2024届人教版高中生物一轮复习发酵工程学案（不定项）

这是一份2024届人教版高中生物一轮复习发酵工程学案（不定项），共31页。
第32讲　发酵工程
[课标要求]　1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。6.举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的。7.阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品。8.举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。

考点一　微生物的基本培养技术

1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)培养基的种类、特点及其用途
划分标准
种类
特点
用途
物理
性质
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
半固体培养基
加凝固剂，如琼脂
观察微生物的运动
固体培养基
微生物的分离、鉴定、活菌计数
化学
成分
天然培养基
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成
培养基
培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质制备)
微生物的分类、鉴定
用途
选择
培养基
允许特定种类微生物生长、同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
富集、分离出特定的微生物(如培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌时，可在培养基中加入高浓度的食盐)
鉴别
培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物(如用伊红美蓝培养基鉴别饮用水中是否有大肠杆菌。若菌落呈紫黑色并带有金属光泽，说明有大肠杆菌)
(3)培养基营养成分的含义、作用及主要来源
成分
含义
作用
主要来源
碳源
提供碳元素的物质
构成生物体细胞的物质和一些代谢物，有些也是异养生物的能源物质
无机碳源：CO2、NaHCO3等；
有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油、牛肉膏、蛋白胨等
氮源
提供氮元素的物质
合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢物
无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源；尿素、牛肉膏、蛋白胨
无机盐
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素
是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源，酶的激活剂等
无机化合物
水
生物体内含量很高的无机物
不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定
从外界摄入
2.无菌技术
(1)含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)常用方法

(3)常见物品的消毒或灭菌方法
①消毒方法及适用对象

②灭菌方法及适用对象

3．微生物的纯培养
(1)微生物纯培养的操作步骤

(2)倒平板操作方法

①倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。
②乙中的灭菌方法是灼烧灭菌。
③丁操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。
(3)倒平板操作的注意事项

(4)平板划线法操作步骤

(5)平板划线法的注意事项

(6)每次灼烧的目的
项目
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
【易错辨析】
(1)微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。(√)
(2)在培养霉菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性。(×)
(3)获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。(√)
(4)为了避免周围环境中微生物的污染，接种过程中许多操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。(√)
(5)由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。获得纯培养物的过程就是纯培养。(√)
(6)倒平板过程中，将培养基倒入培养皿并盖上皿盖后，立即将培养皿倒置。(×)
(7)培养酵母菌时，可将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入适宜温度的恒温培养箱中培养24～48 h。(√)
【长句应答】
1．为什么培养基需要氮源？
提示：微生物细胞内有蛋白质、核酸、磷脂等多种含氮的营养物质或代谢产物，培养基中的氮源可以作为合成这些营养物质及代谢产物的原料。
2．无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
提示：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
3．平板划线时最后一次划线为何不能与第一次划线相连？
提示：最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连，则增加了细菌数目，得不到纯化的效果。

考向一　培养基与无菌技术
1．(2022·吕梁高三月考)有关培养基配制原则的表述正确的是(　　)
A．任何培养基都必须含有碳源、氮源、矿质元素、水以及无机盐
B．碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素
C．有的培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求
D．营养物质的浓度越高越好
解析：选C　培养基一般都含有碳源、氮源、无机盐和水等营养物质，而分离自生固氮菌的培养基中，不需要加入氮源，A错误；碳源和氮源必须具有一定比例，但碳元素的含量不一定最多，自养型微生物的培养基不需要加入碳源，B错误；营养物质的浓度过高可能会造成微生物渗透失水死亡，D错误。
2．(2022·湖南名校联考)微生物培养过程中，要重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，正确的是(　　)
A．煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以杀死全部微生物的细胞和芽孢、孢子
B．将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌
C．加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
D．家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌
解析：选B　煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢，而灭菌能杀灭环境中一切微生物，包括孢子和芽孢，A错误；加入培养基中的指示剂和染料也需要灭菌，C错误；家庭制作葡萄酒时，要将容器进行灭菌或消毒，但是葡萄不能灭菌，因为发酵用的酵母菌来自葡萄，D错误。
考向二　微生物的纯培养
3．(2022·泰安期末)下图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是(　　)

