2026届高三生物二轮专题复习课件第1部分专题9生物技术与工程命题热点9

这是一份2026届高三生物二轮专题复习课件第1部分专题9生物技术与工程命题热点9，共47页。
专题九　生物技术与工程
命题热点九　PCR技术
角度一　PCR技术原理与条件
1．PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键。因此，双链DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。2．PCR过程中使用的耐高温的DNA聚合酶需要Mg2＋激活，因此PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。3．PCR的扩增结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环次数)。
角度二　PCR产物的电泳鉴定1．原理：脱氧核苷三磷酸(dNTP)3′－C上的—OH被—H替换后转化为双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。在PCR反应体系中加入待测DNA片段、4种dNTP、1种32P标记的ddNTP和1种引物及其他所需材料，经扩增后获得不同长度的DNA片段混合物。利用每种32P标记的ddNTP分别进行PCR后，将产物点样在变性凝胶上进行电泳分离，通过放射性自显影检测，就可以读出DNA的核苷酸序列。
2．实例：如图中DNA片段的待测碱基序列5′－TTGGCTGCAA－3′。
角度三　PCR技术的应用实例1．扩增某DNA片段：将引物设计在DNA片段的两端。2．从某一DNA分子上扩增其中一部分：将引物设计在要扩增的DNA片段两端。3．定点突变：在引物的外侧(5′端)加上需要的序列(如限制酶切割位点、特定的启动子或标记序列等)。
1．(2025·苏州模拟)RNA的检测可以采用实时荧光RT－PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法，RT－PCR的具体过程如图，下列叙述正确的是(　　)
A．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶B．过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要2n个引物BC．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度D．PCR反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关【答案】　C
【解析】　PCR体系中需要的是耐高温的DNA聚合酶，不是从受体细胞中提取的DNA聚合酶，A错误；过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时，可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测，C正确；PCR反应中温度呈现周期性变化，其中温度超过90 ℃的目的是双链DNA解聚为单链，然后冷却到50 ℃左右使引物与互补DNA链结合，继续加热到72 ℃左右，目的是在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸。所以PCR反应中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的，D错误。
2．(2025·广州模拟)真核生物核基因的编码区包含外显子和内含子，且在不同细胞中转录时存在可变剪接的现象，即相同的mRNA前体可通过剪接将不同外显子对应的mRNA序列组合成不同的成熟mRNA。图1表示小鼠H基因转录形成的mRNA前体，方框A、B、C、D、E、F代表外显子对应的mRNA序列，a、b、c、d、e、f表示引物，箭头代表转录方向。图2是不同组织细胞中剪接形成的成熟mRNA序列示意图。为验证H基因的转录存在组织差异，研究者分别提取分离小鼠不同组织细胞的成熟mRNA，逆转录成cDNA。然后以cDNA为模板进行PCR，已知该PCR需引物成对存在且只能扩增两种引物之间的序列，则选取引物的组合为(　　)
A．a、c　　　　　　　　　B．d、f　　　　　　　　　C．b、c　　　　　　　　　D．a、f【答案】　D
【解析】　据题图2分析，四种不同的细胞中成熟的mRNA两端都有A和F片段，由题干信息可知该PCR需引物成对存在且只能扩增两种引物之间的序列，因此想要以各种细胞中的cDNA为模板进行PCR，则选取引物的组合为a、f。
3.(2025·衡水模拟)为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们在常规PCR技术的基础上进行了改良，发明了巢式PCR技术。其原理是利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在DNA进行15～30个循环的扩增；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)进行15～30个循环扩增，具体过程如图，下列说法错误的是(　　)
A．巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，但扩增产物比常规PCR特异性更强B．两套引物需要进行两次PCR，由于和两套引物互补的靶序列较少，因此大大提高了扩增的特异性C．内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定D．如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率将会增加【答案】　D
【解析】　巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，包括5种基本成分，依次为引物、耐高温的DNA聚合酶、dNTP(原料)、模板DNA、Mg2＋，但扩增产物比常规PCR特异性更强，A正确；巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更强，B正确；内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，如果利用外引物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增，则内引物可能无法与第一轮的产物进行配对，在错误片段上进行引物配对并扩增的概率将会减小，C正确，D错误。
4．(2025·北京卷)学习以下材料，回答(1)～(4)题。野生动物个体识别的新方法识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年，人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA，PCR扩增特定的DNA片段，测定产物的长度或序列，据此可识别个体，在此基础上可以获得野生动物的多种生态学信息。
