新高考生物一轮复习考点课件第57讲 基因工程的基本工具和基本操作程序（含解析）

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第57讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三 种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一　重组DNA技术的基本工具
考点二　基因工程的基本操作程序
考点三　DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
主要考点 必备知识
重组DNA技术的基本工具
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
2.重组DNA技术的基本工具
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀”
限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
①全称和简称全称——限制性内切核酸酶 简称——限制酶
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶。
资料卡：限制酶的命名：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia cli)的R型菌株分离来的，就用字母EcR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcRI。
练习：粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______
④特点：能识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
大肠杆菌的EcRⅠ限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
⑤识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
⑥切割结果当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端；
现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________ EcRⅠ________HindⅢ________ BglⅡ ________
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
Hind III和EcR I
下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？
用同种限制酶切割(EcRⅠ)
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。
E·cli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接粘性末端
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
★思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
A A T T G
①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 。
都能催化形成磷酸二酯键
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
①作用：将外源基因送入受体细胞&在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
②种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
最常用的载体——质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
大肠杆菌及质粒结构模式图
③作为载体需具备的条件
a.有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
b.能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
c.常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
标记基因的筛选原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
选择培养基50µg/ml四环素
例：选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。（2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。
考向 　基因工程工具酶的应用
1.已知限制性内切酶XmaⅠ和SmaⅠ的识别序列分别为C↓CCGGG和CCC↓GGG。有关这两种酶及应用的叙述，错误的是(　　)A．这两种酶作用的底物都是双链DNAB．DNA中出现这两种酶识别序列的概率不同C．XmaⅠ切割DNA形成的黏性末端是—GGCCD．使用这两种酶时需注意控制反应温度、时间等
解析:限制酶的作用是能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，所以限制酶作用的底物是双链DNA分子，A正确；由题干可知，这两种限制酶识别的核苷酸序列相同，所以识别序列的机率相同，B错误；根据碱基互补配对原则，CCCGGG的互补链是GGGCCC，并根据XmaⅠ的切割位点可知，切割后的黏性末端是—GGCC，C正确；温度能影响酶的活性，所以使用酶时需要注意控制反应温度和时间等，D正确。故选B。
[对点训练]1．限制酶MunⅠ和限制酶EcRⅠ的识别序列及其切割位点分别如下：—C↓AATTG—和—G↓AATTC—如图表示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程，相关叙述错误的是(　　)
A．用限制酶EcRⅠ切割目的基因，同时用限制酶MunⅠ切割质粒B．两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对C．限制酶能使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开D．将重组质粒同时用2种限制酶切割会形成2种DNA片段
解析:由图可知，目的基因两侧都是限制酶EcRⅠ的切割位点，因此应选用限制酶EcRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子，质粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcRⅠ的切割位点，但EcRⅠ的切割位点位于标记基因中，用其切割会破坏标记基因，因此为保证重组质粒表达载体的准确构建，应选用限制酶MunⅠ切割质粒，A正确；由题干信息给出的两种酶的识别序列可知，两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对，B正确；限制酶的作用是使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，并具有专一性，C正确；将重组质粒同时用2种限制酶切割，标记基因和目的基因中的EcRⅠ酶切割位点能被断开，则会形成3种DNA片段，D错误。故选D。
考向　基因工程载体的应用
2.下列有关基因工程中载体的说法正确的是(　　)A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
解析:在基因工程中，天然的质粒不能直接作为载体，需要进行人工改造，A错误；不是所有的质粒都可以作为基因工程中的载体，质粒用作载体的基本要求是具有一至多个限制性核酸内切酶的识别位点和具有标记基因，B错误；细菌为原核生物，没有染色体，质粒是一种独立于染色体外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴别和选择的标记基因，D正确。故选D。
[对点训练]2．下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是(　　)
A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B．基因表达载体的构建并不一定相同C．图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
解析:基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，A正确；由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，这样目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的，B正确；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，C错误。
1.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　)2.限制酶只能用于切割目的基因(　　)3.限制酶也可以识别和切割RNA(　　)4.DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来(　　) DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　　)6.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因(　　)
