第十单元　专题突破12　PCR技术的原理及其应用-2027年高考生物一轮复习课件（含讲义及答案）

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活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
(一)PCR技术“引物”归纳分析1.引物的设计典例1　PCR扩增Bt抗虫蛋白基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会抑制引物与模板的碱基配对，复性温度过低会增大引物与DNA模板链发生错配的概率。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关。(1)PCR扩增Bt抗虫蛋白基因时，设计引物的依据是_________________ ，引物与Bt抗虫蛋白基因模板链的 端的部分序列互补配对。
(2)复性温度越低，产物特异性越 ，扩增效率越 。(3)引物长度越短，产物特异性越 。(4)引物的长度相同时，GC含量越高，需要设定的复性温度越 。
(5)某同学设计两组引物(只标注部分碱基序列)都不合理。请解释原因：
提示　第1组引物之间有连续多个碱基互补，导致引物Ⅰ和Ⅱ之间碱基互连形成引物二聚体，第2组引物自身有连续多个碱基互补，导致引物自身内部碱基互连形成发夹结构，都会影响引物与模板的结合。
引物设计原则①引物长度要适宜，通常为20～30个核苷酸。②引物GC含量要适宜，一般为45%～55%。③复性温度要适宜。④引物自身及引物之间不应有连续的多个碱基互补。
2.引物的修饰典例2　引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的
典例3　(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。
能与P基因模板链3′端的一段碱基序列
②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图分析，出现该问题的原因是____________________________________________________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是____________________________________________。
P基因编码链的第一个碱基与EcR Ⅰ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取
的EcR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基
3.引物的结合方向典例4　如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：
扩增X蛋白基因所需的引物序列是______________________________；____________________________。
5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′
5′-TGATCTACGGCTTACA-3′
4.引物的数量计算典例5　(1)如图：一个DNA分子n次扩增，则：①子代DNA分子中双链不等长的DNA分子数为____个；
②子代DNA分子中双链等长的DNA分子数为________个；③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为____个；④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为_______个；⑤复制过程中共需引物________个；⑥第n次复制需要引物___个。
(2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第____轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。
(二)PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳典例6　(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
DNA电泳鉴定中的“两液”“两剂”两液：电泳缓冲液和凝胶载样缓冲液
两剂：核酸染料与指示剂
蛋白质电泳的原理电荷驱动迁移：蛋白质在溶液中携带净电荷(取决于周围pH与其等电点pI的关系，等电点pI是蛋白质在溶液中净电荷为零时的pH)，在电场中向相反电极移动。例如：在pH 8.3的缓冲液中(pH>多数蛋白质的pI)，蛋白质带负电，向正极移动。凝胶筛效应：凝胶作为分子筛，小分子蛋白质迁移快，大分子被阻滞，实现按分子量分离，如SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
二、PCR技术的应用(一)利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式典例1　为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中
的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_________________。
(二)利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变典例2　如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。回答下列问题：
(1)PCR1所用引物应为___________。PCR1和PCR2必须分开进行的原因是____________________________________________________________________________________。得到图中由c、d链构成的完整DNA分子至少需要PCR2进行___次循环。
引物B和引物C存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系会发生碱基互补配对导致引物失效
(2)将PCR1、2的产物混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应中经过高温变性后，当温度下降到55 ℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有____种结合的可能，其中能进行进一步延伸的有___种。(3)PCR3________(填“需要”或“不需要”)额外加入引物，PCR4的作用是大量扩增突变基因，该过程所用引物是__________。
(三)利用重叠延伸PCR技术构造融合基因典例3　融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。
图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题：
(1)图1第二阶段中引物2与引物3部分碱基的_________关系使得两条DNA链能成功“搭桥”连接起来。(2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计___种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有__种。
