高考生物总复习第10单元第40课基因工程学案

这是一份高考生物总复习第10单元第40课基因工程学案，共33页。学案主要包含了易错分析，教材细节命题，易错提醒，命题动态等内容，欢迎下载使用。
第40课　基因工程
►学业质量水平要求◄
1．结合具体的应用实例，说明基因工程技术的原理、工具和操作过程。(科学思维)
2．通过对比分析蛋白质工程和传统基因工程的不同及应用价值。(科学思维、社会责任)
3．通过实际操作学会细胞中DNA的提取和鉴定方法，学习PCR技术原理和操作。(科学思维、科学探究)

考点一　重组DNA技术的基本工具

1．基因工程的概念
(1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：分子水平。
(4)基础：生物化学、分子生物学和微生物学等学科。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”

(2)DNA连接酶——“分子缝合针”

(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
①作用：将外源基因送入受体细胞中。
②种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。
③条件：a．具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA插入其中。
b．能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
c．具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。

1．重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。 (　×　)
2．切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。 (　×　)
3．DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。 (　×　)
4．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。 (　×　)
5．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。 (　×　)

1．基因工程的理论基础

2．限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。

(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。
3．标记基因的作用：用于检测目的基因是否导入受体细胞。


考向1| 基因工程中工具酶的分析
1．(2021·山东青岛期末)下表为常用的限制性核酸内切酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是(　　)
限制酶名称
识别序列和
切割位点


限制酶名称
识别序列和
切割位点
BamHⅠ
G↓GATCC
KpnⅠ
GGTAC↓C
EcoRⅠ
C↓AATTC
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅡ
GTY↓RAC
SmaⅠ
CCC↓GGG
(注：Y＝C或T，R＝A或G)
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
D　解析：HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC—，C正确；一种限制酶也可以识别多种核苷酸序列，如HindⅡ能识别GTYRAC序列，其中Y可以是C或T，R可以是A或G，D错误。
2．下列关于DNA连接酶的相关叙述，正确的是(　　)
A．DNA连接酶需要模板，连接的是两条链碱基对之间的氢键
B．DNA连接酶连接的是黏性(平)末端两条链主链上的磷酸和脱氧核糖
C．T4 DNA连接酶只能连接黏性末端两条链主链上的磷酸和核糖
D．E．coli DNA连接酶既能连接平末端，又能连接黏性末端
B　解析：DNA连接酶不需要模板，催化形成的是磷酸二酯键，A错误；DNA连接酶连接的是黏性(平)末端两条链主链上的磷酸和脱氧核糖，使两者之间形成磷酸二酯键，B正确；T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，连接的是两条链主链上的磷酸和脱氧核糖，C错误；E．coli DNA连接酶只能连接黏性末端，D错误。
考向2| 基因工程中的载体的判断
3．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是(　　)
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
D　解析：质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布，A错误；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点而成为合适的运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C错误；质粒上抗性基因常作为标记基因，D正确。
【易错分析】细胞膜上的载体与基因工程中的载体的两个“不同”
(1)化学本质不同
①细胞膜上的载体的化学成分是蛋白质。
②基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌体、动植物病毒等。
(2)功能不同
①细胞膜上的载体的功能是协助细胞膜控制物质进出细胞。
②基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
考点二　基因工程的基本操作程序

1．目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
②筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：DNA复制。
②基本条件
参与的组分
在DNA复制中的作用
高温
打开DNA双链
DNA母链
提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
耐高温的DNA聚合酶
催化合成DNA子链
2种引物
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
③扩增过程

(3)构建基因文库来获取目的基因
2．基因表达载体的构建——核心
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成

(3)基因表达载体的构建过程

3．将目的基因导入受体细胞
类型
方法
说明
特点
植物细胞
农杆
菌转
化法
将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T­DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞的染色体DNA上→目的基因表达
经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物，但单子叶植物也获得了成功
花粉
管通
道法
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
简便、经济，我国科学家独创的一种方法
动物
细胞
显微
注射
技术
将含有目的基因的表达载体→显微注射到受精卵中→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物
将目的基因导入动物细胞最为有效的方法
微生物
细胞
Ca2＋
处理法
Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
简便、经济、有效
4．目的基因的检测与鉴定
检测水平
检测目的
检测方法
分子水平
目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上
R CR
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交
个体水平
转基因生物是否表现出相应的特性
如抗虫、抗病的接种实验

