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新高考生物一轮复习学案：第35讲 基因工程
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这是一份新高考生物一轮复习学案：第35讲 基因工程，共25页。
考点一 基因工程的操作工具
1．基因工程的概念
2.基因工程的操作工具
(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
(3)载体
①作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
②种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
③条件 eq \b\lc\{(\a\vs4\al\c1(能自我复制,有一个至多个限制酶切割位点,有特殊的标记基因))
[基础诊断]
1．E·cli DNA连接酶既能连接平末端，又能连接黏性末端。(选修3 P5正文)(×)
2．质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素合成基因、氨苄青霉素合成基因等标记基因。(选修3 P6正文)(×)
3．在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。(选修3 P6正文)(√)
4．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。(选修3 P6正文)(√)
[深度拓展]
1．(选修3 P4寻根问底)根据你所掌握的知识，你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
提示：防止外来病原物的侵害，切割外源DNA，保护自身。
2．(选修3 P6寻根问底)DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
提示：不是。DNA连接酶发挥作用时不需要模板，连接的是两个DNA片段；DNA聚合酶发挥作用时需要模板，作用是将单个核苷酸依次连接到单链末端。
1．基因工程的理论基础
2．与DNA有关的几种酶的比较
eq \a\vs4\al(围绕基因工程所需工具酶，考查理解能力)
1．(2019·高考江苏卷改编)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
(1)EcRⅤ酶切位点为 eq \(\s\up7(…GAT↓ATC…),\s\d5(…CTA↑TAG…)) ，EcRⅤ酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用耐高温的DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表所示(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________________________、________________。
解析： (1)EcRⅤ从识别序列的中心轴线处切割，所以产生的末端为平末端。(2)由于载体和目的基因要连接成DNA分子，因此目的基因片段的两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸时，载体P1的两端应各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸。在DNA连接酶的作用下，可将P2和目的基因连接，形成重组质粒P3。(3)重组质粒P3上有完整的氨苄青霉素抗性基因，所以含有重组质粒P3的菌落在无抗生素和添加氨苄青霉素的培养基上能生长，而在添加四环素的培养基上不能生长，所以应选择的是B类菌落。A类菌落在添加氨苄青霉素、四环素、氨苄青霉素＋四环素的培养基上均能生长，说明A类菌落导入了P0。C类菌落在添加氨苄青霉素、四环素、氨苄青霉素＋四环素的培养基上均不能生长，说明C类菌落未导入质粒。
答案： (1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未导入质粒
eq \a\vs4\al(围绕载体的作用及特点，考查科学思维的能力)
2．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
D [在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于细菌拟核DNA外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。]
3．如图为某一重组质粒示意图，下列叙述错误的是( )
A．用限制酶EcRⅤ处理该质粒得到的分子共含有4个游离的磷酸基团
B．同时用限制酶EcRⅤ和BamHⅠ处理该质粒可得到3个双链DNA片段
C．在获得目的基因时应该使用的限制酶是BamHⅠ
D．将受体细胞培养于含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有目的基因的细胞
C [图中质粒含有限制酶EcRⅤ的2个切割位点，因此用限制酶EcRⅤ处理该质粒可得到2个线性DNA分子，每个线性DNA分子含有2个游离的磷酸基团，共含有4个游离的磷酸基团，A正确；用限制酶EcRⅤ和BamHⅠ在图中共含有3个切点，因此同时用限制酶EcRⅤ和BamHⅠ处理该质粒可得到3个双链DNA片段，B正确；用限制酶BamHⅠ切割会破坏目的基因，因此在获得目的基因时不应该使用的限制酶BamHⅠ，C错误；由图可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此将受体细胞培养于含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有目的基因的细胞，D正确。]
考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的获取
(1)从基因文库中获取目的基因
(2)人工合成目的基因
如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
①化学合成法
②反转录法
(3)利用PCR技术扩增目的基因
①原理：DNA双链复制。
②条件：模板DNA、引物、游离的dNTP(dCTP、dATP、dGTP、dTTP)、热稳定DNA聚合酶。
③过程
eq \b\lc\{(\a\vs4\al\c1(变性：90～95 ℃，DNA解链,↓,复性：55～60 ℃，引物与单链DNA结合,↓,延伸：70～75 ℃，在热稳定DNA聚合酶、（Taq酶）,作用下合成子链))
2．基因表达载体的构建
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)组成
(3)构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
[基础诊断]
1．基因组文库包含了某生物的全部基因，部分基因文库包含某生物部分基因。(选修3 P10正文)(√)
2．基因组文库和cDNA文库都可以进行物种间的基因交流。(选修3 P10正文)(×)
3．PCR操作过程中，不需要在反应体系中加入ATP。(选修3 P10正文)(√)
4．启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于载体DNA的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。(选修3 P11正文)(×)
5．农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。(选修3 P12正文)(√)
[深度拓展]
1．(选修3 P9寻根问底)为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？
提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR直接获得；如果目的基因序列完全不知，或只知道一段序列，或想获得许多基因等，往往就需要构建基因文库。
2．(选修3 P15思考与探究2)根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，理论上应该怎么做？
提示：农杆菌具有趋化性，农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因是单子叶植物通常不能产生酚类诱导物，有一些能产生诱导物的单子叶植物也可以被农杆菌侵染。若想将一个抗病基因导入单子叶植物，应该选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌都可侵染单子叶植物；加趋化和诱导的物质，使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢。
1．归纳概括PCR技术的操作原理和过程
(1)PCR原理：DNA复制原理，即：
(2)PCR反应过程
(3)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
2．基因组文库与cDNA文库的比较
eq \a\vs4\al(围绕PCR技术的应用，考查科学思维能力)
1．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的描述，错误的是( )
A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成
B．引物使Taq酶能从引物的5′端延伸DNA链
C．目标DNA母链用作DNA复制的模板