(3)图2中需使用________________(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。
Spe Ⅰ、Sal Ⅰ
(四)利用反向PCR技术扩增未知基因序列典例4　如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcR Ⅰ酶切为例)。请回答下列问题：
(1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是______(从表格引物①②③④中选择，填编号)。
(2)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是___。A.5′-­AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT­-3′B.5′­-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT­-3′C.5′­-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-­3′D.5′-­TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC­-3′
(五)“双脱氧法”基因测序典例5　(2024·湖南，15改编)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述错误的是
A.上述PCR反应体系中只加入一种引物B.电泳时产物的片段越大，迁移速率越慢C.5′-CTACCCGTGAT-­3′为对照个体的一段序列D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
(1)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。(2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。
(4)双脱氧法原理示意图：
(六)实时荧光定量PCR典例6　实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高、特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值。
(1)做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和___种Taqman探针。(2)设初始目的基因有m个，扩增n次，需消耗探针_________个。(3)Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就______。
精练高频考点提升关键能力
(1)复制原点　Xba Ⅰ　DNA聚合酶　Spe Ⅰ、Sma Ⅰ　550　(2)4　连接成环(或环化)　测序和序列比对　(3)不能
(1)AAACC(或AAGCC)　简并性　引物B、C之间有碱基互补配对序列　(2)b链和c链　否　b链为模板时c链承担引物作用，c链为模板时b链承担引物作用　(3)A、D　XbaⅠ、SacⅠ　番茄果实中特异性表达的基因　(4)卡那霉素(或潮霉素)　潮霉素
(1)一种氨基酸可能由多种密码子编码(或密码子具有简并性)　DNA半保留复制(2)①5′－TCTGTT－3′　5′－CTTGGA－3′　②BamHⅠ和XmaⅠ　T4或E.cli　③卡那霉素和X－gal　无　目的基因破坏了LacZ基因的结构，LacZ基因无法表达　④260和1 700
一、选择题1.科学家在人类的基因中发现36种病毒基因的片段，并提取相关基因片段利用PCR技术进行扩增。下列叙述错误的是A.用PCR扩增仪进行扩增时，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋B.PCR反应体系中添加的DNA聚合酶的最适温度是92 ℃C.基因片段扩增过程中，脱氧核苷酸会依次加到引物的3′端D.标准PCR反应体系方法扩增目的基因一定要设计出2种引物
2.(2025·武汉调研)PCR技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm值。下列叙述正确的是A.引物与模板链的结合属于延伸过程B.变性过程的温度一般要低于复性过程C.复性过程的温度应设置为略低于Tm值D.引物的Tm值越接近，引物之间越容易结合
3.(2025·武汉调研)重叠延伸PCR技术是一种通过核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法，过程如图。下列叙述错误的是
A.引物中G、C的含量越高，复性温度越高；当 设置温度过低时可能导致非特异性条带增多B.第一阶段中引物2和引物3容易发生碱基互补配 对，因此两者应置于不同反应系统中C.加入引物1、2的反应系统和加入引物3、4的反 应系统中各进行1次PCR，共产生4种DNA分子D.引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形 成图中同时含有引物1、2的双链DNA分子，至 少要经过2次复制
4.(2025·成都树德中学检测)DNA分子杂交时，常需要大量的单链DNA探针。不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。假设在PCR反应的早期10个循环中，扩增产物是双链DNA，当较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。
下列叙述正确的是A.若a链为所需的DNA分子探针，则非限 制性引物应选用引物ⅢB.进行最初10个循环的目的是将限制性引物消耗完，以保证获得大量的 单链DNA探针C.设计较长的限制性引物与较短的非限制性引物，以便于后阶段通过提 高温度来控制产物生成量D.如果体系中原模板DNA的数量为m，共进行25次循环，则最终获得的 单链探针数为15×210m
5.关于DNA片段的扩增及电泳鉴定的实验，下列叙述错误的是A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都 必须进行高压灭菌处理B.根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，加热到 熔化，稍冷却后加入核酸染料混匀C.电泳鉴定PCR产物时凝胶载样缓冲液中的指示剂可提示终止时刻D.－20 ℃储存的小份缓冲液和酶，使用前从冰箱拿出，需要缓慢融化
6.(2025·驻马店期末)ddNTP(双脱氧核苷三磷酸)缺少3′羟基，无法形成新的磷酸二酯键，能使DNA链的延伸终止，因此常被用于DNA测序。某实验室欲利用PCR技术对某DNA进行测序，已知参与反应的物质有被测序的DNA、dNTP(脱氧核苷三磷酸)、引物、相关酶等，且不同ddNTP参与反应的结果如表所示，其中“■”代表引物。下列叙述正确的是
A.题中相关酶包括解旋酶、DNA聚合酶等B.若不考虑引物，则被测的DNA的序列应为5′－CTAAGCTCGACT－3′C.引物的碱基序列与模板链的3′端的一段碱基序列相同D.dNTP可为DNA复制提供原料和能量
7.巢式PCR是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1、R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2、R2)扩增目的基因，如图所示。下列叙述错误的是