A．对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌处理
B．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
C．步骤②应多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D．步骤③划线结束后在培养皿盖上做好标注
解析：选C　图中①是倒平板，②是进行平板划线，③是培养。对实验操作的空间、操作者的衣着和手需要进行消毒处理，A错误；倒完平板后立即盖上培养皿盖，待培养基冷却凝固后将平板倒过来放置，B错误；步骤②应多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落，C正确；图中操作结束后需在培养皿底标注菌种及接种日期等信息，而不是在培养皿盖上做标注，D错误。
4．(2022·广东卷)研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1 146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。

回答下列问题：
(1)研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28 ℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用________________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________________为碳源时生长状况最好。
(2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是________________________________________________________。(答一点即可)
(3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是________________。
(4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有________________。
解析　(1)培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析题图可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。(2)深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)，故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。(3)拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。(4)深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。
答案　(1)高压蒸汽灭菌　平板划线　纤维素
(2)某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)
(3)拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行　(4)耐低温
考点二　微生物的选择培养和计数

1．微生物的选择培养
(1)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
(2)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养。
①系列稀释操作
取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。

②涂布平板操作
序号
图示
操作
1

取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面
2


3

将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，冷却8～10 s
4

用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液涂布均匀
③培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
2．微生物的数量测定
(1)利用稀释涂布平板法计数(活菌计数)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计数标准：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300、适于计数的平板计数，并且在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，并求平均值。
③用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
(2)显微镜直接计数法

3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理

(2)分离流程

(3)实验结果分析与评价

【易错辨析】
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。(×)
(2)尿素在脲酶的催化作用下分解成无机物。(√)
(3)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。(×)
(4)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。(√)
(5)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。(×)
【长句应答】
1．统计某一稀释度下平板上的菌落数的要求是统计3个菌落数在30～300之间的平板，计算菌落数的平均值。
2．在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。

1．两种纯化方法的比较
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
分离结果


关键操作
接种环在固体培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释②涂布平板操作
接种用具
接种环
涂布器
优点
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
可以计数，可以观察菌落特征
缺点
不能计数
操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同点
都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
2.两种微生物计数方法的比较
项目
间接计数法(稀释涂布平板法)
直接计数法(显微镜计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝×M[C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数]
每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活　
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
3.微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落
挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择
培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定
培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物
(2)微生物的鉴别方法
菌落特征
鉴别法
根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂
鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色
鉴别法
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物
4.微生物的分离与计数实验中对照组和重复组的设置及作用
(1)两种对照组的设置及作用
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置至少3个平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。

考向一　微生物的选择培养
1．稀释涂布平板法是分离菌种常用的方法，下列相关叙述不恰当的是(　　)
A．固体培养基灭菌后，应冷却至50 ℃左右时倒平板
B．倒好的平板需立即使用，以免表面干燥，影响菌的生长
C．稀释涂布平板分离到的单菌落需进一步划线纯化
D．稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数
解析：选B　培养基灭菌后需要冷却至50 ℃左右时才能用来倒平板，避免温度过高，A正确；倒好的平板需要放置一段时间，用以观察培养基是否被杂菌污染，B错误；稀释涂布平板法分离的单菌落需要用平板划线法进行纯化培养，C正确；稀释涂布平板法可以计数，也可观察菌落特征进行菌种分离，D正确。
2．(2020·全国Ⅰ卷)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。

回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是________________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即________________。
解析　(1)常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶，乙为固体培养基，故需要加入Y琼脂；甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株，故均属于选择培养基。(2)若要在每个平板上涂布100 μL稀释液后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，则摇瓶M中的菌液稀释的倍数至少为2×107÷1 000×100÷200＝1×104倍。(3)当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。(4)要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。(5)甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源。
答案　(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐
考向二　微生物的分离和计数
3．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是(　　)

