2027年高考生物一轮复习 突破练习含答案 071-能力提升课8 PCR技术的应用（教用）

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1．RT−PCR是将mRNA逆转录（过程Ⅰ）和cDNA(mRNA逆转录产生的互补DNA)聚合酶链式反应（过程Ⅱ）相结合的技术，具体过程如图所示，下列有关说法错误的是（ ）
A. 过程Ⅰ和过程Ⅱ的反应体系中主要用到的工具酶分别是逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶
B. 过程Ⅱ中拟对m个单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要m×2n个引物B
C. 引物A和B的长度越长、G和C比例越高，则过程Ⅱ内循环步骤中的复性温度就越高
D. 利用RT−PCR技术获取的真核生物的目的基因通过转基因技术可以在原核细胞中表达
【答案】B
【解析】过程Ⅱ是PCR技术，拟对m个单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要m(2n−1)个引物B，B错误；由题意可知，利用RT−PCR技术获取的真核生物的目的基因是逆转录获取的，不含内含子，因此可以在原核细胞中正确表达，D正确。
2．（2026·广东广州质检）实时荧光定量PCR是将荧光标记的探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解时，可在特定条件下检测到荧光。随着循环次数的增加，荧光信号强度增加。下列相关叙述正确的是（ ）
A. PCR过程中两种引物的碱基序列不能互补配对
B. 在反应过程中，ATP既是原料又为新链的合成提供能量
C. 荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有病变的概率越低
D. 若某次PCR反应共产生52个等长的DNA，则需要加入6个荧光探针
【答案】A
【解析】PCR的两种引物需分别与模板链的3′端互补，若引物间碱基互补会相互结合，干扰反应，因此设计时应确保不互补，A正确；在反应过程中，dNTP（脱氧核苷三磷酸）既是原料又为新链的合成提供能量，B错误；若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明越多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，C错误；PCR反应中DNA以指数形式扩增，DNA数量为2n(n为循环次数)，若产生52个等长的DNA，由于25=32，26=64，所以循环次数大于5小于6，最初的模板DNA不需要荧光探针，从第一次循环后开始，每次循环新合成的DNA需要荧光探针，假设循环n次，需要的荧光探针数为2n−2，当n=6时，需要的荧光探针数为26−2=62，D错误。
3．（2025·山东威海期末）重叠延伸PCR是一种能够在体外实现不同来源DNA片段定向重组的技术。具体原理是：通过利用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，借助重叠链的延伸将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，其过程如图所示。下列说法错误的是（ ）
A. PCR1与PCR2反应体系中的模板与引物种类不同
B. PCR3反应体系中经变性和复性后的DNA单链理论上有4种结合的可能
C. 重叠链延伸生成融合基因时需要加入引物
D. PCR4中需要添加的引物是引物1和4
【答案】C
【解析】PCR1扩增A基因，PCR2扩增B基因，二者模板分别是A基因和B基因，引物是针对A基因和B基因设计的不同引物，所以PCR1与PCR2反应体系中的模板与引物种类不同，A正确；PCR3反应体系中有来自PCR1和PCR2的产物，经变性和复性后，DNA单链理论上有4种结合可能：PCR1产物的两条单链结合、PCR2产物的两条单链结合、PCR1产物的一条单链与PCR2产物的一条单链正向结合、PCR1产物的一条单链与PCR2产物的一条单链反向结合，B正确；重叠链延伸生成融合基因时，利用的是PCR1和PCR2产物的重叠链，不需要额外加入引物，C错误；PCR4是对融合基因进行扩增，要扩增完整的融合基因，需要添加的引物是引物1和4，D正确。
4．（2025·山西太原二模）反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术，需要先将目标DNA进行环化，再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR技术来确定目的基因的插入位点，部分过程如图所示，相关叙述正确的是（ ）
A. 过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3
B. 过程③中复性是在72℃左右使两种引物与模板链结合
C. 过程①需要用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增
D. PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列
【答案】C
【解析】反向PCR是扩增已知序列两侧的未知序列，过程②设计引物时，应根据已知序列（目的基因两侧的部分核苷酸序列）来设计引物1和4，而不是引物2和3，A错误；PCR过程中，复性的温度一般在50℃左右，而72℃左右是延伸的温度，所以过程③中复性不是在72℃左右，B错误；PCR第一轮循环得到的两条DNA链长度不同，第二轮循环得到的DNA片段也都不等长，至少要到第三轮循环才可获得两条链等长的DNA片段，D错误。