1．目的基因就是指编码蛋白质的基因。 (　×　)
2．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 (　√　)
3．基因工程操作的核心步骤是目的基因的获取。 (　×　)
4．基因表达载体中含有启动子和密码子。 (　×　)
5．抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。 (　√　)
6．从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。 (　×　)
【教材细节命题】
1．(选择性必修3 P77相关信息改编)Bt抗虫蛋白怎样造成害虫死亡？当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
2．(选择性必修3 P77相关信息改编)如何理解PCR的引物？引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。

1．PCR技术与DNA复制的比较

2．基因表达载体的构建
(1)根据质粒的特点确定限制酶的种类

(2)根据Ti质粒的T­DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。

3．筛选出含有目的基因的受体细胞

(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
(3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如上图1、2、3、4、5菌落。再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如上图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如上图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。

考向1| PCR技术与应用分析
1．(2021·湖北卷)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
D　解析：增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少非特异性条带，B、C错误；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低使引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应中非特异性条带的产生，D正确。
2．新型冠状病毒的检测可以采用实时荧光RT­PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法，RT­PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是(　　)

A．过程①以mRNA为模板合成单链DNA
B．过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要n个引物B
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接
B　解析：过程①是由mRNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，A正确；决定实时荧光RT­PCR扩增片段的是引物，过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光RT­PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生DNA的数量(或浓度)，便于检测，C正确；游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接，D正确。
【易错提醒】PCR过程的两点提醒
(1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。
(2)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。
考向2| 基因表达载体的构建
3．下图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　)

A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
B　解析：题图过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤，A正确。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，B错误。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，C正确。基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。
4．利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别如下图所示(已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同)。下列分析错误的是(　　)

A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
D　解析：构建重组DNA时，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A正确；分析图甲，HindⅢ的酶切位点在第二个EcoRⅠ酶切位点的左侧，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为链状DNA分子，因每条DNA单链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C正确；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体后形成的黏性末端相同，可正向连接或反向连接，故可产生两种重组DNA，D错误。
【易错提醒】
(1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。
(2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
(3)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
考向3| 将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定的判断
5．菊花是一种双子叶植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长，还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长，某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述错误的是(　　)
A．受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞
B．将目的基因GNA插入Ti质粒的T­DNA上构建表达载体
C．可以将菊花叶片取下与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞
D．应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
A　解析：要获得转基因菊花，可以选择菊花叶片细胞作为受体细胞，但不能选择桃蚜细胞作为受体细胞，A错误；Ti质粒的T­DNA可以转移到受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据这一特点，构建表达载体时，应该将目的基因GNA插入Ti质粒的T­DNA上，B正确；可以将菊花叶片取下与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株，C正确；已知雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长，故应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度，D正确。
6．在全球气候变暖和水资源缺乏加剧的情况下，保障我国“粮食安全”问题尤为重要。玉米是重要的粮食作物，其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白，由P基因编码，在植物生长发育过程中对水分的吸收具有重要的调节功能。为了探究P蛋白的超量表达对玉米生长的影响，科研人员进行了超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性等研究。
超量表达P蛋白转基因玉米获得与鉴定。在超量表达P基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示，P蛋白在玉米株系的表达量如图2所示。


回答下列问题：
(1)强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被______________识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用________________酶组合，将片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。T­DNA在该实验中的作用是__________________________________________。
(2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入________进行筛选，筛选出的愈伤组织________形成丛芽，最终获得多个转基因玉米株系。
(3)据图2分析，选择a1、a2、a3玉米株系，作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究的实验材料，理由是________________________________
__________________________________________________________________。
解析：(1)根据“驱动基因的持续转录”可知，强启动子能被RNA聚合酶识别并结合。为使P基因在玉米植株中超量表达，应确保强启动子和P基因不被破坏，故应优先选用BamHⅠ和SacⅠ酶组合，将片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。T­DNA在该实验中的作用是将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞的染色体DNA上。(2)由图1可知，潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T­DNA上，能随T­DNA整合到玉米细胞的染色体上，故将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，筛选出的愈伤组织可(再)分化形成丛芽，最终获得多个转基因玉米株系。(3)据图2分析，a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表达量显著高于野生型玉米，故可以选择a1、a2、a3玉米株系，作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究的实验材料。
答案：(1)RNA聚合酶　BamHⅠ和SacⅠ　将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上　(2)潮霉素　(再)分化　(3)a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表达量显著高于野生型玉米
考点三　基因工程的应用和蛋白质工程

