【消灭易错】生物技术与生物工程的科学前沿易错（4大题组）-备战2025年高考生物考试易错题（新高考通用）

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1．酵母菌是一种单细胞真菌，与人类生活息息相关。转基因啤酒酵母用于生产乙肝疫苗。耐高糖的面包酵母(从自然界酵母种群筛选获得)能利用面团中的糖类等营养物质发酵产生CO2，使面包松软可口；此外，面包酵母含有丰富的氨基酸、维生素和微量元素等，能够增加食品的营养价值。下列相关说法错误的是( )
A．酵母菌细胞呼吸产生CO2的场所有细胞质基质和线粒体
B．通过选择培养、基因工程育种可获得优良性状的酵母菌种
C．做面包、馒头，酿酒等，都是利用酵母菌的无氧呼吸原理
D．酵母菌细胞富含蛋白质、维生素等，可以用作饲料添加剂
易错分析：酵母菌是兼性厌氧单细胞真菌，在发酵工程中运用广泛，做面包、馒头等，是利用酵母菌有氧呼吸产生大量二氧化碳，酿酒则是利用酵母菌的无氧呼吸原理。
【答案】C
【解析】A、酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下进行无氧呼吸，产物是酒精和二氧化碳，有氧条件下进行有氧呼吸，产物是二氧化碳和水，有氧呼吸过程中产生CO2的场所是细胞质基质，有氧呼吸过程中产生二氧化碳的场所是线粒体，A正确；
B、基因工程育种能定向改造生物的性状，因此，通过选择培养、基因工程育种可获得优良性状的酵母菌种，B正确；
C、做面包、馒头等，是利用酵母菌有氧呼吸产生大量二氧化碳实现的，酿酒是利用酵母菌的无氧呼吸原理实现的，C错误；
D、题意显示，面包酵母含有丰富的氨基酸、维生素和微量元素等，能够增加食品的营养价值，因此，可以用作饲料添加剂，D正确。
故选D。
2．我国具有悠久的酿酒文化和历史。《天工开物》中有“古来曲造酒，蘖造醴”的记载，“曲”指由谷物培养微生物所制成的发酵剂，“蘖”指发芽的谷物，“醴”指甜酒。古人在冬季酿酒时，常将谷物封存在陶器中并埋藏于地下进行保温。下列叙述错误的是( )
A．酿酒过程中密封的主要目的是避免杂菌污染，从而提高酒的品质
B．“曲”中含有大量的酵母菌，温度是影响酵母菌生长的重要因素
C．“造醴”时选择“蘖”的原因是发芽的谷物会释放更多的淀粉酶
D．“蘖造醴”时大部分糖的分解和代谢物的生成都在发酵阶段完成
【答案】A
【解析】A、酿酒过程中密封的主要目的是为酵母菌无氧呼吸创造无氧环境，从而提高酒的品质，A错误；
B、“曲”中含有大量的酵母菌，温度是影响酵母菌生长的重要因素，因此发酵过程中温度控制在25℃左右，B正确；
C、“造醴”时选择“蘖”的原因是发芽的谷物会释放更多的淀粉酶，有利于多糖的分解，C正确；
D、“蘖造醴”时大部分糖的分解和代谢物的生成都在发酵阶段完成，此后需要在低温、密闭的条件下保存一段时间继续进行后续发酵，D正确。
故选A。
3．某研究小组采用滤膜法(如图)对冰激凌中大肠杆菌数量是否超标进行检测。已知饮用水标准为1000 mL自来水中大肠杆菌菌落数不能超过3个(37℃培养48 h)。下列叙述不合理的是( )
A．该实验不需要对冰激凌原液进行梯度稀释
B．实验方案应增设一组接种无菌水的组别作为对照
C．稀释涂布平板法不可用于测定冰激凌中大肠杆菌数目
D．伊红-亚甲蓝琼脂培养基属于鉴别培养基
【答案】C
【解析】A、饮用水标准为1000 mL自来水中大肠杆菌菌落数不能超过3个，自来水中大肠杆菌的数量非常少，如果进行梯度稀释涂布，最后培养出来的菌落数目可能不在计数范围内，因此该实验不需要对冰激凌原液进行梯度稀释，A正确；
B、实验方案应增设一组接种无菌水的组别作为对照，来检验培养基是否灭菌合格，B正确；
C、稀释涂布平板法可以通过菌落数来判断冰激凌中大肠杆菌的活菌数，C错误；
D、伊红—亚甲蓝琼脂培养基可用来鉴别大肠杆菌，属于鉴别培养基，D正确。
故选C。
4．农杆菌是植物基因工程中常用到的一种细菌，下表为用来培养农杆菌的LB培养基配方，下图是对培养的农杆菌进行菌落计数的过程。下列叙述错误的是( )
注：酵母浸粉以酵母为原料，经自溶、酶解、浓缩、干燥等工艺制成。
A．上述LB培养基为液体培养基，一般对细菌无选择作用
B．图中所用接种方法为稀释涂布平板法
C．蛋白胨和酵母浸粉可以给农杆菌提供碳源和氮源
D．若b、c、d中菌落数分别为48、57、60，则a中农杆菌约为5.5×107个
【答案】D
【解析】A、培养基配方中无琼脂，为液体培养基，含蛋白胨和酵母浸粉等成分，故不是选择培养基，一般对细菌无选择作用，A正确；
B、图示菌落计数接种所用方法为稀释涂布平板法，B正确；
C、蛋白胨和酵母浸粉可以给农杆菌提供碳源和氮源，C正确；
D、根据计算公式N=C/V×M，a中农杆菌密度约为55/1×106=5.5×107个/mL，a中液体体积为100mL，a中农杆菌总数约为5.5×109个，D错误。
故选D。
5．西凤酒是中国四大名酒之一，其历史悠久，品质上乘。据了解，西凤酒是以土窖池为发酵容器，而多年反复利用的窖池内壁的窖泥中含有多种与酿酒有关的微生物。下列叙述错误的是( )
A．西凤酒的酿造是以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B．窖池中的各种微生物会形成相对稳定的体系，从而不容易被杂菌污染
C．酿酒原料多以高粱、大麦等为主，经发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物
D．若对分离出的酿酒酵母做扩大培养，则需在二氧化碳或氮气环境中进行
易错分析：扩大培养的目的是获得更多酵母菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，更需要有氧环境。
【答案】D
【解析】A、西凤酒的酿造主要依靠酿酒酵母，由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物，故传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的，A正确；
B、窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，且酿造过程产生的酒精也会抑制杂菌的生长与繁殖，使酿造过程不易污染杂菌，B正确；
C、谷物原料如高粱、玉米、大米等富含淀粉，因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物，C正确；
D、酵母菌是兼性厌氧菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，因此，对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的条件下进行，D错误。
故选D。
6．影印接种法是一种用于研究微生物抗药性和筛选突变体的实验技术。为检测某种氨基酸缺陷型菌株，实验人员的实验过程如图所示，其中基本培养基中缺乏某种氨基酸，而完全培养基中含有该种氨基酸。下列叙述正确的是( )
A．影印接种法和稀释涂布平板法相似，每个菌落都由单个菌体发育而来
B．过程②培养时丝绒布先转印至完全培养基上再转印到基本培养基上
C．应从完全培养基上挑选出氨基酸缺陷型菌株用于后续的培养和研究
D．实验结束后对培养皿进行消毒处理后即可再次使用或者废弃
【答案】C
【解析】A、影印接种法和稀释涂布平板法都是微生物学实验中常用的接种方法，用于分离和纯化微生物，菌落不都是由单个菌体发育而来，当两个或多个细胞连在一起时，平板上形成的可能是一个菌落，A错误；
B、进行②过程培养时，为了防止将完全培养基中特定营养成分带入基本培养基，应先将丝绒布先转印至基本培养基上再“复印”至完全培养基上，B错误；
C、在基本培养基中氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全培养基中能够生长，比较基本培养基和完全培养基中的菌落可知氨基酸缺陷型菌株应从基本培养基上没有、完全培养基上对应位置有的菌落中挑选，然后用于后续的培养和研究，C正确；
D、培养皿在使用后通常需要进行灭菌处理，而不是消毒处理。灭菌处理能够更彻底地杀死所有微生物，包括芽孢和孢子等难以杀死的微生物形态。而消毒处理可能只能杀死大部分微生物，但无法确保完全无菌。因此，为了实验的安全性和准确性，培养皿在使用后应该进行灭菌处理，D错误。
故选C。
7．饮用被细菌污染的水后，细菌在消化道内会繁殖并产生毒素，引起急性肠胃炎。某同学利用图1所示方法，检测饮用水的细菌含量，图2为不同稀释度下得到的平板。下列相关叙述不正确的是( )
A．配制图1所示固体培养基时，需要先调整到适宜的pH，再分装、灭菌
B．图1中①～③三个培养皿菌落数的平均值乘稀释倍数即为样品中细菌数
C．图2是稀释涂布平板法的结果，统计的菌落数比活菌的实际数目要少
D．图2所示的平板中，a和c的计数结果不适合用于计算样品中的细菌数
【答案】B
【解析】A、配制图1所示固体培养基时，需要先调整到适宜的pH，再分装、灭菌，A正确；
B、图1中①～③三个培养皿菌落数的平均值乘稀释倍数再乘以10(各接种0.1mL)即为样品中细菌数，B错误；
C、图2是稀释涂布平板法的结果，统计的菌落数比活菌的实际数目要少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，C正确；
D、为了保证结果准确，在每个稀释浓度内，至少要涂布3个平板，而且选择菌落数在30～300的平板进行记数。图2所示的平板中，a中菌落数太多，c中菌落数太少，a和c的计数结果不适合用于计算样品中的细菌数，D正确。
故选B。
8．如图表示从土壤中分离出能分解石油的微生物的实验操作过程：在某地土壤中取样后，经过多次稀释，将稀释液接种到培养基上，经过一定条件培养后，在培养基上发现①②③④⑤五个菌落及透明圈。下列叙述错误的是( )
A．实验所用的土壤样本应选自常被石油污染的土壤
B．通过稀释涂布平板法接种的微生物已被稀释104倍
C．该实验所用培养基的营养成分中唯一碳源来自石油
D．图示五个菌落中，菌落⑤产生的酶分解石油的能力最强
【答案】B
【解析】A、要筛选出分解石油的微生物，所选土壤应来自常被石油污染的土壤，A正确；
B、由图可知，通过稀释涂布平板法接种的微生物已被稀释105倍，其中将土壤加入无菌水中稀释102倍，其后的三次处理又稀释了103倍，B错误；
C、要筛选出分解石油的微生物，所用的培养基应以石油为唯一碳源，该培养基为选择培养基，C正确；
D、图示五个菌落中，菌落⑤的透明圈最大，且菌落较小，说明该菌落产生的酶分解石油的能力最强，D正确。