5．免疫PCR是一种微量抗原检测系统，利用该技术可检测牛乳中微量抗生素。大致检测步骤是：将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行产物检测。下列叙述错误的是（ ）
A. 图中的抗体1和抗体2均需要与抗生素特异性结合
B. 第三次冲洗的目的是除去游离的抗体2以避免出现假阳性现象
C. 在PCR扩增过程中，子链的合成均是从5′端向3′端延伸的
D. 可用牛乳蛋白基因的DNA片段作为标记DNA与抗体2相连
【答案】D
【解析】图中的抗体1和抗体2均需要与抗生素特异性结合，A正确；如果第三次冲洗不充分，可能使残留的、呈游离状态的抗体2上的DNA也作为PCR的模板参与扩增，会出现假阳性现象，B正确；PCR扩增过程中，子链的合成方向都是由5′端向3′端延伸的，C正确；若图示中的标记DNA用牛乳蛋白基因的DNA片段，经过PCR扩增后的产物中，可能有牛乳中本身含有的牛乳蛋白基因片段的扩增产物，使检测结果出现假阳性现象，D错误。
6．（2025·辽宁大连质检）科研人员利用双温PCR技术对猪早期胚胎进行性别鉴定，双温PCR是一种通过合并复性与延伸步骤优化反应效率的核酸扩增技术。相较于传统三步法PCR，双温PCR在保持特异性的同时显著缩短反应时间。实验中同时扩增了Y染色体上的SRY基因（雄性特有）和作为内参基因的GAPDH基因（在两种性别中均表达）。关于此项实验，下列说法最合理的是（ ）
A. 为确保DNA聚合酶的最佳活性，复性与延伸步骤的温度应设置为72℃
B. 与常规PCR相比，该技术特异性更高，因此能100%准确鉴定性别
C. 实验结果中，雌性胚胎样本的电泳图谱应仅出现GAPDH基因的条带
D. 该技术缩短反应时间的原因是其变性步骤所需温度更低、时间更短
【答案】C
【解析】复性温度通常较低（50左右），双温PCR合并复性与延伸步骤中复性温度若设为72℃会导致引物无法结合模板，A错误；双温PCR在保持特异性的同时缩短时间，但实验准确性受样本污染、引物设计等因素影响，无法保证100%准确，B错误；雌性胚胎无Y染色体，SRY基因无法扩增，而GAPDH基因在所有样本中均存在，故电泳图谱仅显示GAPDH基因的条带，C正确；双温PCR缩短时间的原因是合并复性与延伸步骤，减少温度转换耗时，而非降低变性温度或缩短变性时间，D错误。
7．（2025·湖北武汉质检）（14分）巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现对目标DNA片段的扩增。第一组外引物大小为25bp，复性温度较高(68℃)，扩增后得到中间产物；第二组内引物大小为17bp，复性温度较低(46℃)，内引物的结合部位在中间产物内部。具体过程如图一所示，回答下列问题：
图一图二
（1） 巢式PCR反应体系中除模板、引物、Mg2+外，还应加入_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ （答出两点即可）等。
（2） 巢式PCR时，复性温度与引物长度呈_ _ _ _ _ _ （填“正相关”或“负相关”）。若使用外引物进行第一次PCR扩增时产生了错误片段，则使用内引物进行第二次PCR扩增时，完成配对并扩增的概率会_ _ _ _ 。由此可知，巢式PCR相较于常规PCR具有的优点是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。
（3） 家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上的雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)，进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植，获得高产奶牛。
① 请将表格内容补充完整：a是_ _ _ _ ；b是_ _ _ _ _ _ _ _ 。
② 巢式PCR产物鉴定结果如图二所示，1～5号为取自不同胚胎的DNA样品，其中符合要求的胚胎是_ _ _ _ 。
【答案】（1） 缓冲液、耐高温的DNA聚合酶（或TaqDNA聚合酶）、4种脱氧核苷酸（或dNTP）
（2） 正相关；下降；特异性强、灵敏度高
（3） ① 4；同期发情
② 1、2、4
【解析】
（2） PCR过程包括高温变性、低温复性、中温延伸，巢式PCR时，复性温度与引物长度呈正相关。巢式PCR时，若使用外引物进行第一次PCR扩增时产生了错误片段，再使用内引物扩增，在错误片段上进行引物配对并扩增的概率会下降，因此，相比于常规PCR而言，巢式PCR特异性强、灵敏度高。
（3） ① 本实验用巢式PCR技术，用的是两轮PCR，因此扩增一种基因片段则需要设计2对引物，而扩增2种基因片段则需要设计4对引物。在胚胎移植前需要对受体奶牛进行同期发情处理，便于移植。
② 题中利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上的雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)并进行电泳，雌性个体没有SRY，只有一条带，雄性有两条带，因此1、2、4是雌性，3、5是雄性，故符合要求的胚胎是1、2、4。实验目的
方法步骤要点
囊胚样品DNA提取
选取滋养层细胞提取DNA
PCR引物的设计和合成
根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计并合成a. 对引物
PCR扩增
预变性→ 变性→ 复性→ 延伸
鉴定分析
采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，确定胚胎性别
b.
对受体奶牛注射前列腺素
胚胎移植
将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内