D．dATP可为PCR提供能量和原料
B [通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA双链复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；由于dATP含有特殊化学键，可以提供能量，同时其中的特殊化学键全部断裂后，形成的腺嘌呤脱氧核苷酸可以作为合成DNA的原料，故dATP可为PCR提供能量和原料，D正确。]
2．春季是疱疹性咽峡炎流行的季节，这种常见病是由柯萨奇病毒引起的，除了检测患者体内的抗体，还可以通过RTPCR技术进行明确诊断，该技术的基本流程如下图所示，下列叙述错误的是( )
A．该技术要避免RNA酶和外源DNA的污染
B．PCR技术中三组不同的温度设置目的不同
C．该技术还可用于检测目的基因的表达水平
D．该技术中需用到的酶有逆转录酶、解旋酶、耐高温的DNA聚合酶等
D [该实验是通过RNA逆转录成DNA来检测病毒RNA的存在，因此若有RNA酶将RNA水解或者外源DNA的污染就会导致检测错误；PCR技术中不会用到解旋酶，第一次高温的目的就是解旋，三个不同温度的目的不同，故选D。]
eq \a\vs4\al(围绕基因工程的操作程序，考查科学思维能力)
3．(2022·泰安模拟)B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了下图实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。下列关于该实验的叙述，不正确的是( )
A．B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录
B．可利用水稻体细胞和精子中的RNA构建cDNA文库，从中获得B基因中编码蛋白的序列
C．过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测TDNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上
D．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光
C [启动子是与RNA聚合酶识别、结合的部位，其能驱动基因转录出mRNA，所以B基因在水稻卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在水稻卵细胞中无法启动转录，A正确；目的基因的获取途径之一是从基因文库中获得，即从基因组文库或cDNA文库中获得，B正确；过程②农杆菌感染水稻愈伤组织，农杆菌Ti质粒的TDNA可整合到受体细胞染色体DNA上，检测TDNA 是否整合到水稻细胞染色体DNA上，应该用DNA分子杂交法，C错误；由于基因表达载体上有Luc基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，因此在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，D正确。]
4．(2021·全国高考乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA链接酶有E·cli DNA连接酶和T4DNA连接酶。如图中____________酶切割后的DNA片段可以用E·cli DNA连接酶连接。如图中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能____________________；质粒DNA分子上有____________________便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)。利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指_________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： (1)E·cli DNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接黏性末端，另外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。据图可知，EcRⅠ和PstⅠ切割DNA后产生的是黏性末端，SmaⅠ和EcRⅤ切割DNA后产生的是平末端。因此图中EcRⅠ、PstⅠ酶切割后的DNA片段可以用E·cli DNA连接酶连接，图中EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、EcRⅤ酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。(2)目的基因片段与质粒载体片段均是DNA片段，因此两片段之间通过核苷酸形成磷酸二酯键连接。因此DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是磷酸二酯键。(3)质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能自我复制、稳定存在；质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切点，通过不同的限制酶对质粒进行切割，以便插入外源DNA。标记基因的作用是为了鉴定宿主细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。若质粒DNA分子上存在某种抗生素的抗性基因，则可以用含该抗生素的培养基培养宿主细胞，若该宿主细胞含有该质粒，则宿主细胞可以存活，从而筛选出含质粒载体的宿主细胞。(4)表达载体含有启动子，启动子位于目的基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。
答案： (1)EcRⅠ、PstⅠ EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、EcRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制、稳定存在 一个至多个限制酶切点 用含该抗生素的培养基培养宿主细胞
(4)转录开始的地方，RNA聚合酶识别和结合的位点
考点三 基因工程的应用及蛋白质工程
1．基因工程的应用
(1)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质；利用植物生产药物等。
(2)动物基因工程：用于提高动物生长速度；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(3)基因工程药物
①来源：利用转基因的“工程菌”来生产的药物。
②种类：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
(4)基因治疗
①概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能， 从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。
②类型：体外基因治疗和体内基因治疗。
2．蛋白质工程
(1)概念
基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
手段：基因修饰或基因合成。
结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
(2)基本途径
[基础诊断]
1．利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(选修3 P21正文)(×)
2．基因治疗是把不正常基因改造成正常基因，使正常基因的表达产物发挥功能。(选修3 P23正文)(×)
3．体外基因治疗都是先从病人体内获得某种细胞进行培养，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。(选修3 P24正文)(√)
[深度拓展]
(选修3 P21正文)阅读P21教材中用转基因动物生产药物的一段内容，回答下列问题：
(1)用动物乳腺作为反应器，生产高价值的蛋白质比工厂化生产的优越之处有哪些？
提示：产量高、质量好、成本低。
(2)如何操作才能实现目的基因的产物在乳腺产生？
提示：要在编码目的蛋白质的基因序列前加上在乳腺组织中特意表达的启动子来构建基因表达载体。
(3)用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程是怎样的？
提示：获取目的基因→构建基因表达载体(在目的基因前加特意表达的启动子)→显微注射导入哺乳动物受精卵中→形成胚胎→将胚胎送入母体→发育成转基因动物。
1．比较体外基因治疗与体内基因治疗
2.蛋白质工程与基因工程的区别和联系
eq \a\vs4\al(围绕基因工程的应用，考查综合运用能力)
1．(2020·高考全国卷Ⅲ)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。
回答下列问题：
(1)步骤①中需要使用的工具酶有_________________________________。
步骤②和③所代表的操作分别是________和________。 步骤④称为________。
(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的________ (答出2点即可)的限制。
(3)一般来说，在同一动物个体中， 乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________(填“相同”或“不同”)，原因是____________________________。