A．3号试管中的菌落稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×107个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
解析：选B　2号试管中的菌落稀释倍数为103倍，A错误；4号试管的稀释倍数为105倍，5号试管的稀释倍数为106倍，因此4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍，B正确；5号试管的稀释倍数为106倍，每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109个，C错误；稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D错误。
4．(2022·全国甲卷)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成____________________(答出2种即可)等生物大分子。
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是________。
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是__________________________________________________________
________________________________________________________________________。
菌株
透明圈大小
平板Ⅰ
平板Ⅱ
A
＋＋＋
＋＋
B
＋＋
－
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是________，理由是_______________________________________________________。
解析　(1)石油中含有含碳有机物，可以作为碳源。菌体内的含氮生物大分子有蛋白质和核酸。(2)在资源和空间不受限制的阶段，细菌呈“J”型增长。若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后A细菌的数量是N0·2n。(3)由题表可知，A菌株降解石油的能力比B菌株强，形成的透明圈比B菌株的大，且A菌株可以固氮，在培养基中不添加氮源的情况下也可以生长繁殖，产生透明圈；B菌株不能固氮，在培养基中不添加氮源的情况下不能生长繁殖，不能产生透明圈，可据此设计实验。(4)据表格信息可知，菌株A在无NH4NO3的培养基上可以生长繁殖，而菌株B在无NH4NO3的培养基上不能生长繁殖，因此对于贫氮且被石油污染的土壤来说，治理石油污染应该选用菌株A。
答案　(1)石油　DNA、RNA和蛋白质　(2)N0·2n　(3)在平板Ⅰ和平板Ⅱ的甲孔中均滴加A菌液，在平板Ⅰ和平板Ⅱ的乙孔中均滴加等量的B菌液，培养相同时间，观察透明圈大小(，分解石油的能力越强，透明圈越大)　(4)菌株A　菌株A在无NH4NO3的培养基上可以生长繁殖，而菌株B在无NH4NO3的培养基上不能生长繁殖，且菌株A分解石油的能力较强(合理即可)
考点三　传统发酵技术及发酵工程的应用

一、发酵与传统发酵技术
1．发酵的概念：是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
2．传统发酵技术

二、制作传统发酵食品
1．制作腐乳
(1)原理：蛋白质小分子的肽和氨基酸。
脂肪甘油和脂肪酸。
(2)腐乳制作过程中参与的微生物：毛霉是一种丝状真菌，其繁殖方式为孢子生殖，代谢类型是异养需氧型。
2．制作泡菜
(1)菌种来源：植物体表面天然的乳酸菌。
(2)制作原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。
反应式：C6H12O62C3H6O3(乳酸)＋能量。
(3)制作流程

3．制作果酒和果醋
(1)制作原理与发酵条件
项目
制作果酒
制作果醋
发酵菌种
酵母菌
醋酸菌
代谢类型
异养兼性厌氧型
异养需氧型
发酵过程
有氧条件下，酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖：
C6H12O6＋6H2O＋6O26CO2＋12H2O＋能量；
无氧条件下，酵母菌通过无氧呼吸产生酒精：
C6H12O62C2H5OH＋2CO2＋能量
O2、糖源充足时：
C6H12O6＋2O22CH3COOH＋2CO2＋2H2O＋能量；
O2充足、缺少糖源时：　
C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O＋能量
发酵温度
18～30 ℃
30～35 ℃
发酵时间
10～12天
7～8天
对氧的需求
前期需氧，后期不需氧
一直需氧
产物检测
闻气味、品尝、酸性条件下的重铬酸钾(橙色→灰绿色)
酸碱指示剂(pH试纸)、闻气味、品尝
(2)发酵过程及注意事项
①器具的清洗、消毒：发酵瓶、榨汁机要用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用。
②材料的选择和处理：选择新鲜的葡萄，先用清水冲洗1～2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干。
③榨汁装瓶：用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶中，要留大约1/3的空间，盖好瓶盖。
④酒精发酵：将温度控制在30～35 ℃，每隔12 h左右将瓶盖拧松一次，发酵时间为10～12 d，可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行监测。
⑤醋酸发酵：当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。温度严格控制在30～35 ℃，时间为7～8 d。
三、发酵工程及其应用
1．发酵工程的概念：利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
2．发酵工程的基本环节

【易错辨析】
(1)泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件。(×)
(2)酵母菌是嗜温菌，所以果酒发酵所需的最适温度高于果醋发酵温度。(√)
(3)用诱变育种、细胞工程、基因工程等方法选育出性状优良的工程菌并进行扩大培养。(×)
(4)根据工程菌所需的营养精确地配制出合成培养基并进行严格的灭菌处理。(√)
(5)发酵工程中一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。因此培养基和发酵设备都必须经过严格的消毒。(×)
(6)啤酒的发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段。酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在后发酵阶段完成。(×)
【长句应答】
1．乳酸菌是厌氧菌，发酵时需控制严格的无氧环境。尝试说出泡菜制作过程中制造无氧环境的措施。
提示：①选择气密性好的泡菜坛。②盐水煮沸后冷却待用。③装坛时压实，盐水没过全部菜料。④盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满清水；发酵期间不宜开盖，并注意在发酵过程中经常向水槽中补水。
2．在制作果酒的过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？
提示：制作果酒的过程中，除酵母菌之外，还会有其他杂菌生长，它们会在酒精发酵中污染发酵液，而避免发酵液污染需要从发酵制作的过程全面考虑。例如，榨汁机、发酵瓶要清洗干净，装入葡萄汁后，封闭充气口；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。
3．某生产谷氨酸的发酵装置，在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸，但在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N­乙酰谷氨酰胺，由此可知环境条件不仅影响微生物的生长繁殖，而且也会影响微生物的代谢物的形成。