微卫星DNA是一种常用于个体识别的DNA片段，广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA是一段串联重复序列，每个重复单位长度为2～6 bp(碱基对)，重复数可以达到几十个(图1)。基因组中有很多个微卫星DNA，分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA可视为一个“基因”，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”，能组成多种“基因型”。分析多个微卫星“基因”，可得到个体特异的“基因型”组合，由此区分开不同的个体。
依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列(图1)，设计并合成特异性引物，PCR扩增后，检测扩增片段长度，即可得知所测个体的“等位基因”(以片段长度命名)，进而获得该个体的“基因型”。例如，图2是对某种哺乳动物个体A和B的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图，个体A的“基因型”为177/183。
有一个远离大陆的孤岛，陆生哺乳动物几乎无法到达，人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上采集貉的新鲜粪便，提取DNA，扩增并分析了10个微卫星“基因”，结果在30份样品中成功鉴定出个体(如表)。几个月后再次采集貉的新鲜粪便，进行同样的分析，在40份样品中成功鉴定出个体(如表)。据此，科学家估算出该岛上貉的种群数量。
两次采样所鉴定出的貉的个体编号
(1)图2中个体B的“基因型”为________。(2)使用微卫星DNA鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和____________的数目决定的。(3)科学家根据表1信息，使用了________________法的原理来估算这个岛上貉的种群数量，计算过程及结果为________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)在上述研究基础上，利用现有DNA样品，设计一个实验方案，了解该岛貉种群的性别比例________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
【答案】　(1)174/174(2)等位基因(3)标记重捕　根据标记重捕法的计算公式N＝(M×n)/m，则该岛上貉的种群数量N＝(24×32)/10≈77(只)(4)从现有DNA样品中，选择Y染色体上特有的微卫星DNA序列，设计特异性引物；对所有DNA样品进行PCR扩增；对扩增产物进行电泳分析，若能扩增出相应条带，则该个体为雄性，若不能扩增出相应条带，则该个体为雌性；统计雄性和雌性个体的数量，从而计算出该岛貉种群的性别比例
【解析】　(1)从题图2中可知，个体B扩增后的电泳条带对应的片段只有长度为174 bp，根据“以片段长度命名”等位基因进而确定基因型的规则，个体B的“基因型”为174/174。(2)根据题干信息“每个位置的微卫星DNA可视为一个‘基因’，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星‘基因’可以有多个‘等位基因’，能组成多种‘基因型’，分析多个微卫星‘基因’，可得到个体特异的‘基因型’组合，由此区分开不同的个体”可知，使用微卫星DNA鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和等位基因的数目决定的。因为微卫星“基因”数目越多，等位基因组合的可能性就越多，能区分的个体数也就越多。
(3)科学家采用了标记重捕法的原理来估算种群数量。第一次采集30份粪便样品鉴定出24个不同个体(相当于标记数M＝24)，第二次采集40份粪便样品鉴定出32个不同个体(相当于重捕数n＝32)，其中两次都有的个体数为10个(相当于重捕中被标记的个体数m＝10)。根据标记重捕法的计算公式N＝(M×n)/m，则该岛上貉的种群数量N＝(24×32)/10≈77(只)。(4)从现有DNA样品中，选择Y染色体上特有的微卫星DNA序列，设计特异性引物。对所有DNA样品进行PCR扩增。对扩增产物进行电泳分析，若能扩增出相应条带，则该个体为雄性；若不能扩增出相应条带，则该个体为雌性。统计雄性和雌性个体的数量，从而计算出该岛貉种群的性别比例。
5．(2024·浙江1月卷)小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其他表型正常。(注：野生型基因用＋＋表示；f杂合子基因型用＋f表示)回答下列问题：
(1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生________________，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了________________而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行________和________。
(2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第________泳道和第________泳道。(3)g小鼠是长毛隐性突变体(gg)，表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是________________________________，则g和f是非等位基因；若杂交结果是________________________________，则g和f是等位基因。(注：不考虑互换；野生型基因用＋＋表示；g杂合子基因型用＋g表示)
(4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型(＋＋)、g杂合子(＋g)和g小鼠(gg)的mRNA，反转录为cDNA后用(2)小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是________________________________________________________________________。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用________________。
【答案】　(1)编码序列错位　氨基酸序列　替换　缺失(2)3　2(3)子代全为野生型　野生型∶突变型＝1∶1(4)基因突变丢失了启动子，导致无法转录出mRNA；反转录没有产物，检测不出结果　抑制毛发生长
