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    人教版高考生物一轮总复习选择性必修3第10单元第38课基因工程学案

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    人教版高考生物一轮总复习选择性必修3第10单元第38课基因工程学案

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    这是一份人教版高考生物一轮总复习选择性必修3第10单元第38课基因工程学案,共25页。学案主要包含了基因工程的概念,重组DNA技术的基本工具,DNA的粗提取与鉴定,基因工程的基本操作程序,DNA片段的扩增及电泳鉴定,基因工程的应用,蛋白质工程的原理和应用等内容,欢迎下载使用。
    第38课 基 因 工 程
    课程标准要求
    学业质量水平
    5.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的
    5.1.2 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA 连接酶和载体三种基本工具
    5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤
    5.1.4 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质
    5.2.1 概述人们根据基因工程原理,进行蛋白质设计和改造,可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质
    5.2.2 举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程
    1.结合生活或生产实例,举例说出基因工程的基本原理。(生命观念)
    2.运用比较、归纳与概括的方法,理解限制酶和DNA连接酶的作用特点,运用结构与功能观,理解载体的结构特点及作用。(生命观念 科学思维)
    3.按照实验操作步骤,进行DNA的粗提取与鉴定实验,写出实验报告并与他人进行必要的交流。(科学思维 科学探究)
    4.运用演绎与推理、模型与建模,理解基因工程基本操作程序,进行简单的设计。(生命观念 科学思维)
    5.按照实验操作步骤,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。(科学思维 科学探究)
    6.结合生活或生产实例,举例说出基因工程的应用和蛋白质工程的基本原理,尝试提出初步的蛋白质工程学构想,进行简单的设计。(生命观念 科学思维)


    一、基因工程(重组DNA技术)的概念
    1.操作技术:转基因等技术。
    2.操作水平:DNA分子水平。
    3.操作结果:赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
    二、重组DNA技术的基本工具
    1.限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
    (1)来源:主要是原核生物。
    (2)作用特点: 具有专一性,表现在两个方面:
    ①识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
    ②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
    (3)作用结果:产生黏性末端或平末端。


    2.DNA连接酶——“分子缝合针”
    (1)作用: 将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
    (2)种类
    常用类型
    E.coli DNA连接酶
    T4 DNA连接酶
    来源
    大肠杆菌
    T4噬菌体
    功能
    只“缝合” 黏性末端
    “缝合”黏性末端和平末端
    结果
    恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,如图:

    3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
    (1)作用:将外源基因送入受体细胞。
    (2)常用载体:质粒、噬菌体、动植物病毒。
    (3)最常用载体:质粒。
    ①本质:裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
    ②特点
    三、DNA的粗提取与鉴定
    1.原理
    (1)提取
    ①依据DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,初步分离DNA和蛋白质。
    ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,也能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
    (2)鉴定:DNA+二苯胺蓝色。
    2.操作流程

    四、基因工程的基本操作程序
    1.第一步:目的基因的筛选与获取
    (1)目的基因:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,主要是指编码蛋白质的基因。
    (2)筛选合适的目的基因:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
    (3)利用PCR获取和扩增目的基因
    ①PCR:聚合酶链式反应。
    ②原理:DNA半保留复制。
    ③反应场所:PCR扩增仪。
    ④条件
    ⑤过程
    过程
    说明
    图解
    变性
    当温度上升到90 ℃以上时,双链DNA解聚为单链

    复性
    当温度下降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

    延伸
    当温度上升到72 ℃左右时,耐高温的DNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5′端向3′端延伸

    ⑥结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加。
    2.第二步:基因表达载体的构建——基因工程的核心
    (1)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
    (2)基因表达载体的构建