1．泡菜腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐相对含量(或数量)的变化

2．制作果酒和果醋过程中产量低的原因
(1)果酒制作中产生的酒精少：①发酵前期酵母菌有氧呼吸不足，酵母菌数量少；②发酵后期密封不严，酵母菌发酵受抑制。
(2)果醋制作中产生醋酸少：发酵过程中供氧不足所致。
3．发酵工程的特点


考向一　泡菜的制作
1．(2022·江苏百校联考)有关泡菜中亚硝酸盐含量的研究表明，亚硝酸盐的含量高低和亚硝酸盐含量峰值时间的早晚与食盐的浓度有关(见下图)，下列有关叙述不正确的是(　　)

A．食盐的浓度越高，亚硝酸盐生成快。亚硝酸盐含量峰值出现的早
B．取食泡菜时，时间别太长，防止空气进入
C．臭味的产生可能与取食过程中带入坛内油脂类物质有关
D．所用的食盐水经煮沸后可除去水中的氧气并杀灭杂菌
解析：选A　从图中可以看出，亚硝酸盐含量上升最快的是食盐浓度为5%时，其峰值出现最早，当食盐浓度上升到7%，亚硝酸盐含量上升相对较慢，A错误；泡菜的制作原理是利用乳酸菌在无氧条件下进行乳酸发酵，所以取食泡菜时，时间别太长，防止空气进入，对乳酸菌有抑制作用，B正确；如果在取食过程中混入油脂，可能会破坏发酵过程，使泡菜出现臭味，C正确；泡菜制作过程中，所用的食盐水经煮沸后可除去水中的氧气并杀灭杂菌，D正确。
2．(2023·天津模拟)泡菜发酵的微生物主要是乳酸菌，而在发酵初期，水槽内经常有气泡产生，这些气泡产生的原因及成分分别是(　　)
A．乳酸菌是兼性厌氧型微生物，初期进行有氧呼吸产生气体；为CO2
B．因腌制过程中的盐进入蔬菜使蔬菜体积缩小，气体被排出；为空气
C．发酵初期活动强烈的是酵母菌，其利用氧气进行呼吸作用产生气体；为CO2
D．乳酸菌在发酵过程中产生了热量，使坛内温度升高，气体受热膨胀排出；为空气
解析：选C　乳酸菌是厌氧型微生物，进行无氧呼吸产生乳酸，A错误；泡菜发酵初期有气泡产生，主要是需氧菌如酵母菌进行有氧呼吸产生了CO2，C正确；B、D错误。
考向二　果酒和果醋的制作
3．(2021·山东卷)葡萄酒的制作离不开酵母菌。下列说法错误的是(　　)
A．无氧条件下酵母菌能存活但不能大量繁殖
B．自然发酵制作葡萄酒时起主要作用的菌是野生型酵母菌
C．葡萄酒颜色是葡萄皮中的色素进入发酵液形成的
D．制作过程中随着发酵的进行发酵液中糖含量增加
解析：选D　酵母菌进行有氧呼吸获得能量大量繁殖，无氧条件下，发酵产生酒精，故无氧条件下酵母菌能进行无氧呼吸存活但不能大量繁殖，A正确；自然发酵制作葡萄酒时起主要作用的菌是葡萄皮上的野生型酵母菌，B正确；葡萄皮中的色素进入发酵液使葡萄酒呈现颜色，C正确；制作过程中随着发酵的进行发酵液中糖含量减少，D错误。
4．(2021·辽宁卷)利用菠萝蜜制作果醋的大致流程为先在灭菌的果肉匀浆中接种酵母菌，发酵6天后，再接入活化的醋酸杆菌，发酵5天。下列有关叙述错误的是(　　)
A．乙醇既是醋酸发酵的底物，又可以抑制杂菌繁殖
B．酵母菌和醋酸杆菌均以有丝分裂的方式进行增殖
C．酵母菌和醋酸杆菌发酵过程中控制通气的情况不同
D．接入醋酸杆菌后，应适当升高发酵温度
解析：选B　当缺少糖源时，醋酸杆菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，同时乙醇还可以抑制杂菌繁殖，A正确；酵母菌一般以出芽的方式繁殖，醋酸杆菌以二分裂的方式进行增殖，B错误；酵母菌发酵过程中先通气使其大量繁殖，再密闭发酵产生乙醇；醋酸杆菌为好氧菌，需持续通入无菌氧气，C正确；酵母菌适宜温度是18～30 ℃，醋酸杆菌最适温度为30～35 ℃，D正确。
考向三　发酵工程及应用
5．(2022·青岛一模)高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图1所示。将得到的菌悬液转接于同时含有葡萄糖和淀粉作碳源的固体培养基上培养，得到若干菌落后用碘液作显色处理，看到如图2所示情况。下列选项不正确的是(　　)

