；将目的基因导入大肠杆菌常采用Ca2＋转化法，C正确；构建重组质粒时目的基因插入氨苄青霉素抗性基因中，故氨苄青霉素抗性基因被破坏不能表达，D错误。
5.(多选)(2022·盐城三模)某实验小组进行“DNA的粗提取与鉴定”实验。下列有关叙述正确的是(　　)A.取材时可选用鸡血、洋葱、菜花等富含DNA的材料进行实验B.破碎植物细胞时，加入洗涤剂以加速细胞壁瓦解C.DNA的释放和溶解是实验成功与否的关键，调节NaCl溶液浓度有利于DNA释放D.鉴定时，需将DNA溶解在2 ml/LNaCl溶液中，再加入二苯胺试剂进行沸水浴
解析　鸡血、洋葱、菜花等材料富含DNA，可以用来进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，A正确；破碎植物细胞时，加入洗涤剂以加速细胞膜瓦解，B错误；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，加入体积分数为95%的酒精，有利于DNA的释放，调节NaCl溶液浓度有利于DNA的溶解，C错误；用二苯胺试剂鉴定提取的DNA时，沸水浴加热冷却后会出现蓝色，D正确。
6.(多选)(2023·南师附中期初)载体是基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述正确的是(　　)
A.重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体B.载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因C.必须把目的基因插入重组载体A的启动子和终止子之间D.培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
解析　重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A正确；作为运载体必须要具备的条件有：含有限制酶的切割位点(便于目的基因的插入)、复制原点(便于目的基因的扩增)及标记基因(便于筛选含有目的基因的受体细胞)等，因此载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因，B正确；培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A的启动子和终止子之间，C错误；培养细菌A的目的是扩增目的基因，培养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D错误。
7.(多选)(2022·南通第一次质检)某科研团队运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，蓄意逃避监管，实施了人类胚胎基因编辑活动。该技术的原理是通过设计向导RNA中的识别序列，引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。下列有关叙述正确的是(　 　)
A.向导RNA可在RNA聚合酶催化下，以核糖核苷酸为原料合成B.向导RNA中的识别序列可与目标DNA单链特定区域进行碱基互补配对C.Cas9蛋白的作用是破坏DNA特定位点脱氧核苷酸之间的氢键D.该技术由于存在脱靶等风险，可能会带来一系列安全性及伦理问题
解析　向导RNA可通过转录形成，该过程需要RNA聚合酶催化，A正确；由图可知，向导RNA中的识别序列可与目标DNA单链特定区域进行碱基互补配对，B正确；Cas9蛋白是一种内切核酸酶，作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；该技术由于存在脱靶等风险，可能会带来一系列安全性及伦理问题，D正确。
8.(多选)(2022·江苏百校大联考)RNA经逆转录后再进行PCR扩增的技术称为RT－PCR，过程如图所示。下列相关叙述正确的是(　 　)
A.过程①需要RNA、逆转录酶、引物、核糖核苷酸等条件B.真核细胞的mRNA经过程①②获得的DNA无内含子片段C.过程③PCR扩增时引物中的CG含量会影响复性温度D.RT－PCR技术可应用于新冠病毒(RNA病毒)的核酸检测
解析　过程①是由RNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，需要RNA、逆转录酶、引物、脱氧核苷酸等条件，A错误；真核细胞中DNA的外显子部分转录的RNA拼接形成mRNA，因此真核细胞的mRNA经过程①②逆转录过程获得的DNA无内含子片段，B正确；CG含量越高，氢键越多，结构越稳定，因此过程③PCR扩增时引物中的CG含量会影响复性温度，C正确；新冠病毒遗传物质是RNA，RT－PCR技术可应用于新冠病毒的核酸检测，D正确。
9.(多选)(2022·苏州期末)人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用。干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。①～④表示相关的操作，EcRⅠ、BamHⅠ为限制酶，它们的识别序列及切割位点如下表所示。下列有关叙述错误的是(　　)