    3.第三步:将目的基因导入受体细胞
    (1)转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
    (2)方法
    4.第四步:目的基因的检测与鉴定
    (1)分子水平的检测
    ①通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA;
    ②通过抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译出蛋白质。
    (2)个体生物学水平的鉴定:通过接种试验进行抗性特性及抗性程度的鉴定。
    五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
    1.DNA片段的扩增
    (1)原理:利用PCR在体外扩增DNA分子。
    (2)实验用具:PCR仪、微量离心管、微量移液器。
    (3)实验步骤
    ①移液:按配方用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分;
    PCR反应体系的配方
    组分
    含量
    10倍浓缩的扩增缓冲液
    5 μL
    20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液
    1 μL
    20 μmol/L的引物Ⅰ
    2.5 μL
    20 μmol/L的引物Ⅱ
    2.5 μL
    H2O
    28~33 μL
    1~5 U/μL的Taq DNA聚合酶
    1~2 U
    模板DNA
    5~10 μL
    总体积
    50 μL
    注:模板DNA的用量为1 pg~1 μg。
    ②离心:使反应液集中在微量离心管的底部。
    ③反应:设置好PCR仪的循环程序,将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
    2.DNA片段的电泳鉴定
    (1)原理
    ①DNA分子中的可解离基团,在一定的pH条件下会带上正电荷或负电荷。
    ②在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
    ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
    ④凝胶中的DNA分子通过染色,在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
    (3)实验步骤
    ①制胶:提前将模具和梳子准备好,用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液,在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化,稍冷却后加入适量的核酸染料混匀,倒入模具,并插入梳子。
    ②形成加样孔:待凝胶溶液完全凝固,小心拔出梳子,取出凝胶放入电泳槽内。
    ③上样
    ④电泳:接通电源,设定电压,待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳。
    ⑤拍照:取出凝胶,置于紫外灯下观察和照相。
    六、基因工程的应用
    方面
    应用
    成果举例
    农牧业方面
    植物
    转基因抗虫植物
    转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻、马铃薯等
    转基因抗病植物
    转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等
    转基因抗除草剂植物
    转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等
    改良植物品质
    提高玉米中赖氨酸含量等
    动物
    提高动物的生长速率
    转基因鲤鱼
    改善畜产品的品质
    转基因牛分泌的乳汁中,乳糖含量降低
    医药卫生领域
    对微生物或动植物的细胞进行基因改造
    细胞因子、抗体、疫苗和激素等
    让哺乳动物批量生产药物
    乳腺生物反应器
    建立移植器官工厂
    转基因克隆动物器官
    食品工业方面
    基因工程菌
    生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等
    其他应用
    培育出可以降解多种污染物的“超级细菌”,经过基因改造的微生物来生产能源等
    七、蛋白质工程的原理和应用
    1.概念
    (1)基础:蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
    (2)手段:改造或合成基因。
    (3)目的:改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需求。
    2.基本思路:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
    3.应用
    应用
    实例
    医药工业方面
    研发速效胰岛素类似物,利用蛋白质工程研发药物
    其他工业方面
    改进酶的性能或开发新的工业用酶
    农业方面
    改造某些参与调控光合作用的酶,以提高植物光合作用的效率;设计优良微生物农药,通过改造微生物蛋白质的结构,使防治病虫害的效果增强
    面临的困难
    对蛋白质发挥功能必须依赖的正确的高级结构的了解还很不够

    1.限制性内切核酸酶、DNA连接酶与载体是重组DNA技术的三种基本工具
    (1)E.coli DNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。 (×)
    (2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。 (×)
    (3)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。 (×)
    (4)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。 (×)
    2.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定实验
    (1)可用猪血代替菜花作为实验材料。 (×)
    (2)在DNA溶液中加入二苯胺试剂,沸水浴加热,检测结果呈蓝色。 (√)
    (3)Taq DNA聚合酶的应用解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题,成就了PCR技术的自动化。 (√)
    (4)琼脂糖凝胶电泳法可用于PCR产物的检测。 (√)
    3.基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面有广阔的前景
    (1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株。 (√)
    (2)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。 (×)
    4.对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的
    (1)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。 (√)
    (2)收集大量的蛋白质分子结构的信息,以便分析结构与功能之间的关系。 (√)
    (3)可以预测具有一定氨基酸序列的蛋白质的空间结构和生物功能。 (√)