1.(选择性必修3 P67)基因工程：_________________________________________________________________________________________________。2.(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的　　　　　序列，并且使每一条链中特定部位的　　　　　断开。3.选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么_____________________________________________________________________________.②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？____________________________________________________________________________________
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋
予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
4.(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于　　　　　　　　。
5.选择性必修3 P72：DNA连接酶和DNA聚合酶　　(“是”“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是　　　　　　，而DNA聚合酶是把单个的　　　　　连接到已有的DNA片段上。②　　　　　起作用时需要以一条DNA链为模板，而　　　　　不需要模板。
6.不同种生物的基因能拼接的理论基础是：__________________________________________________________________________________________________________________________。7.外源基因在受体细胞内能表达的理论基础是：________________________________________________________________________________________________________。
①DNA的基本组成单位都
是四种脱氧核苷酸；②DNA分子都遵循碱基互补配对原则；③双链
DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
状的遗传物质的结构和功能单位；②遗传信息的传递都遵循中心法则；
③生物界共用一套遗传密码
8.必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶　　(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是　　　　　　，而DNA聚合酶是把单个的　　　　　连接到已有的DNA片段上。②　　　　　起作用时需要以一条DNA链为模板，而　　　　　不需要模板。
基因工程的基本操作程序
培育转基因抗虫棉的简要过程：
棉花植株(有抗虫特性)
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
1.目的基因的筛选与获取
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因，如遇生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。也可以是一些具有调控作用的因子。
非编码区 组成：编码区上游与编码区下游 功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达 启动子：RNA聚合酶结合位点 转录起始的信号 终止子：终止RNA的合成
②筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因的原因
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
对Bt基因的表达产物--对Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。
获取目的基因的常用方法有哪些?
聚合酶链式反应（PCR）扩增
目的基因的核苷酸序列未知
目的基因的核苷酸序列已知
注意：要保持基因的完整性
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因组文库：含有一种生物的全部基因。
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。
③构建基因文库来获取目的基因
提取某种生物的全部DNA
许多D一定大小的DNA片段
基因组文库的构建模式图
某种生物特定发育时期的mRNA
部分基因文库的构建模式图
与载体连接导入受体菌中储存
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
需要仪器：DNA合成仪适用目的基因类型要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知（是否需要模板：不需要模板
方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
④利用化学方法人工合成
全称：聚合酶链式反应。原理：DNA半保留复制。操作环境：体外（PCR扩增仪/PCR仪）。目的：对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。优点：可以在短时间内大量扩增目的基因。
PCR的概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
⑤利用PCR获取和扩增目的基因
以母链为模板进行碱基互补配对
知识回顾---DNA复制过程
A T C G A A T C G G T T
U A C C T T A G C C A A
解旋酶(体外用高温代替）
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
体内复制的引物为RNA单链。
一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
体外复制的引物一般为DNA单链。
缓冲液（含Mg2+)：激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
缓冲液:提供相对稳定的pH环境
复制的原料实为dNTP水解产生能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。
复制的原料实为dNTP,dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简式如下：
目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端，如此重复循环多次。 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物……。
每次循环一般可以分为变性、复性、延伸三步。
呈指数形式扩增（ n次扩增循环后，DNA数量约为2n）
a.n代后，DNA分子有_____个 b.n代后，DNA链有_____条c.第____代出现完整的目的基因 d.n代后，含引物的DNA分子有_____个e.n代后，共消耗_____个引物 f.第n代复制，消耗了______个引物g.n代后，完整的目的基因有_____个
四种脱氧核苷酸（dNTPs）
DNA在高温下变性解旋
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
2.基因表达载体的构建
①操作目的：让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
（若需要能完成自主复制，还应有复制原点）
启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
本质:一段有特殊序列结构的DNA片段位置:位于基因的上游（首端），紧挨转录的起始位点。特殊类型：诱导型启动子。诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达 。
终止子的功能：使转录在所需要的地方停下来。本质:一段有特殊序列结构的DNA片段。位置:位于基因的下游。
标记基因的作用：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的重组DNA分子细胞筛选出来。常见类型:抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
补充：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
mRNA上三个相邻的碱基
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号（编码氨基酸）
翻译的结束信号（不编码氨基酸）
含有目的基因的DNA片段
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割
带有黏性末端（或平末端）的切口
带有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段
重组DNA分子（重组质粒）
基因表达载体构建模式图
3.将目的基因（重组质粒）导入受体细胞
①将目的基因导入植物细胞—花粉管通道法
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
受体细胞：受精卵地位：我国科学家独创实例：将Bt基因导入棉花细胞
“转化”概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