A．过程①②合称为稀释涂布平板法
B．甲、乙试管中的液体均为选择培养基
C．Ⅱ号培养基上的接种方法为平板划线法
D．图2中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种
解析：选B　据Ⅰ号培养基上菌落分布均匀，可知①②过程为稀释涂布平板法，A正确；甲、乙试管中的液体用于样品稀释，应为无菌水，B错误；由Ⅱ号培养基上的划线可知，Ⅱ号培养基上的接种方法是平板划线法，C正确；淀粉与碘液反应呈蓝色，能产淀粉酶的菌落可将周围的淀粉水解，因此周围不显蓝色的菌落含有所需菌种，D正确。
6．(2021·广东卷)中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜(甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖)为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。

回答下列问题：
(1)为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为________，并不断提高其浓度，经多次传代培养(指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养)以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用________的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有________等。(答出两种方法即可)
(2)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是________。(答出两点即可)
(3)研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中________可能是高密度培养的限制因素。
(4)菌株H还能通过分解餐厨垃圾(主要含蛋白质、淀粉、油脂等)来生产PHA，说明其能分泌________。
解析　(1)根据题意分析，该实验的目的是提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，结合微生物的代谢需求，其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源。并不断提高其浓度，经多次传代培养(指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养)以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用血细胞计数板计数的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有诱变育种、基因工程育种等。(2)已知，菌株H具有嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，因此当培养基盐浓度为60 g/L，pH为10时，菌株H可正常持续发酵60 d以上，而盐浓度为60 g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制，故该系统不需要灭菌。(3)分析题意，扩大培养时，营养物浓度、温度、pH等条件下适宜，而发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中氧气不足，使菌种进行无氧呼吸产生乙醇，即氧气(O2或溶解氧)是限制高密度培养的重要因素。(4)根据酶的专一性可知，菌株H之所以能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产PHA，说明其能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
答案　(1)唯一碳源　血细胞计数板计数　诱变育种、基因工程育种　(2)盐浓度为60 g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
(3)氧气(O2或溶解氧)　(4)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等

优秀传统文化

中国传统发酵源远流长，关于酒的传说和诗句不计其数。
(1)松花酿酒，春水煎茶。(出自元代张可久的《人月圆·山中书事》)。
(2)莫笑农家腊酒浑，丰年留客足鸡豚。(出自宋代陆游的《游山西村》)。
(3)绿酒初尝人易醉。一枕小窗浓睡。(出自宋代晏殊的《清平乐·金风细细》)。
(4)更待菊黄家酝熟，共君一醉一陶然。(出自唐代白居易的《与梦得沽酒闲饮且约后期》)……