A.两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段B.第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定C.由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性D.如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
8.某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2－amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(灰色区域)可互补配对。下列叙述错误的是
A.利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链B.不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增C.dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链D.杂交链延伸得到dsred2－amy融合基因的过程不需要加引物
二、非选择题9.(2025·山东，25)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T－DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为___________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和_________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是___________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_______________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为______bp，则一定为正向重组质粒。
Spe Ⅰ、Sma Ⅰ
(2)为证明这两个突变体是由T－DNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为___(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T－DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_________________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为________________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，______(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
10.(2025·南阳模拟)胰岛素的单体具有生物功能，二代胰岛素制剂由于易形成二聚体或六聚体而功能降低。如果将胰岛素B链28位脯氨酸与29位的赖氨酸交换位置，能有效抑制胰岛素聚合。已知基因上相应转录非模板链(a链)序列为5′—CCCAAG—3′，脯氨酸密码子为CC(A、U、C、G)，赖氨酸的密码子为AA(A、G)，科研人员希望通过PCR实现对目的基因的改造(过程如图1)，再通过农杆菌将改造后的基因导入番茄中，利用番茄果实生产三代胰岛素，该过程所用Ti质粒部分结构如图2所示，其中潮霉素抗性基因在真、原核细胞中均可表达，卡那霉素抗性基因在原核细胞中表达。回答下列问题：
(1)若改变最少碱基数量，则图1中引物C中不能与模板链配对的碱基序列为____________________，该设计利用了密码子的________特点，除具有与模板链不配对的序列外，引物B、C与普通引物的主要区别是_________________________________。
AAACC(或AAGCC)
(2)PCR3过程所用的模板链是__________，扩增时是否需要添加引物？________(填“是”或“否”)，原因是__________________________________________________________。
c链承担引物作用，c链为模板时b链承担引物作用　
(3)PCR4选用的引物为________，若保证改造后的目的基因能正确拼接到Ti质粒上，这两种引物需要分别添加限制酶______________的识别序列。图2中连接目的基因的启动子需要改造为_______________________________的启动子。
(4)在农杆菌和番茄细胞的培养基中分别加入__________________、_______可以筛选出发生转化的细胞。
11.(2025·成都一模)药物A是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对治疗糖尿病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程相关技术，利用大肠杆菌来生产这种药物。回答下列问题：(1)科学家根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段，由于_____________________________________________________，该方法得到的DNA片段有多种可能，也可以用PCR技术从植物细胞中扩增出药物A基因，该技术的原理为________________。
酸可能由多种密码子编码(或密码子具有简并性)
(2)如图1表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶识别位点(限制酶的识别序列和切割位点如表所示)，其中LacZ基因表达的产物可将无色物质X－gal催化为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝色。
①利用PCR技术获取和扩增目的基因，已知待扩增的目的基因两侧相关序列如图2，扩增时选用的两种引物碱基序列为(注明序列的5′端和3′端)_________________、____________________。
5′－TCTGTT－3′
5′－CTTGGA－3′
②分析图1，为将目的基因准确插入质粒中，最好选用________________酶切割目的基因，酶切处理后的目的基因和质粒需使用_______________(填“T4”“E.cli”或“T4或E.cli”)DNA连接酶处理，才能得到重组质粒。
③将目的基因导入受体菌时，若要准确筛选出含重组质粒的受体菌，需要将其培养在添加了__________________的培养基上。含有重组质粒的目标菌落将呈现____色，原因是_______________________________________________。
破坏了LacZ基因的结构，LacZ基因无法表达
④若将重组质粒用EcRⅠ充分酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离，可得到长度为______________bp的条带。