故选B。
9．生物兴趣小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后(清水淋洗时菌T不会流失)，在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵。下列说法正确的是( )
A．菌T可产生分解纤维素的酶，其分解产物是酵母菌的碳源
B．为了不破坏淋洗液中的营养物质，对淋洗液进行巴氏消毒
C．为提高发酵的乙醇产量，需始终保持发酵瓶处于密闭状态
D．发酵后，产生的乙醇使溴麝香草酚蓝溶液由蓝变绿再变黄
【答案】A
【解析】A、酵母菌不能直接利用纤维素，但菌T能够分泌纤维素酶，纤维素酶能将纤维素最终分解为葡萄糖为酵母菌提供碳源，A正确；
B、淋洗液需要高压蒸汽灭菌，B错误；
C、为提高发酵的乙醇产量，发酵瓶应先通气后密闭，通气时酵母菌大量繁殖，密闭时酵母菌无氧发酵产生乙醇，C错误；
D、溴麝香草酚蓝溶液能检测CO2，但不能检测酒精(乙醇)，检测酒精的是酸性重铬酸钾，D错误。
故选A。
10．某研究小组为研究“使用公筷对餐后菜品细菌数量的影响”，进行了如下实验：①配制培养基并进行灭菌处理；②设置对照组和实验组进行相关操作；③适宜条件培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。下列叙述正确的是( )
A．①过程所使用的培养基为选择培养基
B．②过程中采用平板划线法进行接种
C．在培养基上进行计数后所得菌落数少于实际活菌数
D．使用公筷可以防止传染病的原理是切断细菌的传染源
【答案】C
【解析】A、选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。而这里是为了统计菌落数，不需要选择特定微生物，应该是普通的营养培养基，A错误；
B、平板划线法一般用于分离菌种，而统计菌落数常用稀释涂布平板法，B错误；
C、因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以在培养基上进行计数后所得菌落数少于实际活菌数，C正确；
D、使用公筷可以防止传染病的原理是切断传播途径，而不是切断传染源，D错误。
故选C。
11．谷氨酸是生产谷氨酸钠(味精)的原料，运用发酵工程生产谷氨酸需要用到谷氨酸棒状杆菌，下图1是利用玉米淀粉作为材料制备谷氨酸的流程图。图2是细菌的增长曲线图，其中阶段3表示稳定期，是代谢产物(如谷氨酸)大量积累的时期。下列叙述错误的是( )
A．谷氨酸棒状杆菌与醋酸菌的代谢类型相同
B．培养谷氨酸棒状杆菌和其他所有微生物时均需要添加维生素B
C．发酵工程的中心环节是接种菌种之后的发酵过程
D．在稳定期添加营养物质、流出发酵液有助于提高谷氨酸产量
【答案】B
【解析】A、谷氨酸棒状杆菌与醋酸菌的代谢类型相同都是异养需氧型细菌，A正确；
B、能合成维生素B的微生物，其培养基中不需要添加维生素B，B错误；
C、发酵工程的中心环节是接种菌种之后在发酵罐中的发酵过程，C正确；
D、在稳定期，菌体的生长速度与死亡速度达到平衡，此时及时补充营养物质可以保证菌体的持续生长和代谢，流出发酵液可排出代谢废弃物，从而提高谷氨酸的产量‌，D正确。
故选B。
12．某科研团队在热带雨林土壤中分离获得了高效分解纤维素的细菌，为探究影响其纤维素酶活性的条件，设计了如表所示的实验。下列叙述错误的是( )
A．若试管1和试管2形成对比实验，则①为30℃水浴处理
B．实验结束时，试管1中的纤维素含量可能最低
C．试管3中纤维素酶的空间结构在低温条件下遭到破坏
D．可增加设置其他温度和pH的试管以完善该实验
【答案】C
【解析】A、若试管1和试管2形成对比实验，温度是无关变量，应保证相同且适宜，则①为30℃水浴处理，A正确；
B、试管①条件最接近热带雨林的土壤，实验结束时，试管①中的纤维素含量可能最低，B正确；
C、酶绝大多数是蛋白质，少数是RNA，低温不会破坏纤维素酶的空间结构，C错误；
D、本实验温度梯度和酸碱度梯度设置都比较大，所以可增加设置其他温度和pH的试管以完善该实验，D正确。
故选C。
13．谷氨酰胺酶(PG酶)是一种催化L-β-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨的酶，能增大蛋白质的溶解性，提高食品工业中蛋白质的利用率。研究人员利用谷氨酰胺-甘氨酸(谷氨酰胺-甘氨酸遇热易分解)为唯一氮源从土壤中筛选产PG酶的金黄杆菌，实验过程如图所示。下列叙述错误的是( )
A．该实验不仅筛选出了产PG酶的金黄杆菌，并且还对其进行了计数
B．金黄杆菌在培养基Ⅰ和Ⅲ中的生长速度高于在培养基Ⅱ的生长速度
C．培养基Ⅰ~Ⅲ中的氮源相同，三种培养基都是选择培养基
D．PG酶的活性可以用单位时间内催化L-β-谷氨酰胺水解生成氨的数量来表示
【答案】A
【解析】A、该实验筛选出了产PG酶的金黄杆菌，但从图中的操作看只做了一个平板，所以并没有对细菌进行计数，A错误；
B、培养基I和Ⅲ属于液体培养基，培养基Ⅱ属于固体培养基，微生物在液体培养基中由于和营养物质接触充分，所以代谢和繁殖效率高，故金黄杆菌在培养基I和Ⅲ中的生长速度高于在培养基Ⅱ的生长速度，B正确；
C、培养基Ⅰ~Ⅲ中的氮源相同，三者都可以筛选产PG酶的金黄杆菌，所以都是选择培养基，C正确；
D、由于PG酶可以催化L-β-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，所以PG酶的活性可以用单位时间内催化L-β-谷氨酰胺水解生成氨的数量来表示，D正确。
故选A。
14．柑橘酸腐病是由白地霉引起的柑橘贮藏期常见的病害之一。抗菌肽是一种抑菌活性强、无环境污染的生物多肽，目前已用于多种农业病菌的防治。研究人员研究了抗菌肽对白地霉的抑菌效果，并且对其作用机制进行了探究。回答下列问题：
利用基因工程合成抗菌肽时，基本流程为：克隆目的基因→导入枯草杆菌→筛选菌种→诱导抗菌肽表达→分离纯化→功能研究。
(1)白地霉从柑橘中获得其生长繁殖所需的水、无机盐、 和 等营养物质。
(2)为研究抗菌肽对白地霉的抑菌效果，现用无菌打孔器在果实相同部位打孔，每个打孔处接种相同体积的处理液，比较15天后的病斑直径。各组处理及结果见表。
表中数据表明抗菌肽对白地霉有一定的抑菌效果，且抑菌效果与抗菌肽、病原菌孢子悬浮液接种顺序有关，表中X为 。与第2组相比，第5组抑菌效果更好的可能原因是 。
(3)一般情况下，电导率和离子浓度呈正相关，通过测量溶液电导率可以反映出溶液中离子浓度的大小。研究人员将白地霉孢子与抗菌肽在无菌水中混合，测定电导率，培养一段时间后，再次测定电导率，结果发现电导率明显升高，据此推测抗菌肽抑制白地霉孢子的作用机制可能是 。
【答案】(1) 碳源 氮源
(2) 先接种病原菌孢子悬浮液，2h后再加入抗菌肽溶液 相比第2组，第5组混合后培养2h，使抗菌肽与病原菌孢子充分接触，更有效发挥作用
(3)抗菌肽破坏病原菌孢子的细胞膜，细胞内容物释放
【解析】(1)微生物生长一般都需要水、无机盐、氮源、碳源等营养物质。
(2)根据表中接种处理方式可知，1组只接种病原菌，为对照组，2、3、5组均接种了等量且适量的抗菌肽溶液与病原菌孢子悬浮液，但每组的接种顺序不同，说明自变量为抗菌肽溶液与病原菌孢子悬浮液的接种顺序，2组与5组均为二者先混和，但2组混合后直接接种，5组混合后先培养2h再接种，则结合第3组先加入抗菌肽2h后接种病原菌孢子可分析得出，4组应与3组接种顺序相反，即先接种病原菌孢子2h后再加入抗菌肽溶液；抗菌肽直接作用于病原体，因此先混合培养2h可使二者充分接触，使抗菌肽充分发挥抑菌作用，再接种后，病原菌孢子数量大大减少，引起的病斑直径下降。
(3)白地霉孢子与抗菌肽在无菌水中混合培养一段时间后，溶液电导率明显上升，说明溶液中离子浓度增大，增加的离子只能来源于白地霉孢子细胞中，因此推测推测抗菌肽抑制白地霉孢子的作用机制可能是抗菌肽破坏病原菌孢子的细胞膜，使细胞内容物释放，杀死细胞。
15．为调查某地人工湖的水质状况，科研小组进行了该湖水样中的细菌培养、分离及计数等工作。回答下列问题：
(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是 (填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是 。
(2)通常采用 法检测水样中细菌含量。在接种前应随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是 。
(3)在进行样品稀释时，取10g水样，加 稀释得到101倍稀释液，再从中吸取 (操作过程)得到102倍稀释液，依次类推获得105倍稀释液，在该稀释液倍数下，取3个平板分别接种样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的菌落数分别是156、178、191，则每克样品中的细菌数量为 个。
(4)科研人员将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现，振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。主要原因可能是 。(写出2点即可)
【答案】(1) 蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同
(2) 稀释涂布平板 检查培养基平板灭菌是否合格
(3) 90mL无菌水 1mL注入9mL无菌水中 1.75×108
(4)振荡培养能提高培养液的溶解氧含量；振荡培养可使菌体与培养液充分接触，提高培养液中营养成分的利用率
【解析】(1)葡萄糖只能为细菌提供碳源，硝酸钠为细菌提供无机盐，而蛋白胨既可以为细菌碳源，也可以为细菌提供氮源；不同的细菌生长繁殖的最适宜pH是不同的，因此制备培养基时要根据所培养的细菌的不同来调节培养基的pH。
(2)检测水样中细菌含量通常采用稀释涂布平板法，但在接种前应随机取若干灭菌后的未接种平板先行培养一段时间，以检查平板灭菌是否合格。
(3)检测水样微生物含量的方法为稀释涂布平板法，稀释的方法为，取10g水样，加90mL无菌水稀释得到101倍稀释液，再从中吸取1mL注入9mL无菌水中得到102倍稀释液。以此类推。已知稀释倍数为105倍，取3个平板分别接种样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的菌落数分别是156、178、191，则每个平板中的平均菌落数为175个，则每克样品中的细菌数量为175×10×105=1.75×108个。