A.过程①所需的两种引物中分别加上GAATTC和GGATCC序列有利于后续操作B.构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制C.过程③利用的是T－DNA的特性将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA中D.过程④需控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化解析　结合题干信息分析题图可知，PCR的产物用EcR Ⅰ和BamH Ⅰ来酶切，因此在两种引物中分别加上GAATTC和GGATCC序列有利于后续操作，A正确；启动子负责与RNA聚合酶结合启动表达，终止子负责终止表达，因此构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行表达，B错误；根瘤农杆菌是原核生物，无染色体，C错误；整个过程最终需要利用愈伤组织细胞生成干扰素，因此过程④应控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化，D正确。
10.(2022·泰州三模)研究人员利用农杆菌介导法和花粉管通道法培育出转抗寒基因PgLCBF1的月季石榴，主要过程示意图如下。请回答下列问题。
(1)质粒pB1121的复制原点中A－T比例高，有利于________。过程①用限制酶XbaⅠ分别切割质粒和抗寒基因，原因是__________________________________________________________________________________________________。(2)过程②筛选时，应将菌液用______________法接种培养，使用的培养基除水、无机盐、碳源、氮源和生长因子外，还应加入的物质有______________。实验中过程③扩大培养的主要目的是____________________________________________________________________________________________________。
形成相同的黏性末端，便于将目的基因插入到质粒特定部位
转基因大肠杆菌快速增殖，获得更多的重组质粒(或获得更多的重组质粒)
(3)转基因农杆菌借助萌发的花粉管运输，将PgLCBF1导入________中，最终获得转基因种子，经播种、筛选出抗寒月季石榴新品种。与农杆菌直接转化月季石榴叶肉细胞相比，花粉管通道转化法具有的优点有__________________________________________________________________________________。
操作简单、直接，不需要经过植物组织培养，转化成功后可直接获得种子
(4)为探究上述农杆菌菌液浸染的合适介质和时期，研究人员进行了如下实验，请完成下表。
等量的上述不同介质[植物组织培养液(MS)、质量浓度为5%蔗糖溶液、MS＋5%蔗糖混合溶液]
用等量不同的农杆菌浸染液涂抹传粉后的月季石榴花柱头
解析　(1)由于A与T配对时形成两个氢键，而C与G配对时形成三个氢键，所以质粒pB1121的复制原点中A－T比例高，有利于解旋，将双链打开，进行DNA复制。由于用相同的限制酶切割可获得黏性末端相同的质粒和目的基因，便于将目的基因插入到质粒特定部位。(2)过程②形成的菌落分布均匀，说明是用稀释涂布平板法接种的。由于质粒上的标记基因为新霉素抗性基因，因此使用的培养基除水、无机盐、碳源、氮源和生长因子外，还应加入琼脂和新霉素，以便筛选导入重组质粒的大肠杆菌菌落。实验中过程③扩大培养的主要目的是获得更多的转基因大肠杆菌，以获得更多的重组质粒。
(3)转基因农杆菌借助萌发的花粉管运输，将PgLCBF1导入受精卵中，最终获得转基因种子，经播种、筛选出抗寒月季石榴新品种。与农杆菌直接转化月季石榴叶肉细胞相比，花粉管通道转化法具有的优势是操作简单、直接，不需要经过植物组织培养，转化成功后可直接获得种子。(4)本实验是探究农杆菌菌液浸染的合适介质和时期，因此配置农杆菌浸染液时，需将5 mL转基因农杆菌菌液，分别与上述不同介质(MS培养液、质量浓度为5%蔗糖溶液、MS＋5%蔗糖混合溶液)混匀；蘸取收集好的花粉，轻轻点涂在花柱的柱头上，属于人工授粉的过程；分别在授粉时和授粉后24 h，选择柱头未开裂的花，用等量不同的农杆菌侵染液涂抹传粉后的月季石榴花柱头，并作标记，每个处理浸染10朵花，一段时间后收获种子并进行种植，统计坐果率、种子出芽率和转化阳性率。
11.(2023·云南名校联盟)干扰素是动物体内的一种蛋白质，几乎能抵抗所有病毒引起的感染，在新冠病毒的治疗过程中起到了重要作用。此外，干扰素还用于治疗乳腺癌、骨髓癌、淋巴癌等癌症。传统的生产方法是从人体血液中的白细胞中提取，产量很低。用基因工程方法让酵母菌生产人的干扰素，可以使产量大幅度提高。回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是_____________________，该步骤需要用限制酶PstⅠ切割质粒和干扰素基因，已知Pst Ⅰ识别的核苷酸序列以及切割位点为CTGCA↓G，则PstⅠ切割干扰素基因和质粒产生的黏性末端为___________，可以用________________________________(填“E.cliDNA连接酶”“T4DNA连接酶”或“E.cli DNA连接酶或T4DNA连接酶”)将切割后的黏性末端缝合在一起。
E.cli DNA连接酶或T4 DNA连接酶