(4)从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有______________________ (答出2点即可)。
解析： 本题考查基因工程及胚胎工程的相关内容。(1)题图中步骤①表示构建重组表达载体，所用工具酶为限制性核酸内切酶和DNA连接酶。步骤②中将重组表达载体导入动物细胞的操作方法是显微注射，步骤③为受精卵经早期胚胎培养发育成早期胚胎，步骤④为胚胎移植。(2)乳腺生物反应器生产的蛋白质在乳汁中，只有育龄期的雌性动物能分泌乳汁，而膀胱生物反应器生产的蛋白质在尿液中，只要动物排尿即可，故无性别、年龄限制。(3)同一动物个体的两种上皮细胞都是由受精卵分裂、分化而来的体细胞，遗传物质相同。(4)胚胎工程的主要技术包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等。
答案： (1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶 显微注射 早期胚胎培养 胚胎移植 (2)性别、年龄 (3)相同 两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵 (4)体外受精、胚胎移植
eq \a\vs4\al(围绕蛋白质工程，考查科学思维)
2．(2019·海南卷)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题：
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取________作为模板，在________催化下合成cDNA，再利用________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： (1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，TDNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的TDNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸甲对应的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲对应的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
答案： (1)mRNA 逆转录酶 PCR (2)TDNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 (3)找到第6位氨基酸甲对应的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲对应的碱基替换为氨基酸乙的碱基
考点四 DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
2．操作流程
[基础诊断]
1．用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质。(选修1 P55正文)(√)
2．提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替。(选修1 P55正文)(×)
3．在DNA的粗提取与鉴定实验中，将丝状物溶解在2 ml/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。(选修1 P56正文)(×)
[深度拓展]
下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析：
(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？
提示：不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 ml/L，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。
(2)操作②中加入体积分数为95%的冷酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？
提示：②中加入体积分数为95%的冷酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质，这时搅拌要沿一个方向，轻缓地进行。
(3)操作③中的黏稠物是如何获取的？加入2 ml/L NaCl的目的是什么？
提示：黏稠物是经过单层纱布过滤获得的； 加入2 ml/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。
1．DNA和蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的比较
2．DNA的粗提取与鉴定中的“2、3、4”
3．归纳DNA粗提取中的注意事项
(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。
eq \a\vs4\al(明确DNA的粗提取与鉴定实验原理)
1．(2019·江苏高考)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提取的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
A [哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和细胞器，细胞内基本不含DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；DNA析出过程中，搅拌要轻柔且沿着一个方向，以防止DNA断裂，B正确；DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C正确；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D正确。]
eq \a\vs4\al(掌握DNA的粗提取与鉴定实验操作过程)
2．(2020·石家庄质检)如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。回答下列问题：
(1)图中实验材料A可以是______________等，研磨前加入的B应该是________________。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后， 再向滤液中加入2 ml/L的NaCl溶液的目的是________________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是________________。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得下表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液________。
(4)DNA鉴定的原理是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： (1)选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨。(2)DNA在2 ml/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 ml/L的NaCl溶液中的溶解度最小，向滤液中加入2 ml/L 的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质；向滤液中加入蒸馏水可降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出，除去溶解在低盐溶液中的杂质。(3)DNA不溶于冷酒精，所以含DNA最少的是滤液H。(4)鉴定DNA 的原理是在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
答案： (1)洋葱、菜花 洗涤剂和食盐 (2)使DNA溶解 使DNA(溶解度下降而沉淀)析出 (3)H (4)在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色
1．(2021·全国高考甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是_______。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、______三步，其中复性的结果是________________________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_____________特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指__________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
解析： (1)利用PCR技术检测病原菌的步骤是：采集病人组织样本→从病人组织样本中提取DNA→利用PCR扩增DNA片段→分析PCR扩增结果，即④②③①。(2)利用PCR扩增DNA片段需要耐高温的DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物必须与病原菌DNA碱基互补配对。(4)PCR全称为聚合酶链式反应，是在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