        重组DNA技术的基本工具

    1.限制酶的选择方法

    根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
    (1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
    (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
    (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
    2.与DNA有关的四种酶
    项目
    限制酶
    DNA连接酶
    DNA聚合酶
    解旋酶
    作用底物
    DNA分子
    DNA分子
    片段
    脱氧核苷酸
    DNA分子
    作用部位
    磷酸二酯键
    磷酸二酯键
    磷酸二酯键
    碱基对间的氢键
    作用结果
    形成黏性末端或平末端
    形成重组
    DNA分子
    形成新的
    DNA分子
    形成单链DNA分子
    3.载体上标记基因的作用
    载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素,所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞,作用机理如图所示:


    考向1| 限制酶的应用
    1.下图是表达新基因用的质粒示意图,若要将目的基因插入质粒上的A处,则切割基因时可用的是(  )

    A.Hind Ⅲ B.EcoRⅠ C.EcoB D.PstⅠ
    C 解析:A处有3处限制酶(BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ)的切点,只有使用A~D项中的EcoB限制酶切割时,才能让目的基因插入A处且使原有基因失活。
    考向2| DNA连接酶的应用
    2.下列四个DNA黏性末端能被DNA连接酶连接起来的一组是(  )

    A.①② B.②③ C.③④ D.②④
    D 解析:能够被DNA连接酶连接的黏性末端需存在碱基互补配对关系,②和④的黏性末端具有碱基互补配对关系,能够被DNA连接酶连接起来。
    考向3| 载体的应用
    3.质粒是基因工程中最常用的载体,它存在于许多细菌体内。质粒上的标记基因如图所示,通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况不同,下图表示外源基因插入位置(插入点有a、b、c),请根据表中提供细菌的生长情况,推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点,正确的一组是(  )

    推测
    细菌在含氨苄青霉素培养基上生长情况
    细菌在含四环素培养基上生长情况

    能生长
    能生长

    能生长
    不能生长

    不能生长
    能生长
    A.①是c;②是b;③是a
    B.①是a和b;②是a;③是b
    C.①是a和b;②是b;③是a
    D.①是c;②是a;③是b
    A 解析:推测①中重组后细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长,说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏,因此外源基因插入点是c。推测②中重组后细菌能在含氨苄青霉素培养基上生长,说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏;不能在含四环素培养基上生长,说明抗四环素基因被破坏,因此外源基因插入点是b。推测③中重组后细菌不能在含氨苄青霉素培养基上生长,说明抗氨苄青霉素基因被破坏;能在含四环素培养基上生长,说明抗四环素基因没有被破坏,因此外源基因插入点是a。

        DNA的粗提取与鉴定

    1.DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
    项目
    溶解规律
    2 mol/L NaCl溶液
    0.14 mol/LNaCl溶液
    DNA

    溶解
    析出
    蛋白质
    NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中,蛋白质溶解度逐渐增大
    部分发生盐析沉淀
    溶解
    2.实验中的注意事项
    (1)实验材料的选取:凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是使用DNA含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大。
    (2)破碎细胞,获取含DNA的滤液
    ①实验材料是植物细胞,加入一定的研磨液,进行充分地搅拌和研磨,过滤后收集滤液。
    ②实验材料是动物细胞,在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可。
    (3)提取和分离DNA用塑料离心管的原因:细胞破碎后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附;由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。

    下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是(  )
    A.将研磨液加入切碎的洋葱,充分研磨后过滤要弃去上清液
    B.采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质
    C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损
    D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后振荡,观察颜色变化
    B 解析:将研磨液加入切碎的洋葱,充分研磨后过滤要弃去沉淀物,收集上清液,故A错误;DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离,进行DNA的粗提取,故B正确;用塑料离心管可减少提取过程中DNA的损失,故C错误;将白色丝状物溶解在NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后沸水加热5 min,观察颜色变化,故D错误。

        基因工程的基本操作程序

    观察运用基因工程技术培育抗虫棉的操作过程并思考:

    (1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么?一般情况下,为什么要用同种限制酶处理目的基因和载体?
    答案:目的基因是Bt抗虫蛋白基因,载体是Ti质粒。用同种限制酶处理目的基因和载体,可以获得相同的黏性末端,便于构建基因表达载体。
    (2)该实例中,采用何种方法导入目的基因?为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上?
    答案:采用的方法是农杆菌转化法。由于Ti质粒上的T­DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上,而目的基因又插入了T­DNA上,所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
    (3)该实例中,检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种?
    答案:抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。