1．基因工程的应用
(1)基因工程在农牧业方面的应用：转基因抗虫植物、转基因抗病植物、转基因抗除草剂植物、改良植物的品质、提高动物的生长速率、改善畜产品的品质。
(2)基因工程在医药卫生领域的应用
①对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们生产药物。
②让哺乳动物批量生产药物。
③尝试将建立移植器官工厂的设想成为现实。
(3)在食品工业方面的应用：利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
2．蛋白质工程的原理和应用
(1)蛋白质工程的概念

(2)蛋白质工程的基本原理

(3)蛋白质工程的应用
①医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
②其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。
③农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，防治病虫害。

1．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因只能应用于棉花。 (　×　)
2．“转基因抗虫植物”也可以用于抵抗各种植物疾病。 (　×　)
3．干扰素是我国批准生产的第一个基因工程药物。 (　√　)
4．用基因工程的方法，使得外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。 (　√　)
5．对蛋白质的改造是通过直接改造相应的mRNA来实现的。 (　×　)

1．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别
比较内容
乳腺生物反应器
工程菌
含义
指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白
指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类
基因表达
合成的药物蛋白与天然蛋白质相同
微生物合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞
动物受精卵
微生物细胞
目的基因
导入方式
显微注射法
感受态细胞法
生产条件
不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大
需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取
从动物乳汁中提取
从微生物细胞或其培养液中提取
2．蛋白质工程与基因工程的区别和联系


考向1| 基因工程的应用
1．ACC合成酶是乙烯合成的关键酶，乙烯的合成会影响番茄的储藏和运输。下图为科学家利用ACC合成酶基因的反向连接构建载体，通过基因工程设计的耐储转基因番茄流程图。

下列说法错误的是(　　)
A．引物的特异性是能够从番茄DNA中获取ACC合成酶基因的关键
B．反向连接的ACC合成酶基因合成的mRNA通过与正常的ACC合成酶基因的mRNA互补，限制了细胞内乙烯的合成
C．可以在培养基中加入氨苄青霉素和四环素，存活下来的细胞内则含有携带目的基因的质粒
D．设计双酶切处理目的基因及载体是为了更好地保证目的基因的反向连接
C　解析：引物能与ACC合成酶基因通过碱基互补配对结合定位ACC合成酶基因的位置，因此引物的特异性是能够从番茄DNA中获取ACC合成酶基因的关键，A正确；反向连接的ACC合成酶基因合成的mRNA通过与正常的ACC合成酶基因的mRNA互补，使ACC合成酶基因不能正常表达，从而限制细胞内乙烯的合成，B正确；从题图中可知，基因表达载体中ACC合成酶基因破坏了四环素抗性基因，因此含有携带目的基因的质粒的细胞能在含有氨苄青霉素的培养基中存活，但不能在含有四环素的培养基中存活，C错误；设计双酶切处理目的基因及载体是为了更好地保证目的基因的反向连接，D正确。
2．(2021·天津卷)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。

图1

图2
(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为________________。
(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑________________和____________________。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有________________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列________(填“能”或“不能”)在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在__ ________的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
(3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是____________(单选)。
A．进一步优化发酵条件
B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因
D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种
解析：(1)酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。(2)①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好地表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHⅠ的识别序列。②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。(3)进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确；由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。
答案：(1)细胞质基质　(2)①包含BamHⅠ的识别序列　将GTG改为ATG　②原核生物复制原点　不能　③缺失尿嘧啶　(3)B
考向2| 蛋白质工程的原理与应用分析
3．下图所示是利用蛋白质工程生产保存时间更久的干扰素(一种糖蛋白)的核心流程，下列叙述正确的是(　　)