答案： (1)④②③① (2)耐高温的DNA聚合酶 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 (3)病原菌DNA (4)在生物体外大量快速扩增DNA片段的技术
2．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________________和________________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： 本题考查基因文库和PCR过程等知识，意在考查考生的识记能力和理解能力。(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
答案： (1)基因组文库 cDNA文库
(2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键
(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
1．PCR全称为聚合酶链式反应，是在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。其原理是DNA的复制。
2．PCR的条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。
3．PCR共包括三步：①高温变性：DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开)；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
1．(2022·天津一中模拟)Bt基因即苏云金芽孢杆菌基因，因其表达产物Bt毒蛋白具有杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。如图为培育转Bt基因抗虫棉幼苗的基本操作过程，请分析回答：
(1)Bt基因可从构建的Bt基因组文库中获取，也可以从其cDNA文库中获取。从前者获取的Bt基因__________(填“含有”或“不含有”)启动子。
(2)若利用PCR技术从cDNA文库中获取Bt基因(基因序列未知)，需根据Bt蛋白中的氨基酸序列设计引物，引物的序列可以有多种，原因是__________________________________。在PCR体系中需加入其中的________(填“全部”“任意1种”或“其中2种”)引物。若Bt基因序列已知，则引物的序列通常为____________种。
(3)在构建基因表达载体的过程中，为了方便筛选含有目的基因的细胞，作为运载体的Ti质粒应含有________，Ti质粒中能帮助目的基因整合到宿主细胞染色体上的序列称为______________。
解析： (1)基因组文库是将生物体内的DNA全部提取，用适当的限制酶切割并导入受体菌形成的，含有启动子，cDNA文库是由mRNA反转录产生的，没有启动子。(2)一种氨基酸可能有多种密码子，对应生物DNA碱基序列就会有多种，因此不确定用于PCR的DNA序列，无法确定引物，因此要加入全部可能的引物；如果DNA序列确定，则每条模板链需要一种引物，因此是两种。(3)标记基因的作用是鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞，农杆菌中的Ti质粒可作为载体，能够帮助目的基因整合到宿主细胞染色体上的序列成为TDNA。
答案： (1)含有 (2)一种氨基酸可能有多种密码子，对应生物DNA碱基序列就会有多种 全部 2 (3)标记基因 TDNA(可转移DNA)
2．(2021·江苏调研)某植物蛋白酶抑制剂Ⅱ基因是重要的抗虫基因，该基因转录的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知。现利用PCR等技术扩增该基因，具体原理如图所示，其中①～③表示有关过程，Ⅰ～Ⅲ表示有关物质。请回答下列问题：
(1)过程①反应体系中，需要加入__________种引物，还需加入______________酶，生成杂合链物质Ⅰ。
(2)利用DNA末端转移酶催化过程②，使cDNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列[AAA(A)n]，其目的是__________________，进而利于过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ，过程③反应体系需要添加的新引物序列是____________________。
(3)与物质Ⅲ相比，物质Ⅰ化学组成不同的是____________________________。与过程③相比，过程①中碱基配对方式的不同之处是____________。
(4)在物质Ⅲ的两端通常还需要增加__________________序列，以便与相应的载体重组，再利用__________处理大肠杆菌等，以利于将重组质粒导入细胞，构建cDNA文库。
解析： (1)过程①表示以mRNA为模板逆转录形成DNA的过程，需要1种引物，且需要逆转录酶的催化。(2)过程②在cDNA末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列[AAA(A)n]，其目的是便于设计引物，因此在过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ时，反应体系需要添加的新引物序列是[TTT(T)n]。(3)据图分析可知，物质Ⅲ的两条链都是DNA链，而物质Ⅰ的一条链是DNA链、一条链是RNA链，因此物质Ⅰ化学组成与Ⅲ相比的不同之处在于物质Ⅰ含有核糖和尿嘧啶；且与过程③相比，过程①中特有的碱基配对方式是U—A。(4)根据题意分析，过程③表示利用PCR技术扩增目的基因的过程，因此在目的基因(物质Ⅲ)两端通常还需要增加限制酶识别序列，以便限制酶的识别与切割；将重组质粒导入大肠杆菌前，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。
答案： (1)1 逆转录 (2)便于设计引物 TTT(T)n (3)含核糖和尿嘧啶(U) U—A (4)限制酶识别 Ca2＋
一、网络构建
二、要语必记
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别某种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
2．DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。
3．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
4．目的基因的获取有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成三类方法。
5．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。
6．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
别名
基因拼接技术或DNA重组技术
原理
基因重组
操作环境
生物体外
操作水平
分子水平
结果
获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品
优点
克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物的遗传性状
种类
E·cli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
只缝合黏性末端
缝合黏性末端
和平末端
作用
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
菌落类型
平板类型
A
B
C
无抗生素
＋
＋
＋
氨苄青霉素
＋
＋
－
四环素
＋
－
－
氨苄青霉素＋四环素
＋
－
－
限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制 eq \(。,\s\d4( ,))
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞
或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
过程
说明
图解
变性
温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
方法
比较
体外基因治疗
体内基因治疗
不同点
途径
从患者体内获得某种细胞→体外完成基因转移→筛选、细胞扩增→输入体内
直接向患者体内组织细胞中转移基因
特点
操作复杂，但效果可靠
方法较简单，但效果难以控制
相同点
都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临床试验阶段
1
研磨液中
搅拌研磨后过滤
滤液E
2
2 ml/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液F
3
0.14 ml/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液G
4
冷却的95%的酒精溶液中
搅拌后过滤
滤液H
析个性
第1题本题考查PCR技术的相关知识，关键是分析检测病原菌的方法，即PCR试剂盒；第2题基因工程的概念、PCR原理及操作步骤