    1.基因工程操作的实质和原理
    (1)基因工程的实质是“基因重组”,它是将外源基因导入受体细胞,使该基因在受体细胞中表达。由于“外源基因”是自然界已存在的“现成”基因,故基因工程并未产生新基因,因此目的基因表达时也未产生新蛋白质,基因工程只不过是让受体细胞(或生物)“实现了外源基因的表达”。
    (2)目的基因到了另一种生物体内能够成功表达的原理是所有生物共用一套遗传密码。
    2.将目的基因导入不同受体细胞的方法
    受体细胞
    常用方法
    过程
    植物细胞
    花粉管
    通道法
    ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中;
    ②植物受粉后剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
    主要适用于双子叶植物和裸子植物
    农杆菌转化法
    将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入农杆菌→侵染植物细胞→含目的基因的T­DNA整合到受体细胞的染色体DNA上→筛选转化细胞并再生成植株或培养植株并获得种子再进行筛选、鉴定
    动物细胞(受精卵)
    显微注射技术
    基因表达载体

    显微注射到受精卵

    发育成具有新性状的动物
    原核生物(大肠杆菌等)
    Ca2+处
    理法
    Ca2+处理大肠杆菌→细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→将基因表达载体导入其中
    3.目的基因检测与鉴定的“两个水平”


    为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。

    下列操作与实验目的不符的是(  )
    A.用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
    B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞
    C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞
    D.用PCR等技术检测C基因是否整合到菊花染色体上
    C 解析:目的基因C和质粒都有EcoRⅠ的酶切位点,另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来;愈伤组织全能性较高,是理想的植物受体细胞,将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法;质粒中的潮霉素抗性基因为标记基因,因此选择培养基中应该加入潮霉素进行筛选;使用PCR等技术可检测目的基因是否整合到受体染色体上。
    【易错提醒】基因工程操作的四个易错点
    (1)目的基因的插入位点不是随意的,基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
    (2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
    (3)农杆菌转化法原理:农杆菌易感染植物细胞,并将其Ti质粒上的T­DNA转移并整合到受体细胞的染色体DNA上。
    (4)启动子≠起始密码子,终止子≠终止密码子。启动子和终止子位于DNA片段上,分别控制转录过程的启动和终止;起始密码子和终止密码子位于mRNA上,分别控制翻译过程的启动和终止。

        DNA片段的扩增及电泳鉴定

    1.细胞内DNA复制与PCR技术的区别
    比较项目
    细胞内DNA复制
    PCR技术
    不同点
    解旋
    在解旋酶的作用下边解旋边复制
    90~95 ℃高温解旋,双链完全分开

    DNA解旋酶、DNA聚合酶
    TaqDNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)
    引物
    RNA
    DNA或RNA
    温度
    体内温和条件
    高温―→低温―→中
    温―→……
    相同点
    ①需提供DNA模板;
    ②四种脱氧核苷酸为原料
    2.PCR扩增过程中温控作用
    (1)高温变性:DNA解旋过程;
    (2)低温复性:引物结合到互补链DNA上;
    (3)中温延伸:合成子链。
    3.PCR实验操作的四点提醒
    (1)为避免外源DNA等因素的污染,所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压蒸汽灭菌。
    (2)缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 ℃条件下储存。
    (3)每添加一种试剂后,移液器上的枪头必须更换。
    (4)混合均匀后要离心处理,使反应液集中在离心管底部。
    4.琼脂糖凝胶电泳实验注意事项
    (1)为了避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。
    (2)该实验所需材料可以直接从公司购买,缓冲液和酶应该分装成小份,并且在-20 ℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出放在冰块上缓慢融化。
    (3)向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。
    (4)在进行操作时一定要戴好一次性手套。
    5.PCR扩增图解


    考向1| PCR扩增DNA片段
    1.(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例):

    请据图回答问题:
    (1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种______________酶,它通过识别特定的____________切割特定位点。
    (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′­羟基与5′­磷酸间形成__________________;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得__________;TaqDNA聚合酶的作用是催化________________。
    (3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________(从引物①②③④中选择,填编号)。

    DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
    已知
    序列

    PCR
    引物
    ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′
    ②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′
    ③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′
    ④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′
    (4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是________。
    A.5′—AACTATGCG……AGCCCTT—3′
    B.5′—AATTCCATG……CTGAATT—3′
    C.5′—GCAATGCGT……TCGGGAA—3′
    D.5′—TTGATACGC……CGAGTAC—3′
    解析:(1)EcoRⅠ是一种限制性内切核酸酶,它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点。(2)DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′­羟基与5′­磷酸间形成磷酸二酯键。在PCR循环中,升温到95 ℃是为了使DNA变性,DNA双链解旋为DNA单链,以作为DNA扩增的模板链。TaqDNA聚合酶以DNA单链为模板,以结合在特定DNA模板上的引物为出发点,将4种游离的脱氧核苷酸按5′→3′方向沿模板链顺序合成新的DNA子链,故其作用是催化以DNA为模板合成的DNA链的延伸。(3)片段F中,已知的DNA序列为

    要通过设计引物进行反向PCR,从而得到已知序列在两端、未知序列在中间段的PCR产物(操作原理如下图所示),则需要反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,因此要选择5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′和5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′这对引物。(4)据题图及反向PCR的原理示意图可知片段F的两端为EcoRⅠ割后的黏性末端,故正确选项为B。

    答案:(1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板合成的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
    考向2| PCR扩增产物的电泳鉴定
    2.PCR技术可快速实现DNA片段扩增;电泳技术可在外电场作用下,把待测分子的混合物放在一定的介质(如琼脂糖凝胶)中进行分离和分析或用作亲子鉴定。下图是电泳装置和电泳结果:


    (1)电泳和叶绿体色素分离采用的纸层析法比较,后者使用的介质是______________;根据电泳的原理,你认为可以用它来分离核苷酸吗?_________________________________________________。
    (2)PCR技术能把某一DNA分子片段进行扩增。依据的原理是______________,每次循环需要经过______________________三步,所用的引物是一段____________________________。
    (3)图3是把含有21个氨基酸的多肽进行水解,得到的氨基酸混合物进行电泳的结果,故可推知该多肽由________种氨基酸构成。
    (4)图4通过提取某小孩和其母亲,以及待测定的四位男性的DNA,分别由酶处理后,生成含有若干DNA片段,并进行扩增得到的混合物,然后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱。请分析:F1~F4中,谁是该小孩真正生物学上的父亲?________。为什么?__________________________________________。
    (5)电泳过程中分子的迁移速率除与本身所带净电荷的多少有关外,你认为还受什么因素的影响?
    _____________________________________________________ (列出2种)。
    解析:(1)色素分离的原理是四种色素在层析液中的溶解度不同,随着层析液扩散的速度不同,溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快;电泳技术则是在外电场作用下,利用分子携带的净电荷不同,把待测分子的混合物放在一定的介质中进行分离和分析的实验技术。该技术也可用来分离核苷酸。(2)PCR在体外把某一DNA片段在酶的作用下合成许多相同片段,原理是DNA分子复制。每次循环需要经过变性、复性和延伸三步,所用的引物是一段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(3)某氨基酸混合物经过电泳后分离形成6个区域,因此共有6种氨基酸。(4)子代的DNA是从亲代DNA遗传来的,即子代与亲代DNA相同。图中C和F2的DNA指纹图谱完全相同,故F2与C为父子关系。(5)分子的大小、形态、凝胶的种类、密度,电泳的电压大小等都会影响电泳过程中分子迁移速率。
    答案:(1)层析液 可以 (2)DNA复制 变性、复性和延伸 能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 (3)6 (4)F2  C和F2的DNA指纹图谱完全相同 (5)电泳的电压、被测分子的大小、被测分子的形态、凝胶的种类、密度等(答出2点即可)

        蛋白质工程的原理和应用

    蛋白质工程与基因工程的区别与联系
    区别与联系
    蛋白质工程
    基因工程
    区别
    过程
    预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获取所需
    目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
    实质
    定向改造或生产人类所需的蛋白质
    定向改造生物的遗传特性,以获得人类所需的类型或生物产品
    结果
    可生产自然界没有的蛋白质
    只能生产自然界已有的蛋白质
    联系
    ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程;
    ②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造