农杆菌生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
①将目的基因导入植物细胞—农杆菌转化法
: 水稻、小麦、玉米…
含目的基因的重组Ti质粒
目的基因插入染色体DNA中
农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
①将目的基因导入到植物细胞中方法--基因枪法
②将目的基因导入动物细胞——显微注射法
利用显微注射将目的基因注入动物受精卵中（因为受精卵容易表现出全能性），这个受精卵将发育成具有新性状的动物。将目的基因导入动物受精卵最有效的方法。
将目的基因注射到动物受精卵中
（1）受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。 优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
（2）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
③将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
4. 目的基因的检测与鉴定
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
1.检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
(1)首先取出转基因生物的基因组DNA；
检测目的基因:DNA分子杂交
(2)将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；
(3) 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。
基因探针:简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂），且顺序已知的，与目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。
检测目的基因是否转录出了mRNA:DNA分子杂交
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
检测表达的蛋白质:抗原—抗体杂交
补充思考：在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？
饲喂害虫（抗虫接种实验）
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
考向 目的基因的获取
1.依次为EcRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体示意图，下列有关叙述正确的是(　　)
A．DNA片段被BamHⅠ、Sau3AⅠ酶切后可形成不同的黏性末端B．不能使用限制酶EcRⅠ、BamHⅠ获取目的基因C．抗生素抗性基因可用于鉴别目的基因是否表达D．使用限制酶EcRⅠ、Sau3AⅠ切割质粒可防止自身环化
解析:DNA分子被BamHⅠ、Sau3AⅠ酶切后得到的黏性末端是相同的，A错误；使用EcRⅠ和BamHⅠ获得的目的基因可整合到表达载体的启动子和终止子之间，可用二者获得目的基因，B错误；只要表达载体导入了受体细胞，受体细胞就是有抗药性，目的基因是否表达，也需要进一步鉴定，C错误；使用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割质粒，由于黏性末端不同，可防止质粒自身环化，D正确，故选D。
[对点训练]1．用XhⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述错误的是(　　)
A．图中两种酶识别的核苷酸序列不同B．图中酶切产物可用于构建重组DNAC．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
考向 基因工程的基本操作程序
2.2020年3月16日，中国科学家陈薇院士团队研制的重组新冠疫苗通过临床研究注册审评，获批进入临床试验。重组新冠疫苗的制备流程如图。回答下列问题。
(1)步骤②需要____________作为原料。步骤③需要的工具酶主要是________。(2)被用作载体的Ad5应具有的特点是________________________________ ________________________________________(答出1点即可)。
能自我复制(或有一个或多个切割位点、有标记基因位点、对受体细胞无害)
(3)步骤④是______________________。(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白作为________，刺激机体产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足的条件之一是_____(填“有”或“无”)SARS－CV－2感染史，理由是_________________________ ______________________________________________________。(5)为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，需进一步试验，请写出试验思路：_______________________________________________________ _________________________。
有SARS－CV－2感染史的志愿者血清中存在一定量的相应抗体，会对试验结果产生干扰
给不同组志愿者分别注射不同剂量的疫苗，一段时间后采集血样并检测相应抗体的水平
解析:(1)步骤②为逆转录过程，合成的产物是cDNA，因此需要脱氧核苷酸作为原料。步骤③为利用PCR技术扩增获得S蛋白基因的过程，该过程需要的酶是Taq酶(耐高温的DNA聚合酶)。(2)Ad5作为载体应具有的特点是能自我复制、有多个限制酶切割位点、有标记基因、在宿主细胞中可以存活并表达、对宿主细胞无害等。(3)步骤④为构建目的基因表达载体的过程，即重组新冠疫苗的过程。(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白可作为抗原，刺激机体产生特异性免疫过程，使机体免疫系统产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足无SARS－CV－2感染史的条件，即未感染过新冠病毒的志愿者，因为感染过新冠病毒的人体内含有相应的记忆细胞，若注射疫苗，则会出现二次免疫的特征，即体内的记忆细胞会迅速增殖分化，产生大量的浆细胞，浆细胞合成并分泌大量的抗体，从而导致无法检测出该疫苗的真正效果。(5)实验目的为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，根据实验目的可知，该实验的自变量为疫苗的注射剂量，因变量为抗体产生量，因此设计实验如下：将同性别且年龄相当的志愿者随机分成若干组，然后给不同组别的志愿者注射不同剂量的疫苗，一段时间之后，检测志愿者体内的抗体产生量，作好记录并进行比较、分析，从而得出结论。
[对点训练]2．通过把编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌细胞中，使之充分表达，再经纯化可制得乙型肝炎疫苗。回答下列问题：(1)人体接种乙型肝炎疫苗后，该疫苗可作为________刺激机体发生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗先后需要接种多次，其目的是__________________ ________________。(2)如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，则可以推测出相应目的基因的核苷酸序列，但推测出的目的基因核苷酸序列并不是唯一的，其原因是________________________________________________________________ _______。
使人体产生更多的抗体和记忆细胞
决定氨基酸的密码子具有简并性(或决定一种氨基酸的密码子往往不是只有一种)
[对点训练]2．通过把编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌细胞中，使之充分表达，再经纯化可制得乙型肝炎疫苗。回答下列问题：(3)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞之前需要构建基因表达载体，这一过程中需要的工具酶主要有___________________。构建的基因表达载体中，编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因应该位于____________之间。(4)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞时，使该基因在酵母菌细胞中得以稳定遗传的关键是____________________________________ _______________________________。
确保编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上
解析:(1)乙型肝炎疫苗可作为抗原引起人体产生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗需先后接种多次的目的是使人体产生更多的抗体和记忆细胞，以发挥最大的免疫效果。(2)由于mRNA上的密码子具有简并性，根据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA的核苷酸序列不是唯一的，所以推测出的基因的核苷酸序列不是唯一的。(3)在构建基因表达载体过程中，需要用限制酶切割目的基因片段与载体，再用DNA连接酶把目的基因与载体连接起来。构建的基因表达载体中，启动子和终止子分别是基因表达中转录起始和终止的调控序列，目的基因需要插在启动子和终止子之间。(4)真核细胞分裂时细胞质DNA随机分配，应将目的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上，以确保目的基因在酵母菌细胞中稳定遗传。