(4)荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快，主要原因可能是：振荡培养能提高培养液的溶解氧含量；振荡培养可使菌体与培养液充分接触，提高培养液中营养成分的利用率。
题组二 基因工程
1．下列关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验叙述错误的是( )
A．PCR过程中模板DNA双螺旋结构未发生改变
B．PCR扩增时需通过离心将各组分集中在微量离心管的底部
C．制备琼脂糖凝胶时，需待凝胶溶液稍冷却后加入适量的核酸染料混匀
D．可通过在紫外灯下观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果
易错分析：PCR的原理：利用DNA半保留复制原理，因此新合成的两个DNA分子中，一条链是旧的而另外一条链是新的。
【答案】A
【解析】A、PCR过程中，模板DNA双螺旋的两条链并没有被破坏，通过高温解旋，分成单独的链，每一条旧链作为模板再合成一条新链，这样在新合成的两个DNA分子中，一条链是旧的而另外一条链是新的，A错误；
B、PCR扩增时将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，B正确；
C、琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，因此制备琼脂糖凝胶时，需待凝胶溶液却至常温后(不能完全冷却后加入，否则琼脂糖凝胶呈固体状态)，后再加入适量的核酸染料搅拌混匀，C正确；
D、凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果，D正确。
故选A。
2．据研究，W基因在植物发育和逆境应答过程中发挥重要作用。研究人员将W基因的启动子(PW)与GUS基因相连，构建拟南芥PW-GUS融合植株(GUS为报告基因，其表达产物可催化无色底物变蓝)，用无色底物处理拟南芥幼苗的根，探究W基因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平，下列叙述错误的是( )
A．扩增W基因启动子需2种引物，并在引物3'端加入酶切位点
B．PW和GUS基因进行双酶切后，可通过T4 DNA连接酶连接
C．培养拟南芥无菌苗的MS固体培养基需要用高压蒸汽灭菌法灭菌
D．通过观察根蓝色深浅确认W基因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平
【答案】A
【解析】A、扩增W基因启动子需2种引物，并在引物5'端加入酶切位点，因为子链的延伸是在引物的3＇开始的，A错误；
B、PW和GUS基因进行双酶切后，可通过T4 DNA连接酶连接，因为该连接酶可以连接平末端，也可连接黏性末端，B正确；
C、为了避免杂菌污染，培养拟南芥无菌苗的MS固体培养基需要用高压蒸汽灭菌法灭菌，C正确；
D、题意显示，GUS为报告基因，其表达产物可催化无色底物变蓝，因而可通过观察根蓝色深浅确认W基因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平，D正确。
故选A。
3．数字PCR技术被称为第三代PCR,在核酸定量检测中具有突出优势。该技术通过将一个样本稀释分成几十至几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。据此分析，下列说法正确的是( )
A．数字PCR技术仅适用于样本中目标分子含量较高的材料
B．数字PCR技术遵循的基本原理是DNA的边解旋边复制
C．每个单元中加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
D．每个单元中目标分子的两条子链合成都是从5'端向3'端延伸
【答案】D
【解析】A、数字PCR技术把检测样本稀释后分配到不同的反应单元，在每个单元进行一个或多个目标分子扩增，再对每个单元的扩增结果综合分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。该技术对高、中、低水平的目标分子含量的材料均可实现正确、精密的测定，A错误；
B、数字PCR技术遵循的基本原理是DNA半保留复制，B错误；
CD、每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，需要加入4种脱氧核苷酸的等量混合液、与目标分子特异性结合的两种引物和TaqDNA聚合酶等，两条子链合成是从两种引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C错误、D正确。
故选D。
4．“筛选”是生物技术与工程中常用的技术手段。下列叙述错误的是( )
A．胚胎移植前，需对通过体外受精或其他方式得到的胚胎进行质量筛选
B．制备单克隆抗体时，需从分子水平筛选能产生多种抗体的杂交瘤细胞
C．培育转基因抗虫棉时，需从分子水平及个体水平进行筛选
D．发酵生产中，性状优良的菌种可以从自然界中筛选
【答案】B
【解析】A、胚胎移植前，需对通过体外受精或其他方式得到的胚胎进行质量筛选，挑取质量好，活性强的胚胎进行培养或保存，可以提高胚胎移植成功的概率，A正确；
B、制备单克隆抗体时，在筛选出杂交瘤细胞后，需要进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。上述筛选过程中涉及的抗体检测属于分子水平的筛选，因此，制备单克隆抗体时，需从分子水平筛选能产生所需抗体的杂交瘤细胞，B错误；
C、培育转基因抗虫棉时，在将目的基因导入受体细胞后，需要从分子水平上鉴定目的基因(Bt基因)是否成功导入、稳定存在和表达，还需要通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来从个体水平上确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性和评估其抗性程度，从而筛选出有较好抗虫特性的转基因抗虫棉。所以，培育转基因抗虫棉时，需从分子水平及个体水平进行筛选，C正确；
D、用于发酵工程的性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得，D正确。
故选B。
5．虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CRTR-B)的作用下转化而来，具有抗衰老、增强免疫等功能。杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量合成β-胡萝卜素。科研人员利用“无缝克隆技术”(如图1)构建含BKT基因和CRTR-B基因的表达载体(如图2，3)，导入杜氏盐藻，以实现虾青素的工厂化生产，回答下列问题。
(1)获取目的基因：红球藻是天然虾青素的重要来源，提取红球藻的总DNA为 ，设计特异性引物扩增BKT基因和CRTR-B基因，此过程需要 (至少写两种)。
(2)构建转化载体：
①PCR获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的一端添加对应的同源序列。若将来需要将抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则扩增抗除草剂基因时，设计的引物序列(5,→3,)为 。
A．抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列＋同源序列
B．同源序列＋抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列
C．同源序列＋限制酶识别序列＋抗除草剂基因部分序列
②科研人员利用“无缝克隆技术”同时将BKT基因和CRTR-B基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如图2所示，推测此过程扩增CRTR-B基因所用的引物为 。
③最终形成的重组质粒如图3所示，其中atpA启动子和psbA启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内源性启动子的目的是 。
(3)准备受体细胞：选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行第一次培养，一段时间后，挑取生长良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养。期间可取藻液滴入血细胞计数板，在显微镜下进行计数，第二次培养的目的是 。
(4)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，先用含 的培养基初筛已转化的杜氏盐藻，然后采用 技术检测是否成功转录出β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶的mRNA。
(5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高 ；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免 。
【答案】(1) 模板 dNTP、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液等
(2) C ⑥⑧ ③.确保目的基因正常表达
(3)扩大培养杜氏盐藻
(4) 除草剂 PCR(分子杂交)
(5) 目的基因的表达量 基因污染
【解析】(1)因红球藻是天然虾青素的重要来源，是目的基因的来源，故可提取红球藻的总 DNA为模板，设计特异性引物扩增其 DNA中的 BKT基因和CRTR-B 基因进行PCR扩增，此过程需要 Taq DNA聚合酶(耐高温DNA聚合酶)的催化，同时还需要dNTP、缓冲液等。
(2) ①根据 PCR扩增的原理，在 PCR过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在5’ 端添加对应的同源序列；根据题意，若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，则所需引物(5’一 3’)的序列应为“同源序列十限制酶识别序列十特异性扩增引物序列(抗除草剂基因部分序列)”，C正确.