[典例]　(2020·山东卷)我国的酿酒技术历史悠久，古人在实际生产中积累了很多经验。《齐民要术》记载：将蒸熟的米和酒曲混合前需“浸曲发，如鱼眼汤，净淘米八斗，炊作饭，舒令极冷”。意思是将酒曲浸到活化，冒出鱼眼大小的气泡，把八斗米淘净，蒸熟，摊开冷透。下列说法错误的是(　　)
A．“浸曲发”过程中酒曲中的微生物代谢加快
B．“鱼眼汤”现象是微生物呼吸作用产生的CO2释放形成的
C．“净淘米”是为消除杂菌对酿酒过程的影响而采取的主要措施
D．“舒令极冷”的目的是防止蒸熟的米温度过高导致酒曲中的微生物死亡
[思维建模]
题干
信息
信息1
浸曲发，为酒曲浸泡活化，酵母菌代谢加快
信息2
鱼眼汤，为冒出鱼眼大小的气泡，来自酵母菌细胞呼吸
素养
指引
生命观念
“舒令极冷”是将蒸熟的米摊开冷透，防止蒸熟的米温度过高使酒曲中的微生物死亡
科学
思维
酿酒过程中酵母菌利用葡萄糖等糖类进行无氧呼吸产生酒精，产生的酒精会抑制其他微生物的生长
思维
误区
误区：误认为“净淘米”仅仅是为去除米中的泥土，“净淘米”还可以防止一些杂质影响酒的品质
切记：①细胞中自由水含量越高，细胞代谢越旺盛；②应该先煮沸大米，利用高温杀灭杂菌，冷却后再加酒曲，防止高温杀死目的菌株
解析：选C　“浸曲发”是将酵母菌活化，可以使微生物代谢加快，A正确；“鱼眼汤”是指酵母菌在呼吸过程中产生CO2，使溶液中出现气泡，B正确；在做酒过程中，为消除杂菌的影响主要靠“炊作饭”，即蒸熟，C错误；“舒令极冷”是将米饭摊开冷透，防止温度过高导致微生物(酵母菌死亡)，D正确。

1．《书经》中的“若作酒醴，尔惟曲糵”提到酿酒必须要用酒曲。酒曲是以谷物为原料，破碎加水压制而成，富含多种微生物，经水浸泡后投入蒸熟的米即可用于酿酒。下列相关叙述正确的是(　　)
A．酒曲中富含酵母菌等多种微生物，可将糖彻底分解成酒精
B．将米蒸熟后应立即加入酒曲进行发酵，可防止杂菌污染
C．酒曲与蒸熟的米混合后需隔绝空气，为发酵提供无氧环境
D．向发酵罐中加入酸性重铬酸钾，检测是否有酒精产生
解析：选C　酒曲中富含酵母菌等多种微生物，可将糖分解成酒精，糖彻底分解的产物是CO2和水，A错误；蒸熟之后，用凉开水将糯米饭冲淋一次，冷却到30 ℃，再加入酒曲进行发酵，将米蒸熟后立即加入酒曲会导致微生物死亡，B错误；酒曲与蒸熟的米混合后需隔绝空气，为发酵提供无氧环境，因为氧气会抑制酒精发酵，C正确；应该是从发酵罐中取样后，在样本中加入酸性重铬酸钾，检测是否有酒精产生，D错误。
2．(2021·武汉模拟)中国酸菜历史悠久，早在北魏的《齐民要术》中就记载了用白菜等原料腌制酸菜的多种方法。酸菜不仅口感好，而且对人体有益。下列说法正确的是(　　)
A．腌制前，所用到的接种工具、培养基以及蔬菜均需灭菌处理
B．腌制过程中，酸菜坛中的水分会增多
C．真空包装的酸菜“胀袋”是由乳酸菌大量繁殖导致
D．酸菜腌制的时间越长，其口味越好，营养价值也越高
解析：选B　蔬菜不需要灭菌，A错误；腌制过程中，外界溶液浓度高会使蔬菜细胞渗透失水，导致坛中水分增多，B正确；乳酸菌无氧呼吸不产生CO2，真空包装的酸菜可能会因杂菌污染而发生“胀袋”，C错误；酸菜制作过程中会产生亚硝酸盐，随着腌制时间的变长，容易滋生杂菌，故并不是腌制时间越长，口感越好，营养价值越高，D错误。
3．《齐民要术》记载：“酒冷沸止，米有不消者，便是曲势尽。”意思是瓮中酒液凉了不再起泡，米有未消耗完的，就是酒曲的力量用尽了。下列叙述错误的是(　　)
A．用酒曲酿酒是利用了微生物细胞呼吸的原理
B．酒液温度的变化与酒曲中微生物细胞呼吸释放热量有关
C．起泡是由于微生物进行细胞呼吸产生的CO2释放形成的
D．“曲势尽”可能是瓮中液体pH升高、酒精浓度过高导致
解析：选D　用酒曲酿酒是利用了微生物细胞呼吸的原理，A正确；由于微生物细胞呼吸会产热，故会导致酒液温度产生变化，B正确；起泡是由于微生物进行细胞呼吸产生的CO2释放形成的，C正确；微生物细胞呼吸产生CO2，导致瓮中液体pH降低，D错误。