1.目的基因就是指编码蛋白质的基因(　　)2.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物(　　)3.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(　　)4.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达(　　)5.应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达(　　)
1.选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈　　，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
2.(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供　　　　　、　　　　、4种　　　　　和耐高温的　　　　　。
3.(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有　　　　　　　等。4.(选择性必修3 P81)转化：__________________________________________________________。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内
构建基因表达载体的目的是___________________________________________________________________________________________。一个基因表达载体的组成包括_____________________________ 等。图中抗生素抗性基因的作用是_____ ， 。
胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用
目的基因、启动子、终止子及标记
便于重组DNA分子的筛选
7.择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈　　，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
提取生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
实验设计思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
1、DNA的粗提取与鉴定
（1）利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。（2）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
鉴定原理 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是，选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
供选材料：新鲜洋葱（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、、猕猴桃（58）；猪肝（38）、鱼卵、鸡血（78）、哺乳动物的成熟红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌（1）（括号内为染色体条数）
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑;选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
思考：能否选用新鲜的猪血作为提取DNA的材料？
取材、研磨:称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。(1)研磨的目的 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中(2)研磨时间不宜太长 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶 研磨效果好（有利于充分研磨）(4)研磨不宜太用力
过滤或离心取上清液：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 可能含有核蛋白、多糖等杂质②低温放置几分钟的作用 可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； 抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； 低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；
预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。(1)搅拌时应轻缓、并沿一个方向 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子(2)酒精预冷的作用:同“低温放置的作用”
NaCl溶液溶解DNA并鉴定 取两支20mL的试管，各加入2ml/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
加入2ml/L氯化钠溶液
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验原理①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷。
梳子孔为加样孔，加样孔侧连电极负极。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
注意事项　(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 (2)每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
考向　DNA的粗提取与鉴定
1.如图是“DNA粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，相关叙述错误的是(　　)
A．图1中溶液a是0.14 ml·L－1的NaCl溶液B．图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶C．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显D．图2试管1的作用是证明2 ml·L－1NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色
解析：图1中溶液a是2 ml·L－1的NaCl溶液，A错误；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶，B正确；图2所示实验操作中有一处明显错误(试管2中未将DNA溶于2 ml·L－1的NaCl溶液中)，可能导致试管2中蓝色变化不明显，C正确；图2试管1的作用是证明2 ml·L－1 NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，D正确。故选A。
[对点训练]1．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？_____________________。(3)在沸水浴中加热的目的是_____________，同时说明DNA对高温有较强的________。(4)A试管在实验中的作用______。(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________有关。
DNA在沸水浴的情况下与二苯胺反应呈现蓝色
加入试管中的DNA(丝状物)的多少
解析：与A试管相比，B试管中含DNA丝状物，其他条件均完全相同，A、B两试管形成对照。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，待试管冷却后，再比较两支试管中溶液颜色的变化。
考向 　DNA片段的扩增及电泳鉴定
2.下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是(　　)A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B．PCR利用了DNA的热变性原理C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
解析:为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌，A正确；PCR利用了DNA的热变性原理，B正确；缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存，使用前，将所需试剂从冰箱取出，放在冰块上缓慢融化，C错误；在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，以免其他成分的污染，D正确。
[对点训练]2．以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是(　　)