故选B。
②根据图2所示，要通过“无缝克隆法”同时将 BKT基因和CRTR-B 基因插入质粒，则要保证BKT基因一侧有一致同源序列，另一侧能带上CRTR-B 基因，因此扩增 BKT基因所用的引物为①③ ； 同理，扩增CRTR-B基因所用的引物为⑥⑧。
③启动子是转录的起始信号，选用内源性启动子的目的是防止基因沉默，确保目的基因能表达。
(3)选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养的目的是纯化杜氏盐藻，挑取生长状态良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养的目的是扩大培养杜氏盐藻。
(4) 采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，用含除草剂的选择培养基筛选已转化的杜氏盐藻；而后再通过抗原—抗体杂交实验检测是否成功表达 β-胡萝卜素酮化酶和 β-胡萝卜素羟化酶。
(5) 因每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高目的基因的表达量；且叶绿体基因位于细胞质中，一般不能稳定遗传，因此可避免基因污染。
6．科研人员利用图1所示材料构建重组质粒并导入大肠杆菌，以期获得能监测生物组织或环境中四环素水平的“报警器”。限制酶识别序列及切割位点如下表。TetR基因是一种转录调节基因，GFp基因为绿色荧光蛋白基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ri为复制原点。请回答下列问题：
(1)使用工具酶拼接DNA片段1和2，拼接后的片段连接处部分序列为5＇ 3＇(写出6个碱基)，TetR基因和GFP基因转录的模板链 (“是”或“不是”)该拼接DNM的同一条链。
(2)构建重组质粒时，选择 对质粒和拼接的DNA片段进行酶切，在DNA连接酶的作用下恢复 键。再根据 的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。
(3)将重组质粒导入经 理的大肠杆菌后，在含 的固体培养基中筛选出工程菌。
(4)工程菌监测四环素的原理如图2，当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌 (能/不能)发出荧光，其原因是 。
【答案】(1) TCTAGT或ACTAGA 不是
(2) BamHⅠ，EcRⅠ 磷酸二酯键 琼脂糖凝胶电泳
(3) CaCl2 氨苄青霉素
(4) 能 当环境中含四环素时，抑制TctR蛋白作用增强，解除TctR蛋白对启动子2的抑制作用，使GFP基因能表达出绿色荧光蛋白(GFP蛋白)而发光
【解析】(1)据图1分析可知，DNA片段1两端的限制酶识别序列分别是Xba Ⅰ和EcR Ⅰ，而DNA片段2两端的限制酶识别序列是Spe Ⅰ和BamH Ⅰ，若要让两个DNA片段连接在一起，需要经酶切后获得相同的黏性末端。据表格分析，XbaⅠ和SpeⅠ酶切能获得相同的黏性末端，因此DNA片段1用XbaⅠ酶切，DNA片段2用SpeⅠ酶切，然后在用DNA连接酶将两个DNA片段连接在一起，由于无法得知DNA片段两条链具体的方向，所以在特定工具酶作用下能成功拼接的位点处碱基序列为5’-TCTAGT-3’或5’-ACTAGA-3’；DNA片段1和DNA片段2连接后，两个片段启动子方向相反，故TetR基因和GFP基因转录的模板链不是该拼接DNA的同一条链。
(2)据图可知，重组质粒含有3种酶的酶切位点，且使用工具酶拼接DNA片段1和2后两端的酶是BamHⅠ，EcRI，故构建重组质粒时，选择BamHⅠ，EcRⅠ对质粒和拼接的DNA片段进行酶切；在DNA连接酶的作用下恢复磷酸二酯键；琼脂糖凝胶电泳可以将不同大小的DNA片段分离开，故根据琼脂糖凝胶电泳的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。
(3)钙离子能促进细菌摄 取外源的 DNA，科学家常使用 CaCl2溶液制备感受态细胞，使其处于感受态；图示重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，故将重组质粒导入经CaCl2处理的大肠杆菌后，在含氨苄青霉素的固体培养基中筛选出工程菌。
(4)分析题图可知，当环境中含四环素时，抑制TetR蛋白作用增强，解除TetR蛋白对启动子2的抑制作用，使GFP基因能表达出绿色荧光蛋白(GFP蛋白)而发光，因此当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌能发出绿色荧光。
7．细菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP将特异性底物A蛋白磷酸化，改变A蛋白的活性从而应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y基因(编码蛋白激酶Y)与GFP基因(编码绿色荧光蛋白)拼接成Y-GFP融合基因(Y-GFP基因)，导入载体，并表达出融合蛋白(Y-GFP蛋白)，以分析蛋白激酶Y的功能，实验过程如图所示。回答下列问题。
(1)Y基因含有735个碱基对(bp)，其编码的肽链含有 个氨基酸。通过PCR分别扩增Y基因与GFP基因，配制的两个反应体系中不同的有 (填标号)。
a．模板 b．引物 c．DNA聚合酶 d．反应缓冲液
(2)构建Y基因与GFP基因的融合基因时，应将Y基因中编码终止密码子的序列删除，理由是 。
(3)据图步骤一分析，为确保Y-GFP基因插入载体后完整表达，在构建重组基因表达载体时不能选择EcRI限制酶，理由是 。
(4)为检测Y-GFP蛋白的激酶活性，用Y-GFP蛋白、A蛋白和ATP组合实验，四组实验的条件及电泳结果如图步骤二所示。磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别。若Y-GFP蛋白有激酶活性，则后续实验用磷酸化抗体检测，能从电泳条带检测到信号的是 泳道(从泳道①-④中选填序号)，从Y-GFP蛋白功能角度分析，理由是 ， 利用表达的具有绿色荧光的Y-GFP蛋白还可开展的实验有 (答出1个即可)。
【答案】(1) 244 a、b
(2)核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，蛋白GFP就不能翻译出来
(3)Y基因结构内部含有EcRI限制酶的酶切位点，Y基因结构会被EcRI限制酶破坏
(4) ④ 磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别，A蛋白的磷酸化需要蛋白激酶Y和ATP同时存在 分析A蛋白被磷酸化的水平
【解析】(1)基因片段上的碱基数目与转录出的mRNA上的碱基与转录出的氨基酸数目比例为6:3:1，考虑终止密码子，则该蛋白质最多由735÷3-1=244个氨基酸组成。PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液。进行PCR扩增目的基因时，配制的两个反应体系中不同的有模板(待扩增的DNA片段)、引物。
故选ab。
(2)从构建好的重组质粒上看，GFP基因位于目的基因下游，若构建Y基因与GFP基因的融合基因时设计Y基因中编码终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，蛋白GFP就不能被翻译出来。
(3)据图步骤一中的Y基因信息可知Y基因结构内部含有EcRI限制酶的酶切位点，所以在构建重组基因表达载体时不能选择EcRI限制酶，否则Y基因结构会被破坏。
(4)若Y-GFP蛋白有激酶活性，则A蛋白会被磷酸化，而磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别，所以可以用磷酸化抗体检测是否存在磷酸化的A蛋白。根据电泳结果可知若后续实验用磷酸化抗体检测，能从电泳条带检测到信号的是④泳道。Y-GFP蛋白具有使A蛋白被磷酸化的功能，利用这一特性，还可用表达具有绿色荧光的Y-GFP蛋白来分析A蛋白被磷酸化的水平。
8．石油进入土壤后，会破坏土结构，分散土粒，使土壤的透水性降低，而且石油中的有毒物质能通过农作物进入食物链，最终危害人类。为解决石油污染问题，某科研小组从被石油污染较严重的土壤中分离出了高效分解石油的细菌操作过程如图1所示。欲将高效分解石油的目的基因导入大肠杆菌中。目的基因(转录时以乙链为模板)和运载体质粒的结构如图2所示，LacZ基因编码产生的酶可以催化无色的X-gal分解产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题：
(1)图1中过程②配制培养基时，向培养基中加入的唯一碳源是 。
(2)将石油污染过的土壤样品进行图1中过程④的操作，目的是 。
(3)根据题干提供的信息，在构建重组质粒前，应选择 限制酶分别对质粒和目的基因进行切割，依据是 。
(4)若用EcRⅠ和MfeⅠ对按上述要求构建好的一个重组质粒进行完全酶切，会切成 个片段。
(5)将重组质粒导入大肠杆菌后，接种到添加了 等成分的培养基上，若呈现 色的菌落，即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。
【答案】(1)石油
(2)分离出能分解石油的细菌
(3) MfeⅠ、HindⅢ和EcRⅠ、HindⅢ 目的基因的右侧只有HindⅢ的切割位点，质粒上的其他酶切割不会与其产生相同的黏性末端，所以一定都要选HindⅢ；为了保证酶切后的质粒和目的基因正向连接，要选择质粒的HindⅢ上游的MfeⅠ，MfeⅠ切割会产生与目的基因的左侧EcRⅠ切割产生的黏性末端相同，而用BamHⅠ切割会破坏启动子，故选用MfeⅠ、HindⅢ和EcRⅠ、HindⅢ限制酶分别对质粒和目的基因进行切割为最佳方案
(4)3
(5) 氨苄青霉素和无色的X-gal 白
【解析】(1)科研小组从被石油污染较严重的土壤中分离出了高效分解石油的细菌，则图1中过程②配制培养基时，向培养基中加入的唯一碳源是石油。
(2)将石油污染过的土壤样品进行图1中过程④的操作，以石油为唯一的碳源，则可以分离出能分解石油的细菌。