A．该过程得到的干扰素与自然界中的干扰素相同
B．图中③过程得到的脱氧核苷酸序列往往是唯一的
C．蛋白质工程的基础是蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
D．蛋白质工程是通过对蛋白质的结构进行修饰或合成来操作的
C　解析：题图所示是利用蛋白质工程生产保存时间更久的干扰素，该过程得到的干扰素是经过改造的，与自然界中的干扰素不相同，A错误；由于密码子的简并，图中③过程得到的脱氧核苷酸序列往往不是唯一的，B错误；结构决定功能，蛋白质工程的基础是蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系，C正确；蛋白质工程是通过对基因的结构进行修饰或合成来操作的，D错误。
4．(2021·广东卷)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。

回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有_____________________________________________
____________________________________________。(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有_________________________________
_________________________________________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有______________。
(4)依如图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是_____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
在分子水平上，可以通过改变__________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
解析：(1)目前获取目的基因常用的方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、用化学方法人工合成等。(2)制备高质量 DNA模板时，可直接在滤液中加入蛋白酶分解蛋白质，而不破坏DNA。中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，当盐浓度较高时，蛋白质的溶解度下降并析出，这种现象称为盐析。利用DNA对高温的耐受性，严格控制温度范围，使蛋白质变性沉淀而DNA分子不发生变性，可将DNA与蛋白质分离。(3)将表达载体导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法是首先用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。然后将重组DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。为了检测目的基因是否表达出相关的酶蛋白，可以从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已表达出蛋白质产品。(4)酶的作用条件较温和，在温度过高、过酸、过碱的环境中会失活，不同酶的最适温度、最适pH一般不同，将4种酶放在同一体系中，控制温度、pH等条件一致，则部分酶可能会因温度或者pH不适宜而失活，不能达到实验目的，即无法获得肌醇。基因指导蛋白质的合成，可以通过改造酶基因的结构，从而改变蛋白质的结构，进而实现对酶特性的改造和优化。
答案：(1)从基因文库中获取、用化学方法人工合成　(2)蛋白酶水解法、盐析法、60～75 ℃恒温水浴法　(3)感受态　抗原—抗体杂交　(4)部分酶失活，无法获得肌醇　基因结构
考点四　(探究·实践)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定

1．DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理

(2)实验步骤

2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验原理
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)实验步骤

(3)DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。

1．DNA的粗提取与鉴定的注意事项
(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
(3)鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液；在实验组试管中加DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
(5)观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

考向1| DNA粗提取与鉴定
1．(2019·江苏卷)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(　　)
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
A　解析：哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。
2．(2021·江苏百校联考)下图是“DNA的粗提取和鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是(　　)


A．图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精
B．图①和图③都需用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，以防止破坏DNA
C．若图③操作后接图②操作，则DNA留在滤液中
D．若图④操作后接图②操作，则DNA留在纱布上
B　解析：DNA不溶于酒精，95%的冷酒精凝集效果最佳，所以图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精，以便除去溶于酒精的杂质，提取含杂质较少(或较纯净)的DNA，A正确；图①玻棒搅拌，目的是提取出含杂质较少的DNA，图③玻棒搅拌，目的是溶解细胞核内的DNA，B错误；图③操作是加入蒸馏水，破碎细胞，图②操作是过滤，获取含DNA的滤液，使DNA留在滤液中，C正确；图④操作是去除滤液中杂质，析出DNA，图②操作是过滤，将DNA留在纱布上，D正确。
考向2| DNA片段的扩增及电泳鉴定
3．在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述中错误的是(　　)

A．该载体最可能为环状DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D．限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
D　解析：当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
4．人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为cfDNA。近几年，结合PCR及电泳鉴定、DNA测序等技术，cfDNA在临床上得到了广泛应用。下列相关说法错误的是(　　)
A．PCR反应中设置不同的温度是为了使DNA聚合酶催化不同的反应
B．在琼脂糖凝胶中，cfDNA的迁移速率与cfDNA分子的大小、构象等有关
C．在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物
D．对cfDNA进行检测，可以用于肿瘤的早期筛查
A　解析：PCR反应中温度的周期性改变是为了解旋变性、复性、延伸，A错误；分子的大小、形态，凝胶的种类、密度，电泳的电压大小等都会影响分子迁移速率，B正确；在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物，C正确；cfDNA是人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后形成的游离DNA，所以可通过检测cfDNA中的相关基因，判断其来自正常或异常细胞，并进行癌症的筛查，D正确。