找共性
两个题目都考查PCR的过程及相关的酶等知识点
考点一 基因工程的操作工具
1．基因工程的概念
2.基因工程的操作工具
(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
(3)载体
①作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
②种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
③条件 eq \b\lc\{(\a\vs4\al\c1(能自我复制,有一个至多个限制酶切割位点,有特殊的标记基因))
[基础诊断]
1．E·cli DNA连接酶既能连接平末端，又能连接黏性末端。(选修3 P5正文)(×)
2．质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素合成基因、氨苄青霉素合成基因等标记基因。(选修3 P6正文)(×)
3．在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。(选修3 P6正文)(√)
4．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。(选修3 P6正文)(√)
[深度拓展]
1．(选修3 P4寻根问底)根据你所掌握的知识，你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
提示：防止外来病原物的侵害，切割外源DNA，保护自身。
2．(选修3 P6寻根问底)DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
提示：不是。DNA连接酶发挥作用时不需要模板，连接的是两个DNA片段；DNA聚合酶发挥作用时需要模板，作用是将单个核苷酸依次连接到单链末端。
1．基因工程的理论基础
2．与DNA有关的几种酶的比较
eq \a\vs4\al(围绕基因工程所需工具酶，考查理解能力)
1．(2019·高考江苏卷改编)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
(1)EcRⅤ酶切位点为 eq \(\s\up7(…GAT↓ATC…),\s\d5(…CTA↑TAG…)) ，EcRⅤ酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用耐高温的DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表所示(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________________________、________________。
解析： (1)EcRⅤ从识别序列的中心轴线处切割，所以产生的末端为平末端。(2)由于载体和目的基因要连接成DNA分子，因此目的基因片段的两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸时，载体P1的两端应各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸。在DNA连接酶的作用下，可将P2和目的基因连接，形成重组质粒P3。(3)重组质粒P3上有完整的氨苄青霉素抗性基因，所以含有重组质粒P3的菌落在无抗生素和添加氨苄青霉素的培养基上能生长，而在添加四环素的培养基上不能生长，所以应选择的是B类菌落。A类菌落在添加氨苄青霉素、四环素、氨苄青霉素＋四环素的培养基上均能生长，说明A类菌落导入了P0。C类菌落在添加氨苄青霉素、四环素、氨苄青霉素＋四环素的培养基上均不能生长，说明C类菌落未导入质粒。
答案： (1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未导入质粒
eq \a\vs4\al(围绕载体的作用及特点，考查科学思维的能力)
2．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
D [在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于细菌拟核DNA外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。]
3．如图为某一重组质粒示意图，下列叙述错误的是( )
A．用限制酶EcRⅤ处理该质粒得到的分子共含有4个游离的磷酸基团
B．同时用限制酶EcRⅤ和BamHⅠ处理该质粒可得到3个双链DNA片段
C．在获得目的基因时应该使用的限制酶是BamHⅠ
D．将受体细胞培养于含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有目的基因的细胞
C [图中质粒含有限制酶EcRⅤ的2个切割位点，因此用限制酶EcRⅤ处理该质粒可得到2个线性DNA分子，每个线性DNA分子含有2个游离的磷酸基团，共含有4个游离的磷酸基团，A正确；用限制酶EcRⅤ和BamHⅠ在图中共含有3个切点，因此同时用限制酶EcRⅤ和BamHⅠ处理该质粒可得到3个双链DNA片段，B正确；用限制酶BamHⅠ切割会破坏目的基因，因此在获得目的基因时不应该使用的限制酶BamHⅠ，C错误；由图可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此将受体细胞培养于含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有目的基因的细胞，D正确。]
考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的获取
(1)从基因文库中获取目的基因
(2)人工合成目的基因
如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
①化学合成法
②反转录法
(3)利用PCR技术扩增目的基因
①原理：DNA双链复制。
②条件：模板DNA、引物、游离的dNTP(dCTP、dATP、dGTP、dTTP)、热稳定DNA聚合酶。
③过程
eq \b\lc\{(\a\vs4\al\c1(变性：90～95 ℃，DNA解链,↓,复性：55～60 ℃，引物与单链DNA结合,↓,延伸：70～75 ℃，在热稳定DNA聚合酶、（Taq酶）,作用下合成子链))
2．基因表达载体的构建
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)组成
(3)构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
[基础诊断]
1．基因组文库包含了某生物的全部基因，部分基因文库包含某生物部分基因。(选修3 P10正文)(√)
2．基因组文库和cDNA文库都可以进行物种间的基因交流。(选修3 P10正文)(×)
3．PCR操作过程中，不需要在反应体系中加入ATP。(选修3 P10正文)(√)
4．启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于载体DNA的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。(选修3 P11正文)(×)
5．农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。(选修3 P12正文)(√)
[深度拓展]
1．(选修3 P9寻根问底)为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？
提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR直接获得；如果目的基因序列完全不知，或只知道一段序列，或想获得许多基因等，往往就需要构建基因文库。
2．(选修3 P15思考与探究2)根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，理论上应该怎么做？
提示：农杆菌具有趋化性，农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因是单子叶植物通常不能产生酚类诱导物，有一些能产生诱导物的单子叶植物也可以被农杆菌侵染。若想将一个抗病基因导入单子叶植物，应该选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌都可侵染单子叶植物；加趋化和诱导的物质，使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢。
1．归纳概括PCR技术的操作原理和过程
(1)PCR原理：DNA复制原理，即：
(2)PCR反应过程
(3)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
2．基因组文库与cDNA文库的比较
eq \a\vs4\al(围绕PCR技术的应用，考查科学思维能力)
1．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的描述，错误的是( )
A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成
B．引物使Taq酶能从引物的5′端延伸DNA链
C．目标DNA母链用作DNA复制的模板
D．dATP可为PCR提供能量和原料