(3)根据题图信息“图中目的基因以乙链为模板进行转录，则方向是从左往右”、“质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在目的基因左侧，终止子应在目的基因右侧，目的基因右侧只能用HindⅢ切割，质粒上的其他酶切割不会与其产生相同的黏性末端，所以一定都要选HindⅢ；为了保证酶切后的质粒和目的基因正向连接，要选择质粒的HindⅢ上游的MfeⅠ，MfeⅠ切割会产生与目的基因的左侧EcRⅠ切割产生的黏性末端相同，而用BamHⅠ切割会破坏启动子，故选用MfeⅠ、HindⅢ和EcRⅠ、HindⅢ限制酶分别对质粒和目的基因进行切割为最佳方案。
(4)选用MfeⅠ、HindⅢ和EcRⅠ、HindⅢ限制酶分别对质粒和目的基因进行切割，构建的重组质粒含有一个MfeⅠ和2个EcRⅠ酶切位点，则用EcRⅠ和MfeⅠ对按上述要求构建好的一个重组质粒进行完全酶切，会得到3个片段。
(5)标记基因有AmpR和LacZ基因，且已知LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色，故为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在选择培养基中添加氨苄青霉素和X-gal，由于HindⅢ破坏了LacZ基因，含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现白色。
9．某自花传粉植物的药物P的合成依次受染色体上显性基因A、B、D控制。研究人员通过基因工程构建含质粒-A-B-D的大肠杆菌生产药物P，下图为基因表达载体的构建过程，其中AmpR代表氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。引物1序列为5'−GGTCTAGACCTAGG−3'，引物2序列为5'−GGCCATGGGGTTCC−3'。限制酶的识别序列及切割位点(从左向右均为5'→3')为KpnⅠ(GGTAC↓C)、XbaⅠ(T↓CTAGA)、BamHⅠ(G↓GATCC)、NcⅠ(C↓CATGG)。基因B和D转录的模板分别是a链和d链。根据所学知识回答下列问题：
(1)PCR扩增目的基因时，引物的作用是 。常采用 来鉴定PCR的产物。
(2)为保证A基因正确连接到质粒上，需利用PCR1对A基因进行改造，所用引物1和引物2上分别含有 酶的识别序列，则据图判断A基因转录的模板链可能是 。一个A基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。
(3)为了实现图中B基因和D基因的重叠延伸，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物 的5'端添加互补序列。过程②复性过程中会形成多种杂交双链，其中能延伸得到B-D融合基因的为图中 (填字母)杂交形成的DNA。
(4)为保证B-D融合基因与质粒-A按图中方式连接，需要在引物3和引物5中分别添加限制酶 的识别序列。若筛选导入基因A-B-D的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌。
【答案】(1) 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 琼脂糖凝胶电泳
(2) XbaⅠ和NcⅠ m 1/8
(3) 4和6 b'、d'
(4) NcⅠ、BamHⅠ 能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长
【解析】(1)PCR扩增目的基因时，引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR扩增的产物常采用琼脂糖凝胶电泳的方法来鉴定。
(2)据图可知，A基因扩增选择引物1和引物2，结合引物和限制酶识别序列可知，引物1序列为5'−GGTCTAGACCTAGG−3'，对应限制酶XbaⅠ识别序列，引物2序列为 5 ′ − GGCCATGGGGTTCC − 3 ′ ，对应限制酶NcⅠ识别序列。基因转录的起点是启动子，XbaⅠ识别序列靠近启动子，而NcⅠ识别序列靠近终止子，转录的方向是从模板链的3'开始，结合引物的序列方向，说明A基因转录的模板链可能是m。A基因在第一轮循环的时候，产生的两个DNA分子均是一条链含有引物，一条链不含引物，第二次循环时，以不含引物的DNA单链为模板扩增的DNA只有一种引物，以含一种引物的DNA单链为模板进行扩增的DNA含有两种引物，经过4抡循环，共陈胜16个DNA分子，其中有14个含有两种引物，2个含有一种引物，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为1/8。
(3)基因B和D转录的模板分别是a链和d链，要将B基因和D基因重叠延伸，且保证B、D基因的正常表达，需要模板链在DNA的同一条链上，结合图示B基因和D基因的引物可知，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物4和6的 5 ′ 端添加互补序列。引物6与d互补配对，引物4和b互补配对，引物4和引物6的末端互补配对形成杂交双链，因此能延伸得到B-D融合基因的为图中b'、d'杂交形成的DNA。
(4)利用XbaⅠ和NcⅠ限制酶获得质粒-A，为了是B、D基因表达，B、D基因也必须连接在启动子和终止子之间，若选择XbaⅠ，则基因A会被切割破坏，因此只能选择NcⅠ、BamHⅠ的识别序列。由于含基因A-B-D的大肠杆菌没有四环素抗性基因，有的是氨苄青霉素抗性基因，因此应筛选能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。
题组三 细胞工程与胚胎工程
1．细胞培养人造肉是指在特定的培养条件下，在培养基中利用动物干细胞培养出来的动物肉。这种肉和真正的肉类有很多相似之处，目前尚处于研究阶段。科研人员使用猪肌肉干细胞，成功研发出了我国第一块细胞培养人造肉。有关叙述错误的是( )
A．培养猪肌肉干细胞时使用液体培养基，通常需加入血清等天然成分
B．在培养猪肌肉干细胞时需要在95%空气和5%CO2的混合气体培养箱中培养
C．用于传代培养的细胞都需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集
D．幼龄动物的肌肉干细胞增殖能力强，可用于培养人造肉
易错分析：传代培养指的是将分瓶后的细胞培养称为传代培养。在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
【答案】C
【解析】A、动物细胞培养用液体培养基有利于动物细胞的增殖，培养液中需要添加糖、氨基酸、血清等多种营养物质，A正确；
B、在培养猪肌肉干细胞时需要在95%空气和5%CO2的混合气体培养箱中培养，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH，B正确；
C、在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养，C错误；
D、干细胞具有分裂分化的能力，幼龄动物的肌肉干细胞增殖能力强，可用于培养人造肉，D正确。
故选C。
2．动物体细胞融合后染色体核型不稳定，来自某一方的染色体往往随机丢失一至多条这种现象常应用于基因的定位。在甲型流感单克隆抗体的制备过程中，杂交瘤细胞在克隆化培养过程中来自B淋巴细胞的染色体往往出现随机丢失现象。下列叙述正确的是( )
A．注射甲型流感疫苗后，应立即从相关动物的脾脏中获得B淋巴细胞
B．杂交瘤细胞在培养过程中出现接触抑制现象时可使用胰蛋白酶处理
C．若杂交瘤细胞丢失某染色体后不能分泌单克隆抗体，则该基因位于该染色体上
D．利用抗体检测筛选的杂交瘤细胞克隆化培养将具有持续产生甲型流感抗体的能力
【答案】C
【解析】A、注射甲型流感疫苗后，一段时间后从相关动物的脾脏中获得B淋巴细胞(实际上是浆细胞)，因为B淋巴细胞增殖和分化为浆细胞需要一定的时间，A错误；
B、杂交瘤细胞具有骨髓瘤细胞的特征，能无限增殖，培养过程中一般无接触抑制现象，不需要用胰蛋白酶处理，B错误；
C、分泌单克隆抗体的基因位于染色体上，因此与亲代杂交瘤细胞相比较，若减少某条染色体后分泌单克隆抗体的功能缺失，说明该抗体的基因位于这条染色体上，C正确；
D、杂交瘤细胞在克隆化培养过程中来自B淋巴细胞的染色体往往出现随机丢失现象，若丢失的染色体含有产生甲型流感抗体的基因，则利用抗体检测筛选的杂交瘤细胞不一定具有持续产生甲型流感抗体的能力，D错误。
故选C。
3．天山雪莲是我国特有濒危物种，含有黄酮类等多种次生代谢物，具有多种医疗功效。研究人员通过植物细胞工程技术对天山雪莲进行了开发、利用。下列叙述错误的是( )
A．可取雪莲的愈伤组织在培养基上培养，诱导其长出芽和根，进而发育成完整植株
B．植物组织培养不同阶段的培养基中植物激素的浓度及比例有所不同
C．利用植物组织培养技术快速繁殖雪莲不受季节、气候等自然因素的限制
D．利用雪莲任何部位的细胞进行植物细胞培养均可持续获得黄酮类物质
【答案】D
【解析】A、植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术；可取雪莲的愈伤组织在培养基上培养，诱导其长出芽和根，进而发育成完整植株，A正确；
B、植物的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向；植物组织培养不同阶段的培养基中植物激素的浓度及比例均有所不同，B正确；
C、利用植物组织培养技术快速繁殖雪莲在室内进行，不受季节、气候等自然因素的限制，C正确；
D、次生代谢不是生物生长所必需的，一般在特定的组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行；黄酮类等物质为次生代谢物，在特定的组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下进行合成，D错误。
故选D。
4．下列有关细胞工程技术的叙述正确的是( )
A．动物细胞培养过程中加入血清的培养基需要进行高压蒸汽灭菌
B．大量制备一种单克隆抗体需要大量的B细胞和骨髓瘤细胞
C．核移植中的“去核”是指去除卵母细胞中的纺锤体-染色体复合物
D．受体母畜对移入子宫的外来胚胎会发生免疫排斥反应
【答案】C
【解析】A、动物细胞培养过程中需要对培养液和培养用具进行灭菌处理，但不需要高压蒸汽灭菌，高温可能会使血清中的物质性质发生改变，A错误；
B、单克隆抗体制备过程中，需要用特定的选择性培养基筛选出杂交瘤细胞，还需要进行克隆化培养和抗体检测，筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，因此大量制备一种单克隆抗体不需要大量的B细胞和骨髓瘤细胞，B错误；