【命题动态】针对人类生产或生活的某一需求，在基因工程中设置真实情境考查基因工程的操作工具、操作程序，特别是基因工程的应用。难度高档，常以非选择题形式呈现。

(2021·山东卷)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。

(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是____________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是______________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_______
___________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于____________________________，理由是
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
[思维培养]

解析：(1)首先分析载体的序列，在不能破坏荧光蛋白基因的前提下，能插入的位点只有MunⅠ和XhoⅠ这2个限制酶的切割位点(因为荧光蛋白基因中有EcoRⅠ的切割位点，所以排除此处作为插入位点)，而荧光蛋白基因的终止子在左侧，故插入的调控序列应左右颠倒进行插入，即R段插入载体的MunⅠ酶切位点，F1～F7末端插入载体的XhoⅠ酶切位点。分析题中所给的5种限制酶的识别序列，可以看出MunⅠ和EcoRⅠ互为同尾酶，XhoⅠ和SalⅠ互为同尾酶，即可形成相同的黏性末端。剪切扩增产物时，F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶应选择SalⅠ，这样可以与载体中的XhoⅠ酶切位点结合，又不会导致调控序列中的XhoⅠ位点被切断，故只能选SalⅠ。而调控序列中有MunⅠ酶切位点，所以R末端应该选择与MunⅠ同尾的EcoRⅠ切割，而不能选择MunⅠ。从产物扩增到载体构建完成需要SalⅠ、EcoRⅠ(这两个酶用于切γ基因上游不同长度的片段)、MunⅠ、XhoⅠ(这两个用于切载体的结合位点)，载体构建过程中还用到PCR技术，所以还需要TaqDNA聚合酶，而载体构建完成还需要DNA连接酶将DNA片段连接起来，所以一共需要SalⅠ、EcoRⅠ、MunⅠ、XhoⅠ、TaqDNA聚合酶、DNA连接酶这6种酶。(2)受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达　(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上　根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上

1．(科学实验和探究情境)大肠杆菌β­半乳糖苷酶(Z酶)可催化白色底物(X­gal)水解产生蓝色物质。在pUC18质粒中，lacZ′编码Z酶氨基端的一个片段(称为α­肽)，该质粒结构及限制酶识别位点如图甲所示。已知α­肽、缺失α­肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性。利用图乙中的目的基因与pUC18质粒进行基因工程操作。


(1)获得目的基因后，需要通过 PCR 技术扩增。PCR 反应中需要用到的酶是Taq酶，其不能从头开始合成DNA，而只能____________________________，因此PCR扩增需要引物。在扩增图乙目的基因时，与之对应的引物结合部位应该是图中的________(填数字)。为了使目的基因插入pUC18质粒中，需要在引物的________端添加限制酶的识别序列。
(2)若计划用1个目的基因为模板获得m(m大于2)个目的基因，则需要的引物总量是________个。
(3)用重组质粒转化大肠杆菌，然后将大肠杆菌接种到含____________的固体培养基上进行培养，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而在该培养基上不能生长。
(4)当上述培养基中含有X­gal时，生长出的菌落有蓝色和白色两种类型，其中含有重组质粒的大肠杆菌的菌落颜色为__________。为了保证能通过菌落颜色辨别是否含有重组质粒，本实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是_____________________________________________________________
___________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
解析：(1)Taq酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，因此PCR扩增需要引物。DNA分子中含游离的磷酸基团的为5′端，含游离羟基的为3′端；由于Taq酶只能从引物的3′端延伸DNA链，引物与目的基因所在DNA分子遵循碱基互补配对原则，所以扩增图乙目的基因时，与之对应的引物结合部位应该是目的基因所在DNA分子的3′端，即图中的2、3。为了使目的基因完整地插入pUC18质粒中，需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。(2)若计划用1个目的基因为模板获得m(m大于2)个目的基因，因为每个新合成的目的基因的两条脱氧核苷酸链的两端都各含有一个引物，故m个基因应该有2m个引物，原来的模板链中不含引物，则需要的引物总量是(2m－2)个。(3)重组质粒上有氨苄青霉素抗性基因(标记基因)，因此应该将大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的固体培养基上进行培养，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有氨苄青霉素抗性，在含氨苄青霉素培养基上不能生长。(4)从图中可知，重组质粒是用酶SalI或HindⅢ处理过的质粒和目的基因片段形成的，限制酶处理后，重组质粒的lacZ′基因被破坏，不能合成β­半乳糖苷酶(Z酶)，不能催化底物(X­gal)水解产生蓝色物质，故菌落呈白色。已知α­肽、缺失α­肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性，为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是编码α­肽的DNA序列缺失，其他序列正常。
答案：(1)从3′端延伸DNA链　2、3　5′　(2)2m－2　(3)氨苄青霉素　(4)白色　编码α­肽的DNA序列缺失，其他序列正常
2．(科学实验和探究情境)结核病是由结核杆菌引起的人畜共患病。结核杆菌通常以气溶胶形式传播，气溶胶颗粒被肺泡吞噬细胞吞噬，吞噬细胞破裂导致结核杆菌在机体内进一步传播。羊痒病是由正常细胞的非致病性朊蛋白异构化为痒病朊蛋白所致。为研制既能抗结核病又能抗羊痒病的双抗羊，科学家进行了如下操作。
(1)将山羊吞噬细胞特异性启动子MRS与小鼠SP110基因形成融合基因，用__________________将融合基因与质粒构建成重组质粒，导入山羊肺泡吞噬细胞(组2)。以_______________________(组3)和转入空质粒的山羊吞噬细胞为对照组(组1)。分别接种等量的结核杆菌，72 h后加入________使吞噬细胞破裂，取裂解液进行涂布培养，结果如图1。由图可知小鼠SP110基因可用于双抗羊的研制，依据是__________________________________________________________
___________________________________________________________________。