A．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温B．催化①过程的酶是RNA聚合酶C．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合D．如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
解析:题图中②⑤过程均为DNA的复制，这两个过程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤过程进行的温度是70～75 ℃，因此催化该过程的DNA聚合酶要能耐高温，但催化②过程的酶不需要耐高温，A错误；①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化，B错误；④为复性过程，该过程两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，C正确；DNA分子中不含碱基U，D错误。
1.在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色(　　)2.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精(　　)3.进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存(　　)4.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关(　　)5.为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换(　　)
(源于选择性必修3 P74)下图为“DNA粗提取与鉴定”实验的相关操作，请根据图示分析其操作的目的是什么？
①析出DNA，除去溶于酒精的杂质；②使DNA溶解在2 ml·L－1NaCl溶液中。
1．(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E·cli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E·cli DNA连接酶连接。上图中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________________________________________________________________________。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能______________；质粒DNA分子上有____________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是________________________________________________________________________。(4)表达载体含有启动子，启动子是指________________________________。
[答案]　(1)EcRⅠ、PstⅠ　EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcRⅤ(2)磷酸二酯键(3)自我复制　一至多个限制酶切位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
解析：(1)限制酶EcRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcRⅤ切割形成的是平末端，E·cli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E·cli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
2．(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是______________(用数字序号表示)。(2)操作③中使用的酶是________________，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、____________三步，其中复性的结果是__________________________________________________________________________________________。(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与__________________特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指________________________________________________________________________。
[答案]　(1)④②③①(2)Taq酶(热稳定DNA聚合酶)　延伸　Taq酶从引物起始进行互补链的合成(3)两条单链DNA(4)一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
解析：(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。(2)在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶(热稳定DNA聚合酶)，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物起始进行互补链的合成。(3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。(4)据分析可知，PCR(多聚酶链式反应)技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
3．(2021·河北卷)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。回答下列问题：(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为________。(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是______________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是________________________________________________________________________。(3)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是________________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是________________________________________________。(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的________(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
[答案]　(1)基因组文库(2)限制酶和DNA连接酶　便于目的基因的筛选和鉴定(3)农杆菌转化法　避免目的基因在自然界中的扩散(4)耐性　茎叶(5)YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水　杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是______________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于____________________________________(写出两点即可)。
解析：(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。(3)农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T－DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。(4)根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。(5)YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
4．(2020·山东卷)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________________。(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________________________。(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是__________________________________________________________。(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为__________，原因是______________________________________________________________。
[答案]　(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶　转化(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子(3)逆转录(或：反转录)　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强