C、核移植中的“去核”是指去除卵母细胞中的纺锤体-染色体复合物，C正确；
D、受体母畜对移入子宫的外来胚胎不会发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体母畜体内的存活提供了可能，D错误。
故选C。
5．我国科学家利用体细胞核移植技术成功克隆了濒临灭绝的某地方牛种。下列叙述错误的是( )
A．从该牛种耳上取的体细胞培养室需在合成培养基中加入血清
B．从牛卵巢中采集的卵母细胞需要在体外培养至MⅡ期
C．代孕母牛为重构胚发育提供空间和营养，不会影响犊牛的遗传物质
D．胚胎移植前需要对供体牛与受体牛进行同期发情处理
易错分析：体细胞核移植技术中，通常不需要对供体进行同期发处理。
【答案】D
【解析】A、由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分，A正确；
B、从牛卵巢中采集的卵母细胞需要在体外培养至MⅡ期才具备与精子受精的能力，B正确；
C、代孕母牛为重构胚发育提供空间和营养，没有为犊牛提供遗传物质，不会影响犊牛的遗传物质，C正确；
D、体细胞核移植技术中，通常不需要对供体进行同期发处理，D错误。
故选D。
6．科学家用蜗牛提取液处理烟草叶片和拟南芥根得到原生质体，两种原生质体经PEG处理后筛选出杂种细胞，其分裂产生的愈伤组织经诱导形成再生植株。经鉴定，再生植株同时表现出烟草和拟南芥的部分性状。下列叙述错误的是( )
A．蜗牛提取液具有纤维素酶和果胶酶活性，可去除细胞壁获得原生质体
B．利用PEG处理可提高细胞膜的流动性，从而促进两种原生质体的融合
C．用较高浓度的细胞分裂素处理杂种细胞产生的愈伤组织，有利于根的分化
D．杂种细胞诱导形成具有双亲部分性状的再生植株是基因选择性表达的结果
【答案】C
【解析】A、植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，根据酶的专一性原理，要分解植物细胞壁应该用纤维素酶和果胶酶，分析题意，科学家用蜗牛提取液处理烟草叶片和拟南芥根得到原生质体，由此可知，蜗牛提取液具有纤维素酶和果胶酶活性，可去除细胞壁获得原生质体，A正确；
B、PEG是一种常用的细胞融合剂，其作用机制主要是通过增加细胞膜的流动性和破坏细胞膜的完整性来促进细胞融合，通过使用PEG，可以使得细胞膜之间的接触面积增大，由此可知，利用PEG处理可提高细胞膜的流动性，从而促进两种原生质体的融合，B正确；
C、由愈伤组织到杂种植株培养过程中，需调整生长素与细胞分裂素比例以诱导根、芽分化，其中诱导生根时生长素与细胞分裂素的比例较高，而诱导芽分化时两者比例较低，因此用生长素与细胞分裂素的比例较高处理杂种细胞产生的愈伤组织，有利于根的分化，C错误；
D、杂种细胞诱导形成具有双亲部分性状的再生植株(发生了细胞分化过程等)是基因选择性表达的结果，D正确。
故选C。
7．我国已将利妥昔单抗、重组人凝血因子Ⅷ、重组人生长激素等多款生物药纳入药品集中大量采购。利妥昔单抗主要用于治疗多种淋巴癌，下列有关单克隆抗体制备的叙述，正确的是( )
A．制备单克隆抗体时要用到骨髓瘤细胞，是因为其能无限增殖
B．细胞融合结束后，两两融合的细胞都能在选择培养基上存活
C．利妥昔单抗能准确识别抗原，只能用于淋巴癌的治疗，不能用于淋巴癌的诊断
D．给小鼠反复注射淋巴癌细胞，从小鼠血清中分离出的抗体为利妥昔单抗
【答案】A
【解析】A、骨髓瘤细胞能无限增殖，但不能产生抗体，B细胞能产生抗体，但不能无限增殖，二者融合后可得到既能无限增殖又能产生抗体的杂交瘤细胞，A正确；
B、细胞融合结束后，两两融合的细胞中只有杂交瘤细胞能在选择培养基上存活，B错误；
C、利妥昔单抗能准确识别抗原，既能用于淋巴癌的诊断，也可用于淋巴癌的治疗，C错误；
D、小鼠会接触到其他的抗原物质，所以从小鼠血清中分离的抗体不一定就是利妥昔抗体，而单克隆抗体是杂交瘤细胞产生的，D错误。
故选A。
8．科研人员研究了不同浓度的聚乙二醇(PEG)对沙打旺和紫花苜蓿原生质体融合率的影响，实验结果如图，虚线代表最高融合率，异源融合率是指不同种的原生质体发生融合的概率，已知PEG浓度较高时对细胞有毒害作用。下列叙述错误的是( )
A．PEG融合法还可用于诱导骨髓瘤细胞与B细胞融合
B．不同种的原生质体的融合依赖于细胞膜具有一定的流动性
C．据图可知，不同PEG浓度下同源融合率均大于异源融合率
D．PEG浓度为35%时诱导紫花苜蓿与沙打旺原生质体融合的效果最好
【答案】C
【解析】A、PEG融合法还可以用于动物细胞融合，A正确；
B、没有细胞膜的流动性，原生质体的融合就不能实现，B正确；
C、柱形图没有体现出同源融合率与PEG浓度的关系，因此，不能表明不同PEG浓度下同源融合率均大于异源融合率，C错误；
D、PEG浓度为35%和40%时异源融合率相同，且均高于其他浓度下的异源融合率，但较低浓度的PEG对细胞的毒害作用较小，D正确。
故选C。
9．成体组织细胞能够被用于两种不同意义的“克隆”，具体流程如图所示。下列有关克隆的叙述正确的是( )
A．图中含“纺锤体”的细胞为MⅡ期卵母细胞，图中代孕母体不需要处理即可植入胚胎
B．经“细胞融合”形成的重组细胞中，细胞质中的遗传物质仅来自成年母体的卵母细胞
C．图中“早期胚胎”内部的空腔为囊胚腔，图中两种“克隆”均需要胚胎移植过程
D．图中成体组织细胞需要培养，在培养前可用机械方法或用胰蛋白酶处理一段时间
【答案】D
【解析】A、应将卵母细胞培养至MⅡ期，再通过显微操作去核，因此图中含有“纺锤体”的细胞是处于MⅡ期的卵母细胞，代孕母需要经过同期发情处理才可植入胚胎，A错误；
B、由图可知，重组细胞是由成体组织细胞注入去核的卵母细胞形成的，因此经“细胞融合”形成的重组细胞中，细胞质中的遗传物质来自成年母体的卵母细胞和另一成体组织细胞，B错误；
C、治疗性克隆不需要形成个体，无需进行胚胎移植，C错误；
D、图中成体组织细胞需要培养，在培养前可用机械方法或用胰蛋白酶处理一段时间，使细胞分散开来，D正确。
故选D。
10．随着动物细胞工程和胚胎工程的迅猛发展，用引进的良种奶牛大量、快速繁殖满足了我国对奶类的大量需求。下图表示畜牧业生产上培育某种优良种牛的两种方法，相关分析错误的是( )
A．通过方法I、Ⅱ培育优良种牛E和F的本质都是有性生殖
B．方法I中B牛的卵子需培育到MⅡ期才具备与精子受精的能力
C．在卵细胞膜和透明带的间隙观察到两个极体可作为受精的标志
D．方法I、Ⅱ获得的胚胎通常需培养至囊胚阶段再移植入D牛的子宫内
【答案】A
【解析】A、方法I是试管牛由受精卵发育而来，为有性生殖；方法Ⅱ为克隆牛通过核移植方式培育而来，为无性生殖，A错误；
B、卵母细胞需培养到减数第二次分裂中期(MⅡ中期)才能与精子结合，B正确；
C、卵子受精的标志是在卵细胞膜和透明带的间隙能够观察到两个极体，C正确；
D、方法I、Ⅱ获得的胚胎通常需培养至桑葚胚或囊胚阶段再移植入D牛的子宫内，D正确。
故选A。
11．胚胎工程技术的应用为优良牲畜的大量繁殖提供了有效的解决办法，如奶牛活体采卵—体外胚胎生产(OPU-IVP)技术，该技术流程如图。已知雄性奶牛Y染色体上有一段雄性特异的高度重复序列，依据该重复序列设计引物，建立了用于奶牛胚胎性别鉴定的PCR体系(SRY-PCR)。下列叙述错误的是( )
A．体外受精后，在透明带和卵细胞膜间观察到两个极体说明受精成功
B．活体采卵前诱导母牛超数排卵所注射的激素只能作用于特定细胞
C．取滋养层细胞进行SRY-PCR，应选择结果为阳性的胚胎进行移植
D．受体母牛不会发生免疫排斥反应，所以移植前不需要进行免疫检查
【答案】C
【解析】A、当在卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到两个极体或者雌、雄原核时，说明卵子已经完成了受精，A正确；
B、活体采卵前诱导母牛超数排卵所注射的激素是促性腺激素只能作用于性腺，所以只能作用于特定细胞，B正确；
C、取滋养层细胞进行SRY-PCR，结果为阳性的胚胎说明其含有Y染色体，为雄性，为多获得可以生产牛奶的奶牛应该选择结果为阴性的胚胎进行移植，C错误；
D、受体不会对外来胚胎发生免疫排斥，因此不需要进行免疫检查，D正确。
故选C。
12．生物技术的进步在给人类带来福祉的同时，也引起人们对它安全性及伦理问题的关注。下列叙述正确的是( )
A．证明转基因食品安全比证明其不安全更容易
B．可用口味、颜色指标判断是否是转基因作物
C．不允许、不接受进行任何生殖性克隆人实验
D．在特殊情况下可利用转基因技术制造致病菌
【答案】C
【解析】A、证明转基因食品安全需要大量的实验、长期的监测等多方面的工作，而要证明其不安全，只要发现一个可能存在的风险点就可以，所以证明转基因食品安全比证明其不安全更难，A错误；
B、不能仅用口味、颜色指标来判断是否是转基因作物，因为很多非转基因作物也可能有各种各样的口味和颜色，B错误；
C、生殖性克隆人会带来严重的伦理道德、社会等多方面的问题，国际上不允许、不接受进行任何生殖性克隆人实验，C正确；
D、利用转基因技术制造致病菌是违背伦理道德和可能危害人类安全的行为，是不被允许的，D错误。
故选C。
13．[多选]骆驼蓬分布在干旱和半干旱地区，能防风固沙。骆驼蓬合成的多种生物碱具有抗肿瘤作用。科研人员利用骆驼蓬下胚轴进行育苗和生物碱提取，过程如下图。下列说法错误的是( )
A．下胚轴切段需依次用酒精和次氯酸钠进行消毒处理
B．除培养基中植物激素比例不同外，进行过程①③的其他条件相同
C．由无毒下胚轴经组织培养获得的骆驼蓬无毒幼苗可抵抗病毒的侵染
D．在①②③过程中利用PEG处理培养物，可以获得染色体数加倍的骆驼蓬
【答案】BCD
【解析】A、为避免杂菌污染，对外植体进行消毒处理的操作为：将流水充分冲洗后的外植体(幼嫩的茎段)用酒精消毒30 s，然后立即用无菌水清洗2～3次，再用次氯酸钠溶液处理30 min后，立即用无菌水清洗2～3次，A正确；
B、进行①和③过程的外界培养条件不同，①过程不需要光照，③过程需要光照，B错误；
C、由无毒下胚轴经组织培养获得的骆驼蓬无毒幼苗只是不带病毒，并不是能抵抗病毒的侵染，C错误；
D、因植物细胞外面的细胞壁阻碍了细胞间的杂交，所以在①②③过程中利用PEG处理培养物，不能获得染色体数加倍的骆驼蓬，D错误。
故选BCD。
14．[多选]华西牛是我国育种专家培育的具有完全自主知识产权的专门化肉牛新品种，打破了我国肉牛种源严重依赖进口的局面。科研人员在生产中采取胚胎工程的手段实现了华西牛的快速繁育。下列叙述正确的是( )
A．采集的华西牛精子需要进行获能处理后在适当的培养液中完成受精
B．可以采用孕激素对华西牛母牛进行超数排卵处理，以发挥其繁殖潜力