(2)非致病性朊蛋白是由山羊13号染色体上的PRNP基因的第三外显子控制合成的，PRNP基因的结构如图2。

以L4和R1为识别位点设计TALEN敲除载体，对山羊成纤维细胞L4与R1之间的序列实施定点敲除。请根据上述信息，写出检测敲除是否成功的思路，并描述敲除成功的实验结果__________________________________________
___________________________________________________________________。


(3)将TALEN敲除载体与供体DNA载体共转化幼羊成纤维细胞，可将SP110基因定点敲入PRNP基因的第三外显子中，原理如图3。
请指出图4中的数字分别代表的结构。
1________；2________；3________；4________。
经__________________检测，成纤维细胞的SP110基因表达量明显下降。
(4)欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有________________。
解析：(1)构建重组质粒时需要限制酶切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将目的基因和质粒连接，形成重组质粒，组2是实验组，导入了重组质粒，对照组分别导入空质粒和只含目的基因，分别为组3和组1，组3中转入广泛表达小鼠SP110基因的重组质粒的山羊吞噬细胞。吞噬细胞破裂的方式是加入蒸馏水。由题图可知小鼠SP110基因可用于双抗羊的研制，依据是组2的吞噬细胞裂解后释放的结核杆菌数量与组3接近，显著小于组1。(2)检测敲除是否成功的思路及实验结果为：提取成纤维细胞DNA，根据第三外显子的序列设计引物，进行PCR，并对PCR产物用BamHⅠ进行切割，电泳，若仅有一条带，则敲除成功( 或提取成纤维细胞DNA，根据第三外显子的序列设计引物，进行PCR，并对PCR产物进行测序，若不存在GGATCC序列，则敲除成功)。(3)图4表示基因表达载体，其上包括有启动子、终止子、目的基因和标记基因等，所以1是L4序列，2是MRS启动子， 3是终止子， 4是R1序列。MRS是山羊吞噬细胞特异性启动子，经抗—原抗体杂交技术检测，成纤维细胞的SP110基因表达量明显下降。(4)欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有核移植、动物细胞培养、胚胎移植。
答案：(1)限制酶和DNA连接酶　转入广泛表达小鼠SP110基因的重组质粒的山羊吞噬细胞　蒸馏水　组2的吞噬细胞裂解后释放的结核杆菌数量与组3接近，显著小于组1　(2)提取成纤维细胞DNA，根据第三外显子的序列设计引物，进行PCR，并对PCR产物用BamHⅠ进行切割、电泳，若仅有一条带，则敲除成功(或提取成纤维细胞DNA，根据第三外显子的序列设计引物，进行PCR，并对PCR产物进行测序，若不存在GGATCC序列，则敲除成功)　(3)L4序列　MRS启动子　终止子　R1序列　抗原—抗体杂交技术　(4)核移植、动物细胞培养、胚胎移植