B [通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA双链复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；由于dATP含有特殊化学键，可以提供能量，同时其中的特殊化学键全部断裂后，形成的腺嘌呤脱氧核苷酸可以作为合成DNA的原料，故dATP可为PCR提供能量和原料，D正确。]
2．春季是疱疹性咽峡炎流行的季节，这种常见病是由柯萨奇病毒引起的，除了检测患者体内的抗体，还可以通过RTPCR技术进行明确诊断，该技术的基本流程如下图所示，下列叙述错误的是( )
A．该技术要避免RNA酶和外源DNA的污染
B．PCR技术中三组不同的温度设置目的不同
C．该技术还可用于检测目的基因的表达水平
D．该技术中需用到的酶有逆转录酶、解旋酶、耐高温的DNA聚合酶等
D [该实验是通过RNA逆转录成DNA来检测病毒RNA的存在，因此若有RNA酶将RNA水解或者外源DNA的污染就会导致检测错误；PCR技术中不会用到解旋酶，第一次高温的目的就是解旋，三个不同温度的目的不同，故选D。]
eq \a\vs4\al(围绕基因工程的操作程序，考查科学思维能力)
3．(2022·泰安模拟)B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了下图实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。下列关于该实验的叙述，不正确的是( )
A．B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录
B．可利用水稻体细胞和精子中的RNA构建cDNA文库，从中获得B基因中编码蛋白的序列
C．过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测TDNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上
D．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光
C [启动子是与RNA聚合酶识别、结合的部位，其能驱动基因转录出mRNA，所以B基因在水稻卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在水稻卵细胞中无法启动转录，A正确；目的基因的获取途径之一是从基因文库中获得，即从基因组文库或cDNA文库中获得，B正确；过程②农杆菌感染水稻愈伤组织，农杆菌Ti质粒的TDNA可整合到受体细胞染色体DNA上，检测TDNA 是否整合到水稻细胞染色体DNA上，应该用DNA分子杂交法，C错误；由于基因表达载体上有Luc基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，因此在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，D正确。]
4．(2021·全国高考乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA链接酶有E·cli DNA连接酶和T4DNA连接酶。如图中____________酶切割后的DNA片段可以用E·cli DNA连接酶连接。如图中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能____________________；质粒DNA分子上有____________________便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)。利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指_________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： (1)E·cli DNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接黏性末端，另外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。据图可知，EcRⅠ和PstⅠ切割DNA后产生的是黏性末端，SmaⅠ和EcRⅤ切割DNA后产生的是平末端。因此图中EcRⅠ、PstⅠ酶切割后的DNA片段可以用E·cli DNA连接酶连接，图中EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、EcRⅤ酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。(2)目的基因片段与质粒载体片段均是DNA片段，因此两片段之间通过核苷酸形成磷酸二酯键连接。因此DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是磷酸二酯键。(3)质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能自我复制、稳定存在；质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切点，通过不同的限制酶对质粒进行切割，以便插入外源DNA。标记基因的作用是为了鉴定宿主细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。若质粒DNA分子上存在某种抗生素的抗性基因，则可以用含该抗生素的培养基培养宿主细胞，若该宿主细胞含有该质粒，则宿主细胞可以存活，从而筛选出含质粒载体的宿主细胞。(4)表达载体含有启动子，启动子位于目的基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。
答案： (1)EcRⅠ、PstⅠ EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、EcRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制、稳定存在 一个至多个限制酶切点 用含该抗生素的培养基培养宿主细胞
(4)转录开始的地方，RNA聚合酶识别和结合的位点
考点三 基因工程的应用及蛋白质工程
1．基因工程的应用
(1)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质；利用植物生产药物等。
(2)动物基因工程：用于提高动物生长速度；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(3)基因工程药物
①来源：利用转基因的“工程菌”来生产的药物。
②种类：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
(4)基因治疗
①概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能， 从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。
②类型：体外基因治疗和体内基因治疗。
2．蛋白质工程
(1)概念
基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
手段：基因修饰或基因合成。
结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
(2)基本途径
[基础诊断]
1．利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(选修3 P21正文)(×)
2．基因治疗是把不正常基因改造成正常基因，使正常基因的表达产物发挥功能。(选修3 P23正文)(×)
3．体外基因治疗都是先从病人体内获得某种细胞进行培养，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。(选修3 P24正文)(√)
[深度拓展]
(选修3 P21正文)阅读P21教材中用转基因动物生产药物的一段内容，回答下列问题：
(1)用动物乳腺作为反应器，生产高价值的蛋白质比工厂化生产的优越之处有哪些？
提示：产量高、质量好、成本低。
(2)如何操作才能实现目的基因的产物在乳腺产生？
提示：要在编码目的蛋白质的基因序列前加上在乳腺组织中特意表达的启动子来构建基因表达载体。
(3)用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程是怎样的？
提示：获取目的基因→构建基因表达载体(在目的基因前加特意表达的启动子)→显微注射导入哺乳动物受精卵中→形成胚胎→将胚胎送入母体→发育成转基因动物。
1．比较体外基因治疗与体内基因治疗
2.蛋白质工程与基因工程的区别和联系
eq \a\vs4\al(围绕基因工程的应用，考查综合运用能力)
1．(2020·高考全国卷Ⅲ)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。
回答下列问题：
(1)步骤①中需要使用的工具酶有_________________________________。
步骤②和③所代表的操作分别是________和________。 步骤④称为________。
(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的________ (答出2点即可)的限制。
(3)一般来说，在同一动物个体中， 乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________(填“相同”或“不同”)，原因是____________________________。
(4)从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有______________________ (答出2点即可)。