C．受体母牛需健康且具有正常的繁殖能力，胚胎移植前需要对其进行同期发情处理
D．犊牛的遗传性状由华西牛公牛及母牛决定，不受受体母牛的影响
【答案】ACD
【解析】A、采集的精子需要获能处理后在适当的培养液中完成受精，A正确；
B、应采用促性腺激素对华西牛母牛进行超数排卵处理，B错误；
C、受体母牛需健康且具有正常的繁殖能力，胚胎移植前需要对其进行同期发情处理，C正确；
D、犊牛的遗传物质来自华西牛公牛及母牛，因此遗传性状由华西牛公牛及母牛决定，不受受体母牛性状的影响，D正确。
故选ACD。
15．“人造精子”是一种可替代精子使卵细胞“受精”的单倍体胚胎干细胞。科学家将某种动物单倍体胚胎干细胞注射到卵细胞中成功培育出健康的该种动物。该技术不仅为动物模型的获得提供了新手段，同时也为动物生殖、遗传与发育调控机理研究提供了新思路。右图是科研人员利用胚胎操作技术，通过两种方式获得重组细胞，进而培育出该种动物“人造精子”的流程。请回答下列问题：
(1)方式一成功获得“人造精子”的关键操作是及时去除 的细胞核。
(2)方式二中选择卵母细胞作为受体细胞的原因是卵母细胞具有 (答两点)的优点，操作中注入完整的精子而非精子的细胞核，原因是 。
(3)目前，构建成功的该动物单倍体胚胎干细胞系，均为性染色为X染色体的细胞系，无法获得性染色体为Y的单倍体胚胎干细胞系，这与该生物Y染色体比X染色体短小有关。据此推测可能的原因是 。若将成功构建的“人造精子”与卵细胞结合繁殖正常的二倍体动物，该动物的性别是 。
【答案】(1)卵母细胞
(2) 体积大、易操作、营养物质丰富等 卵母细胞需要借助精子中的物质来完成减数分裂等一系列过程，如果只注入精子的细胞核则无法完成这些过程。
(3) Y染色体比X染色体短小，其携带的基因较少，可能缺乏维持单倍体胚胎干细胞系构建和发育所必需的基因。 雌性
【解析】(1)分析题图可知，在方式一中，一般用显微操作法对MⅡ中期卵母细胞去核，方式一成功获得“人造精子”的关键操作是及时去除卵母细胞的细胞核。
(2)从形态结构方面考虑，卵母细胞作为受体细胞具有体积大，易操作、营养物质丰富等优点，故方式二中选择卵母细胞作为受体细胞；操作中注入完整的精子而非精子的细胞核，原因是卵母细胞需要借助精子中的物质来完成减数分裂等一系列过程，如果只注入精子的细胞核则无法完成这些过程。
(3)该实验无法获得含Y染色体的单倍体胚胎干细胞，其最可能原因可能是Y染色体上的基因无法支持单倍体胚胎干细胞的存活(或Y染色体上缺少支持单倍体胚胎干细胞存活的基因)。根据题干信息：构建成功的该动物单倍体胚胎干细胞系，均为性染色为X染色体的细胞系，无法获得性染色体为Y的单倍体胚胎干细胞系，故若将成功构建的“人造精子”与卵细胞结合繁殖正常的二倍体动物，该动物的性别是雌性。
16．生命孕育的过程是神奇和复杂的，包括受精卵的形成和胚胎发育。回答下列问题：
(1)在受精过程中，为保证1个卵母细胞只结合1个精子，卵细胞会发生相关生理反应，发生这些生理反应的结构依次为 、 。
(2)受精卵形成后即在 (填“卵巢”“输卵管”或“子宫”)内进行有丝分裂，这一阶段在透明带内进行，细胞只分裂不生长，胚胎体积 ，以确保胚胎顺利从受精场所适时输出。随后，透明带破裂、胚胎从中伸展出来继续发育，这一过程称为 。
(3)胚胎发育时，母体通过形成透明纤维层，防止胚胎细胞植入过深而损伤子宫内膜；胚胎的胎盘细胞则分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，抑制母体淋巴细胞的活动；此后胎儿为了获得更多的养料，还会导致母体的血压升高，促进更多血液流入子宫，以获得更多的营养。
①胎盘是由囊胚的 发育而成的。
②母体对胎儿不会发生免疫排斥反应，由题分析，其原因可能是 。
③HCG可通过肾小球从尿液中排出。用抗HCG单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以通过检查尿液作出诊断。请简述利用从经HCG免疫的小鼠体内采集的B淋巴细胞(简称B淋巴细胞)、小鼠骨髓瘤细胞制备抗HCG单克隆抗体的主要流程： (用箭头和文字表示)。
【答案】(1) 卵细胞膜外的透明带 卵细胞膜
(2) 输卵管 基本不变 孵化
(3) 滋养层细胞 胎盘细胞分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，抑制母体淋巴细胞的活动，阻止排斥反应的发生
【解析】(1)在受精过程中，为保证单精入卵，卵细胞会发生相关生理反应，发生这些生理反应的结构依次是卵细胞膜外的透明带、卵细胞膜。
(2)受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂，这一阶段在透明带内进行，细胞只分裂不生长，胚胎体积并不增加(或基本不变)，以确保胚胎顺利从受精场所适时输出。随后，透明带破裂、胚胎从中伸展出来继续发育，这一过程称为孵化。
(3)①胎盘是由囊胚的滋养层细胞发育而成的。
②依据题干信息：“胚胎的胎盘细胞则分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，抑制母体淋巴细胞的活动”，因而会阻止母体对胎儿发生免疫排斥反应。
③利用从经HCG免疫的小鼠体内采集的B淋巴细胞(简称B淋巴细胞)、小鼠骨髓瘤细胞制备抗HCG单克隆抗体的过程中，抗原是HCG，依据单克隆抗体的制备流程，可知制备抗HCG单克隆抗体的主要流程为：
题组四 生物与技术与工程综合
1．(2024·北京·高考真题)啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。
(1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。
(2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数(图甲)。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。
(3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢(H2O2)浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。
(4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。
【答案】(1) 酒精/C2H5OH ATP
(2)无氧取样，无氧培养
(3)不能，因为没有“接触 O2 后，酵母菌内源 H2O2 浓度上升”的证据
(4)过氧化氢酶/H2O2 酶
【解析】(1)酵母菌在密闭发酵罐中进行无氧呼吸，会产生酒精(C2H5OH)和CO2。有氧培养时，酵母菌进行有氧呼吸，有机物被彻底氧化分解，产生大量能量，而无氧呼吸中有机物不能彻底分解，只产生少量能量，故有氧培养时酵母菌增殖速度明显快于无氧培养。
(2)由图甲结果可知，无氧/无氧条件下，菌落数最多，因此有利于保留占比很低菌种的采集条件是无氧/无氧。
(3)依据图乙结果可知，随着H2O2浓度的持续上升，酵母菌存活率下降(酵母菌受损程度加深)，但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2浓度会持续上升，因为没有“接触 O2 后，酵母菌内源 H2O2 浓度上升”的证据。
(4)过氧化氢酶能催化H2O2分解出现明显气泡，因此实验结果说明，酵母菌可通过产生过氧化氢酶以抵抗H2O2的伤害。
2．嵌合抗原受体-T细胞(CAR-T细胞)疗法在人类肿瘤治疗中取得了重要突破。CAR-T细胞疗法是将CAR基因导入T细胞成为CAR-T细胞，通过CAR蛋白上的scFv肽链(小肽不足以发挥抗原作用，但能发挥抗体识别作用)特异性识别肿瘤细胞膜上的抗原，并通过CAR蛋白上的其它肽链结构激活CAR-T细胞继而杀伤肿瘤细胞。回答下列问题：
(1)获得含有scFv肽链的单克隆抗体，流程如图。
①图中通过驱动细胞和测试细胞反复免疫小鼠产生抗体的过程属于 (填“细胞”或“体液”)免疫，参与该过程的免疫细胞来源于小鼠骨髓 。实验小鼠机体产生免疫应答的过程中，辅助性T细胞的主要作用是 。该实验最适用于筛选 (填标号)。
A．大鼠肝细胞区别于兔肝细胞特殊抗原的抗体
B．正常细胞区别于感染HIV细胞内特殊抗原的抗体
C．衰老神经细胞区别于正常神经细胞抗原的抗体
②取第二组小鼠分离脾细胞，加入 诱导脾细胞和骨髓瘤细胞的融合。
(2)CAR基因的构建，流程如下图。
在设计添加CAR基因两端限制酶识别序列并与表达载体正确连接的过程中，必须考虑的有_________(填标号)。
A．PCR使用的上、下游引物需含限制酶识别序列
B．CAR基因内可以含有引物所含限制酶识别序列
C．限制酶识别序列需位于载体启动子、复制原点和标记基因内
D．上、下游引物所含限制酶识别序列不同
E．CAR基因插入载体位点需位于启动子下游
(3)从免疫学角度分析，如果用高特异性抗体DNA直接构建CAR基因，再通过载体导入T细胞并稳定表达，不但会使治疗效果大幅降低，同时还会 。
【答案】(1) 体液 造血干细胞 分泌细胞因子，促进B细胞增殖分化，同时其受刺激后细胞表面的分子发生特异性变化后与B细胞接触，参与B细胞的激活 AB 聚乙二醇
(2)ADE
(3)导致CAR蛋白攻击其他正常细胞，使机体受损
【解析】(1)①产生抗体的过程属体液免疫，参与该过程的免疫细胞由小鼠骨髓造血干细胞分化而来。实验小鼠机体产生免疫应答的过程中，辅助性T细胞的主要作用是分泌细胞因子，促进B细胞增殖分化，同时其受刺激后细胞表面的分子发生特异性变化后与B细胞接触，参与B细胞的激活。
单克隆抗体可识别不同的抗原，即可用于筛选大鼠肝细胞区别于兔肝细胞特殊抗原的抗体，正常细胞区别于感染 HIV 细胞内特殊抗原的抗体，但衰老神经细胞区别于正常神经细胞抗原的抗体是相同的，不能进行筛选，AB 正确，C 错误。
故选 AB。
②诱导动物细胞融合常采用灭活的仙台病毒或聚乙二醇。
(2)A、PCR使用的上、下游引物需含限制酶识别序列，以保证扩增出的DNA可被限制酶识别，A正确；
B、CAR基因内不能含有引物所含限制酶识别序列，以免在酶切时破坏目的基因，B错误；
C、限制酶识别序列需位于载体启动子和终止子内，以保证基因的正常转录，C错误；
D、上、下游引物所含限制酶识别序列不同，以避免目的基因和质粒自身环化或反向连接，D正确；
E、CAR基因插入载体位点需位于启动子下游，以保证基因的整张转录，E正确。
故选ADE。