1．(2022·湖北卷)关于白酒、啤酒和果酒的生产，下列叙述错误的是(　　)
A．在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气
B．白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程
C．葡萄糖转化为乙醇所需的酶既存在于细胞质基质，也存在于线粒体
D．生产白酒、啤酒和果酒的原材料不同，但发酵过程中起主要作用的都是酵母菌
解析：选C　在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气，让酵母菌大量繁殖，再进行酒精发酵，A正确；白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程，如发酵初期酵母菌大量繁殖，B正确；酒精发酵利用的菌种是酵母菌，葡萄糖转化为乙醇所需的酶存在于细胞质基质，不存在线粒体中，C错误，D正确。
2．(不定项)(2022·山东卷)啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法正确的是(　　)
A．用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α­淀粉酶
B．焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C．糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D．通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
解析：选ACD　赤霉素能促进种子的萌发，据此可推测若用赤霉素处理大麦，可诱导α­淀粉酶相关基因的表达，促进α­淀粉酶的合成，进而使大麦种子无须发芽就能产生α­淀粉酶，A正确；焙烤可以杀死大麦种子的胚，但不使淀粉酶失活，没有进行灭菌，B错误；糖浆经蒸煮(产生风味组分、终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌)、冷却后再接种酵母菌进行发酵，防止高温杀死菌种，C正确；转基因技术已被用来减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期，属于转基因技术在微生物领域的应用，D正确。
3．(2022·海南卷)为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是(　　)
A．采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本
B．培养细菌时，可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基
C．土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落
D．鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法
解析：选C　采集植物园中土壤样本的原则之一是要随机采样，A正确；牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有细菌生长所需的碳源、氮源、水、无机盐等，可用于细菌的培养，B正确；土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的菌体分散开，有助于在培养基表面形成的单菌落，C错误；不同种类细菌的理化特性一般不同，鉴定细菌种类时，除根据菌落特征进行形态学鉴定外，还可以借助生物化学的方法进行鉴定，D正确。
4．(2022·山东卷)青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是(　　)
A．发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B．可用深层通气液体发酵技术提高产量
C．选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D．青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
解析：选D　青霉菌处于葡萄糖浓度不足的环境中会通过分泌青霉素杀死细菌；提供相同含量的碳源，葡萄糖溶液单位体积中溶质微粒较多，会导致细胞失水，发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，乳糖是二糖，可被水解为半乳糖和葡萄糖，是青霉菌生长的最佳碳源，可以被青霉菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，A正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确；为了防止细菌、其他真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍需严格灭菌，D错误。
5．(2022·全国乙卷)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源
细胞干重(g/L)
S产量(g/L)
葡萄糖
3.12
0.15
淀粉
0.01
0.00
制糖废液
2.30
0.18
回答下列问题。
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所用的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出2点即可)。
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是_______；用菌株C生产S的最适碳源是_______。菌株C的生长除需要碳源外，还需要_______________________________________
________________________________________________________________________(答出2点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是_____________________ ___________________________________________________________________________________________________________________。
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：_______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是______________________________
________________________________________________________________________(答出1点即可)。
解析　(1)在实验室培养微生物时，对玻璃器皿进行灭菌的方法有干热灭菌和高压蒸汽灭菌等。(2)由实验结果可知，以葡萄糖作为碳源时，细胞干重最高，最有利于菌株C生长；而以制糖废液作为碳源时，S产量最高，此时更有利于生产S。微生物生长所需的营养物质除碳源外，一般还包括水、氮源和无机盐等。(3)碳源为淀粉时菌株C不能生长，可能是因为菌株C缺乏能分解淀粉的酶，不能分解利用淀粉。(4)若要进一步确定生产S的最适制糖废液浓度，可分别向一系列含有不同浓度制糖废液的培养基中接种等量且适量的菌株C，放在相同且适宜的条件下培养，一段时间后检测培养液中S的含量。(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，减少环境污染。
答案　(1)干热灭菌和高压蒸汽灭菌　(2)葡萄糖　制糖废液　水、氮源、无机盐(答出2点)　(3)菌株C缺乏能分解淀粉的酶，不能分解利用淀粉　(4)分别向一系列含有不同浓度制糖废液的培养基中接种等量且适量的菌株C，放在相同且适宜的条件下培养，一段时间后检测培养液中S的含量　(5)减少环境污染(合理即可)