【解析】　(1)依据题意，在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生编码序列错位，从而导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA片段引起的，除此之外，还可以缺失或者替换基因中的碱基，从而导致基因突变。(2)从图中看出，野生型基因和f基因都含有2个限制酶HindⅢ的识别序列，但f基因中含有P片段，因此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢，因此推测第1泳道中只有野生型基因，第2泳道中既有野生型基因，又有f基因，第3泳道中只有f基因，因此f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第3泳道和第2泳道。
(3)据题意可知，野生型基因用＋＋表示，g小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg表示，f杂合子小鼠基因型用＋f表示，f基因和g基因位于同一条常染色体上，如果g和f是非等位基因，f杂合子小鼠(＋f/＋＋)与g小鼠(＋＋/gg)杂交，后代为＋＋/＋g和＋f/＋g，全是野生型；如果g和f是等位基因，f杂合子小鼠(＋f)与g小鼠(gg)杂交，后代为＋g∶fg＝1∶1，即野生型与突变型比例为1∶1。(4)据图可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随着一部分DNA片段丢失，无法转录出mRNA，也无法形成cDNA，PCR时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g小鼠泳道没有条带。g小鼠表型与f小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，即没有F蛋白，表现出长毛，说明F蛋白在毛发生长中起抑制作用。
6．(2024·浙江6月卷)阅读下列材料，完成下面小题。疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
(1)下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是(　　)A．F1－R1引物可用于特异性地扩增目的片段B．F1－R2引物不能用于特异性地扩增目的片段C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段
(2)为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。1～6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是(　　)A．1号和6号 B．2号和4号C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号
【答案】　(1)D　(2)B【解析】　(1)根据图乙结果显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确；根据图乙信息可知，F1－R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确；根据图乙信息可知，F1－R1能扩增目的1条带，F2－R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确；根据图乙显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，F1－R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。故选D。
(2)根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组中没有ApⅠ酶切位点，而在敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1～6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，A、C、D错误。故选B。
7．(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为________bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T－DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为________(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T－DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
【答案】　(1)复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SmaⅠ和SpeⅠ　550 bp (2)4　环化　测序和序列比对(3)不能
【解析】　(1)DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaⅠ限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaⅠ酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂基因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHⅠ，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaⅠ和SmaⅠ进行酶切，XbaⅠ酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平(可使重组质粒最小，同时PstⅠ酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶补平，因为DNA聚合酶只能从3′延伸子链)。
利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaⅠ酶切位点和一个SpeⅠ酶切位点，可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切，转录的方向是从模板的3′→5′，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550 bp，若反向接，较短的条带长度近似为200 bp。(2)由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。
由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。(3)突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。