(3)由题意可知，scFv肽链不足以发挥抗原作用，但能发挥抗体识别作用，如果用高特异性抗体DNA直接构建CAR基因，再通过载体导入T细胞并稳定表达，不但会使治疗效果大幅降低，由于缺少scFv的识别作用，可能会导致CAR蛋白攻击其他正常细胞，导致机体受损。
3．研究人员利用基因编辑技术和体细胞克隆技术成功获得了载脂蛋白E(ApE)基因和低密度脂蛋白受体(LDLR)基因双敲除(即两个基因都失活)的五指山小型猪，该小型猪在饲喂普通饲料的情况下会出现高血脂，并能自发产生明显的动脉粥样硬化(AS)，为后继研究提供了重要的AS动物模型。
回答下列问题：
(1)基因编辑载体构建。从 中获取猪的ApE和LDLR基因序列，设计相应引物，人工合成。将pX458质粒酶切后电泳，加样孔在 极一端，上样缓冲液中需要加入少许 ，它迁移速度较快，在其迁移出凝胶前停止电泳。胶回收产物与引物连接，转化处于 的大肠杆菌，经过筛选、DNA测序确认目标大肠杆菌，将菌液扩增培养，提取质粒备用。
(2)体细胞电转和鉴定。用 擦拭30日龄雌性和雄性猪耳朵消毒，剪取耳组织，眼科剪剪碎，用胰蛋白酶或 等分散耳组织，筛选分散细胞中的成纤维细胞作为初始材料进行 培养。贴壁细胞达到生长基质80%表面面积后，37.5℃，用0.1%胰蛋白酶处理2分钟，加入5倍体积的细胞培养液以 ，制成细胞悬液。将质粒和成纤维细胞置于离心管中，用电击法处理，分选、鉴定、 得到目标成纤维细胞株。
(3)细胞核移植。从屠宰场收集卵巢，人工抽取卵母细胞，在培养液中培养42~44小时至其 ，去除细胞核，将目标成纤维细胞与去核卵细胞进行电融合，电融合可以促进细胞融合，同时还起到 的作用。
(4)胚胎移植。由于 ，胚胎移植成为胚胎工程中获得后代的唯一方法。选择手术移植前一天开始 的母猪作为代孕母体，将发育良好的囊胚植入输卵管，共出生健康的F0代雌性仔猪22头，雄性仔猪10头。
(5)仔猪鉴定、检测和繁育。提取仔猪耳部细胞DNA，PCR扩增目的基因，PCR时预变性时间较长的目的是 ，以利于引物更好的和模板结合。通过凝胶电泳回收扩增产物，测序结果显示32头仔猪均为ApE和LDLR两基因双敲猪。使用普通饲料饲养克隆猪，产生了明显的AS，这属于 水平的检测。F0代新生仔猪自然交配，F1代仔猪都是ApE和LDLR两基因双敲猪，表明 ，为医学应用提供理想的实验群体。
【答案】(1) 基因(DNA序列)数据库 负 电泳指示剂(溴酚蓝) 感受态
(2) 酒精棉/75%酒精 胶原蛋白酶 原代 终止消化 克隆培养
(3) 成熟 激活重组细胞发育
(4) 无法对哺乳动物进行全体外胚胎培养 发情
(5) 使模板DNA充分变性 个体 F0代仔猪都是ApE/LDLR两基因双敲除纯合子(克隆猪都能稳定遗传)
【解析】(1)可从基因(DNA序列)数据库中获取猪的ApE和LDLR基因序列，设计相应引物，人工合成目的基因。进行电泳时，加样孔在负极一端，电泳时需将待测样品与.上样缓冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，通过该指示剂可显示溴酚蓝在凝胶中的扩散速率，而溴酚蓝在凝胶中的扩散速率比DNA的扩散速率快，故可以防止条带迁移出凝胶。转化即将目的基因导入受体细胞并使其表达，处于感受态的大肠杆菌易于吸收周围的DNA分子，所以选择感受态的大肠杆菌进行转化。
(2)常选用75%的酒精用于消毒。分散动物组织，常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶。初始材料培养称为原代培养。培养一段时间后，细胞贴壁生长，需用0.1%胰蛋白酶处理2分钟，加入5倍体积的细胞培养液以终止消化，制成细胞悬液。将质粒和成纤维细胞置于离心管中，用电击法处理，使质粒转入成纤维细胞，经分选、鉴定、克隆化培养后即可得到目标成纤维细胞株。
(3)从屠宰场收集卵巢，人工抽取卵母细胞，在培养液中培养42~44小时至其成熟(减数第二次分裂中期)，去除细胞核，将目标成纤维细胞与去核卵细胞进行电融合，电融合可以促进细胞融合，同时还可以激活重组细胞，使其开始发育。
(4)目前还不能对哺乳动物进行全体外胚胎培养，只能进行胚胎移植获得后代。对受体母猪需进行同期发情处理，即择手术移植前一天开始发情的母猪作为代孕母体，将发育良好的囊胚植入输卵管，是胚胎进一步发育成完整个体。
(5)高温可是DNA变性，PCR时预变性时间较长的目的是使模板DNA充分变性以利于引物更好的和模板结合。题干所述检测是对仔猪进行检测，属于个体水平的检测。F0代新生仔猪自然交配，F1代仔猪都是ApE和LDLR两基因双敲猪，不出现性状比，表明亲本是F0代仔猪都是ApE/LDLR两基因双敲除纯合子。
4．抗性淀粉是指在小肠中不能被消化吸收但能够作为肠道中某些消化细菌的底物。由于其不能被快速分解，相比与其它淀粉来说具有较低的升糖指数，在饮食上可一定程度的缓解糖尿病。除此之外，抗性淀粉还有降低胰岛素反应、调节肠道功能、能防止脂肪堆积等生理功能，因此其作为一种新型的膳食纤维，正在被广泛追崇。抗性淀粉(RS)的含量与直链淀粉与支链淀粉的含量比成显著相关。可以通过提高直链淀粉的含量来提高 RS 的比例。
水稻是我国的主要粮食作物，是人体淀粉的重要来源。研究者设想特异性编辑水稻品种“嘉花 1 号”的淀粉分支酶基因，通过降低或抑制该基因的正常表达，从而影响该酶功能，减少支链淀粉的合成，升高直链淀粉和支链淀粉之间的比例，达到抗性淀粉上升的目的。
(1)如图1是水稻中淀粉的转化情况。分析可知，淀粉分支酶 (填“SSS”“GBSS”或“SBE”)是支链淀粉形成过程中的关键酶。
(2)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除或破坏目标基因(靶基因)其工作原理如2所示。
研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，从功能上看，细菌体内的Cas9类似于基因工程中的 ，推测细菌中Cas9存在的意义： 。现要定位目标DNA上淀粉分支酶基因将其破坏，若靶序列为5'-AGCAT……GTACCT-3'，则设计的向导RNA中相应的序列应为5' 3’。
(3)自然界中的水稻不存在CRISPR/Cas9系统，可以利用基因工程技术。为了导入CRISPR/Cas9系统需要获取哪些基因？ 。
科研团队选择利用农杆菌转化法将含CRISPR/Cas9系统导入水稻细胞内。
这里所用的载体是 ，选择它的原因是 。
基因工程操作流程如下：
获取目的基因→构建重组质粒→转入 →导入水稻叶细胞→筛选得到含CRISPR/Cas9系统的水稻细胞→ 得到目标水稻植株，可从哪些方面去检测和鉴定得到的水稻是否达标？ (写1点即可)。
【答案】(1)SBE
(2) 限制酶 切割外源DNA使之失效，以保证自身安全 AGGUAC……AUGCU
(3) 编码Cas9的基因和SgRNA的基因 Ti质粒 Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞染色体的DNA上 农杆菌 植物组织培养 对基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻的淀粉分支酶基因(SBE基因)的序列进行测序判断是否产生有意义的突变；比较基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻 SBE基因的表达情况；比较基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻植株直链淀粉与直链淀粉的比例
【解析】(1)由图分析可知支链淀粉的形成需要从ADP-葡萄糖在SSS作用下形成可溶性直链淀粉，在SBE的作用下转化为支链淀粉，所以淀粉分支酶SBE是支链淀粉形成过程中的关键酶。
(2)题中描述Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除或破坏目标基因，所以它是类似于基因工程中的限制酶。细菌是原核生物，没有复杂系统抵御外来进入的核酸，所以靠Cas9可切割外源DNA使之失效，以保证自身安全。 向导RNA的作用是引导Cas9蛋白在特定的基因位点进行切割，据此推测向导RNA需与目标基因靶序列结合，根据碱基互补配对原则其序列应为 3'-UCGUA……CAUGGA-5'所以此处5'—>3'应填AGGUAC……AUGCU。
(3)CRISPR/Cas9系统由向导RNA和Cas9蛋白两部分构成，所以需获取编码Cas9的基因和SgRNA的基因，才能在受体细胞内合成CRISPR/Cas9系统。农杆菌转化用的是Ti质粒， Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞染色体的DNA上。用农杆菌转化法要先将重组质粒导入农杆菌，再用农杆菌去侵染植物细胞；由水稻叶细胞得到植株需进行植物组织培养。目标植株的检测可以从基因角度，看编辑后的SBE基因有没有被破坏或敲除，即发生有效突变；还可以检测基因的表达情况，看编辑后的SBE基因与原基因相比，其转录的mRNA或翻译的SBE酶含量是否下降；还可以检测转基因植株的直链淀粉与直链淀粉的比例，因此若要鉴定水稻是否达标，可对基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻的淀粉分支酶基因(SBE基因)的序列进行测序判断是否产生有意义的突变；比较基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻 SBE基因的表达情况；比较基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻植株直链淀粉与直链淀粉的比例。
蛋白胨
10.0g
酵母浸粉
5.0g
NaCl
10.0g
蒸馏水
1L
配制完成后，将pH调至7.0
试管
底物和试剂
实验条件
1
纤维素+2mL纤维素酶溶液
30℃水浴；pH=7
2
纤维素+2mL纤维素酶溶液
①______；pH=3
3
纤维素+2mL纤维素酶溶液
0℃水浴；pH=②______
组别
1
2
3
4
5
接种处理方式
接种一定体积的病原菌孢子悬浮液
抗菌肽溶液与病原菌孢子悬浮液混合后直接接种
先加入抗菌肽溶液，2h后接种病原菌孢子悬浮液
X
抗菌肽溶液与病原菌孢子悬浮液混合，培养2h后接种
15天后病斑直径/mm
41.3
13.9
29.3
28.7
11.2
限制酶
EcRⅠ
XbaⅠ
SpeⅠ
BamHⅠ
识别序列及切割位点
限制酶
BamHⅠ
EcRⅠ
MfeⅠ
KpnⅠ
HindⅢ
识别序列和切割位点
G↓GATTC
G↓AATTC
C↓AATTG
GGTAC↓C
A↓AGCTT