    T4溶菌酶在温度较高时易失去活性。科学家对编码T4溶菌酶的基因进行了改造,使其表达的T4溶菌酶第三位的异亮氨酸变为半胱氨酸,在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键,提高了T4溶菌酶的耐热性。回答下列问题:
    (1)上述操作涉及的技术属于__________工程,该技术的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→_____________ →________________→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
    (2)在确定目的基因的碱基序列后,可通过______________的方法获取目的基因,再利用________技术进行扩增。
    (3)在将目的基因导入受体细胞前,要构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成,除了目的基因外,还必须有________、________以及标记基因等。标记基因的作用是___________________________________________________。
    解析:(1)题干所述过程是对基因进行改造,结果得到耐热性提高的蛋白质,因此属于蛋白质工程的范畴。该技术的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。(2)在确定目的基因的碱基序列后,可通过人工合成的方法获取目的基因,再利用PCR技术进行扩增。(3)基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
    答案:(1)蛋白质 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 (2)人工合成 PCR (3)启动子 终止子 鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来
    【备选案例】
    下图表示蛋白质工程的操作过程,相关说法不正确的是(  )

    A.a、b过程分别是转录、翻译
    B.蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作
    C.蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术
    D.蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因
    C 解析:a过程是以DNA的一条链为模板合成mRNA的转录过程,b过程是以mRNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的多肽链的翻译过程,A正确;蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活需求,因此蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作,B正确;蛋白质工程是在基因工程的基础上,延伸出来的第二代基因工程,C错误;蛋白质工程中,可能根据已经明确的蛋白质结构构建出一种全新的基因,D正确。

    学习探索情境
      菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花,培育出抗虫菊花。下图是获得转基因菊花的技术流程。

    PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,用PCR方法可以检测转基因菊花是否含有目的基因。
    命题生长点1 基因工程的基本工具
    (1)质粒是基因工程中最常用的载体,其化学本质是环状DNA。
    (2)限制酶M和N(如图)切割后产生的相同黏性末端是GATC,连接它们所需要的基本工具是DNA连接酶。

    解析:(1)质粒是一种具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。(2)限制酶M切割后露出的黏性末端是,限制酶N切割后露出的黏性末端是,即二者切割后产生的相同黏性末端是GATC,连接它们所需要的基本工具是DNA连接酶。
    命题生长点2 基因工程的操作过程
    (1)为了促进对重组质粒的吸收,可用氯化钙溶液(Ca2+)处理土壤农杆菌,使其处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
    (2)将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素、营养物质以及卡那霉素的固体培养基中,在适宜条件下进行培养,筛选转基因菊花。
    解析:(1)将构建的重组质粒导入土壤农杆菌时,需用氯化钙溶液(Ca2+)处理土壤农杆菌,使其处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(2)由题意“卡那霉素抗性基因KanR为标记基因,菊花叶片对卡那霉素高度敏感”可知,为了筛选转基因菊花,可将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素、营养物质以及卡那霉素的固体培养基中,在适宜条件下进行培养。
    命题生长点3 PCR扩增技术
    (1)用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时,需根据抗虫基因的核苷酸序列设计特异性引物,以转基因菊花的DNA为模板进行第一轮扩增。
    (2)PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题,但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代,科学家从一种Taq细菌中分离到耐高温的DNA聚合酶,它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来,所用的培养基叫选择培养基。
    (3)假设在PCR反应中,只有一个DNA片段作为模板,请计算在5次循环后,反应物中大约有多少个这样的DNA片段?
    答案:DNA复制两条链均作为模板,进行半保留式复制,所以复制5次后得到的子代DNA分子数为25=32个。
    (4)请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮循环的产物。
    答案:如下图


    农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
    (1)第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA的中间部位;第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T­DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
    (2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T­DNA导入受体细胞。
    PCR过程与细胞内的DNA复制过程的主要区别
    (1)PCR过程需要的引物是人工合成的能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
    (2)PCR过程中DNA的解旋依靠温度变化而非解旋酶。

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