解析： 本题考查基因工程及胚胎工程的相关内容。(1)题图中步骤①表示构建重组表达载体，所用工具酶为限制性核酸内切酶和DNA连接酶。步骤②中将重组表达载体导入动物细胞的操作方法是显微注射，步骤③为受精卵经早期胚胎培养发育成早期胚胎，步骤④为胚胎移植。(2)乳腺生物反应器生产的蛋白质在乳汁中，只有育龄期的雌性动物能分泌乳汁，而膀胱生物反应器生产的蛋白质在尿液中，只要动物排尿即可，故无性别、年龄限制。(3)同一动物个体的两种上皮细胞都是由受精卵分裂、分化而来的体细胞，遗传物质相同。(4)胚胎工程的主要技术包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等。
答案： (1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶 显微注射 早期胚胎培养 胚胎移植 (2)性别、年龄 (3)相同 两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵 (4)体外受精、胚胎移植
eq \a\vs4\al(围绕蛋白质工程，考查科学思维)
2．(2019·海南卷)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题：
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取________作为模板，在________催化下合成cDNA，再利用________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： (1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，TDNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的TDNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸甲对应的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲对应的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
答案： (1)mRNA 逆转录酶 PCR (2)TDNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 (3)找到第6位氨基酸甲对应的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲对应的碱基替换为氨基酸乙的碱基
考点四 DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
2．操作流程
[基础诊断]
1．用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质。(选修1 P55正文)(√)
2．提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替。(选修1 P55正文)(×)
3．在DNA的粗提取与鉴定实验中，将丝状物溶解在2 ml/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。(选修1 P56正文)(×)
[深度拓展]
下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析：
(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？
提示：不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 ml/L，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。
(2)操作②中加入体积分数为95%的冷酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？
提示：②中加入体积分数为95%的冷酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质，这时搅拌要沿一个方向，轻缓地进行。
(3)操作③中的黏稠物是如何获取的？加入2 ml/L NaCl的目的是什么？
提示：黏稠物是经过单层纱布过滤获得的； 加入2 ml/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。
1．DNA和蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的比较
2．DNA的粗提取与鉴定中的“2、3、4”
3．归纳DNA粗提取中的注意事项
(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。
eq \a\vs4\al(明确DNA的粗提取与鉴定实验原理)
1．(2019·江苏高考)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提取的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
A [哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和细胞器，细胞内基本不含DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；DNA析出过程中，搅拌要轻柔且沿着一个方向，以防止DNA断裂，B正确；DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C正确；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D正确。]
eq \a\vs4\al(掌握DNA的粗提取与鉴定实验操作过程)
2．(2020·石家庄质检)如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。回答下列问题：
(1)图中实验材料A可以是______________等，研磨前加入的B应该是________________。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后， 再向滤液中加入2 ml/L的NaCl溶液的目的是________________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是________________。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得下表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液________。
(4)DNA鉴定的原理是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： (1)选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨。(2)DNA在2 ml/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 ml/L的NaCl溶液中的溶解度最小，向滤液中加入2 ml/L 的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质；向滤液中加入蒸馏水可降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出，除去溶解在低盐溶液中的杂质。(3)DNA不溶于冷酒精，所以含DNA最少的是滤液H。(4)鉴定DNA 的原理是在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
答案： (1)洋葱、菜花 洗涤剂和食盐 (2)使DNA溶解 使DNA(溶解度下降而沉淀)析出 (3)H (4)在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色
1．(2021·全国高考甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是_______。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、______三步，其中复性的结果是________________________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_____________特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指__________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
解析： (1)利用PCR技术检测病原菌的步骤是：采集病人组织样本→从病人组织样本中提取DNA→利用PCR扩增DNA片段→分析PCR扩增结果，即④②③①。(2)利用PCR扩增DNA片段需要耐高温的DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物必须与病原菌DNA碱基互补配对。(4)PCR全称为聚合酶链式反应，是在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
答案： (1)④②③① (2)耐高温的DNA聚合酶 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 (3)病原菌DNA (4)在生物体外大量快速扩增DNA片段的技术
2．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________________和________________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： 本题考查基因文库和PCR过程等知识，意在考查考生的识记能力和理解能力。(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
答案： (1)基因组文库 cDNA文库
(2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键
(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
1．PCR全称为聚合酶链式反应，是在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。其原理是DNA的复制。
2．PCR的条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。
3．PCR共包括三步：①高温变性：DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开)；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
1．(2022·天津一中模拟)Bt基因即苏云金芽孢杆菌基因，因其表达产物Bt毒蛋白具有杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。如图为培育转Bt基因抗虫棉幼苗的基本操作过程，请分析回答：
(1)Bt基因可从构建的Bt基因组文库中获取，也可以从其cDNA文库中获取。从前者获取的Bt基因__________(填“含有”或“不含有”)启动子。
(2)若利用PCR技术从cDNA文库中获取Bt基因(基因序列未知)，需根据Bt蛋白中的氨基酸序列设计引物，引物的序列可以有多种，原因是__________________________________。在PCR体系中需加入其中的________(填“全部”“任意1种”或“其中2种”)引物。若Bt基因序列已知，则引物的序列通常为____________种。
(3)在构建基因表达载体的过程中，为了方便筛选含有目的基因的细胞，作为运载体的Ti质粒应含有________，Ti质粒中能帮助目的基因整合到宿主细胞染色体上的序列称为______________。
解析： (1)基因组文库是将生物体内的DNA全部提取，用适当的限制酶切割并导入受体菌形成的，含有启动子，cDNA文库是由mRNA反转录产生的，没有启动子。(2)一种氨基酸可能有多种密码子，对应生物DNA碱基序列就会有多种，因此不确定用于PCR的DNA序列，无法确定引物，因此要加入全部可能的引物；如果DNA序列确定，则每条模板链需要一种引物，因此是两种。(3)标记基因的作用是鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞，农杆菌中的Ti质粒可作为载体，能够帮助目的基因整合到宿主细胞染色体上的序列成为TDNA。
答案： (1)含有 (2)一种氨基酸可能有多种密码子，对应生物DNA碱基序列就会有多种 全部 2 (3)标记基因 TDNA(可转移DNA)
2．(2021·江苏调研)某植物蛋白酶抑制剂Ⅱ基因是重要的抗虫基因，该基因转录的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知。现利用PCR等技术扩增该基因，具体原理如图所示，其中①～③表示有关过程，Ⅰ～Ⅲ表示有关物质。请回答下列问题：
(1)过程①反应体系中，需要加入__________种引物，还需加入______________酶，生成杂合链物质Ⅰ。
(2)利用DNA末端转移酶催化过程②，使cDNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列[AAA(A)n]，其目的是__________________，进而利于过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ，过程③反应体系需要添加的新引物序列是____________________。
(3)与物质Ⅲ相比，物质Ⅰ化学组成不同的是____________________________。与过程③相比，过程①中碱基配对方式的不同之处是____________。
(4)在物质Ⅲ的两端通常还需要增加__________________序列，以便与相应的载体重组，再利用__________处理大肠杆菌等，以利于将重组质粒导入细胞，构建cDNA文库。
解析： (1)过程①表示以mRNA为模板逆转录形成DNA的过程，需要1种引物，且需要逆转录酶的催化。(2)过程②在cDNA末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列[AAA(A)n]，其目的是便于设计引物，因此在过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ时，反应体系需要添加的新引物序列是[TTT(T)n]。(3)据图分析可知，物质Ⅲ的两条链都是DNA链，而物质Ⅰ的一条链是DNA链、一条链是RNA链，因此物质Ⅰ化学组成与Ⅲ相比的不同之处在于物质Ⅰ含有核糖和尿嘧啶；且与过程③相比，过程①中特有的碱基配对方式是U—A。(4)根据题意分析，过程③表示利用PCR技术扩增目的基因的过程，因此在目的基因(物质Ⅲ)两端通常还需要增加限制酶识别序列，以便限制酶的识别与切割；将重组质粒导入大肠杆菌前，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。
答案： (1)1 逆转录 (2)便于设计引物 TTT(T)n (3)含核糖和尿嘧啶(U) U—A (4)限制酶识别 Ca2＋
一、网络构建
二、要语必记
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别某种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
2．DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。
3．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
4．目的基因的获取有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成三类方法。
5．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。
6．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
别名
基因拼接技术或DNA重组技术
原理
基因重组
操作环境
生物体外
操作水平
分子水平
结果
获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品
优点
克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物的遗传性状
种类
E·cli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
只缝合黏性末端
缝合黏性末端
和平末端
作用
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
菌落类型
平板类型
A
B
C
无抗生素
＋
＋
＋
氨苄青霉素
＋
＋
－
四环素
＋
－
－
氨苄青霉素＋四环素
＋
－
－
限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制 eq \(。,\s\d4( ,))
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞
或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
过程
说明
图解
变性
温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
方法
比较
体外基因治疗
体内基因治疗
不同点
途径
从患者体内获得某种细胞→体外完成基因转移→筛选、细胞扩增→输入体内
直接向患者体内组织细胞中转移基因
特点
操作复杂，但效果可靠
方法较简单，但效果难以控制
相同点
都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临床试验阶段
1
研磨液中
搅拌研磨后过滤
滤液E
2
2 ml/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液F
3
0.14 ml/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液G
4
冷却的95%的酒精溶液中
搅拌后过滤
滤液H
析个性
第1题本题考查PCR技术的相关知识，关键是分析检测病原菌的方法，即PCR试剂盒；第2题基因工程的概念、PCR原理及操作步骤
找共性
两个题目都考查PCR的过程及相关的酶等知识点
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