第十单元　专题突破10　综合PCR的基因工程问题-2025年高考生物大一轮复习课件

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阐述常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR等的过程与原理，举例说明不同的PCR技术有着不同的应用。
类型一　利用PCR技术获取目的基因
获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。
1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是
A.第一轮复制得到2个DNA分子， 即①②各一个B.第二轮复制得到4个DNA分子， 即①②③④各一个C.第四轮复制得到16个DNA分子， 其中有4个X基因D.经五轮循环后产物中有五种不 同的DNA分子
类型二　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
2.(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_________________。
重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
类型三　利用PCR技术引导基因定点突变
3.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________________来完成。(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为________(假设引物为单链DNA)。
(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为__________________________________________________________。
引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用
(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是_________________________________________________________________。
M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段
利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。
类型四　利用PCR技术扩增未知基因序列
4.(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcR Ⅰ是一种______________________酶，它通过识别特定的___________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化___________________________。
以DNA为模板的DNA链的延伸
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。
类型五　利用PCR技术快速检测病原体
5.猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过_____________原则而特异性结合。
②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈________(填“正相关”或“反相关”)关系。
(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有___________________________________________________________。
聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就_______。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为________。
(4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有____。a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值b.样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 c.病毒发生变异
一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。1.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是A.用PCR方法扩增目的基因时不需 知道基因的全部序列B.设计引物时需要避免引物之间形 成碱基互补配对而造成引物自连C.复性温度过高可能导致PCR反应 得不到任何扩增产物D.第四轮循环产物中同时含有引物 A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16
2.PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是A.PCR第5个循环，消耗了16对引物B.脱氧核苷酸作为扩增的原料，会 依次连接到引物的5′端C.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2＋等D.用图中引物扩增至少4个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的 产物
3.(2024·威海高三模拟)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是A.过程①需要把两对引物同时加入一 个扩增体系以提高扩增效率B.过程①需要2轮PCR才能得到图中所 示PCR产物C.过程②的产物都可以完成延伸过程D.若过程④得到16个突变基因则需要 消耗15个通用引物RP2
4.反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述不正确的是A.过程①用同一种限制酶对未知序列两端进 行切割B.过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二 酯键C.过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚 合酶和解旋酶D.该技术可检测T－DNA整合到植物染色体DNA的位置
5.(2024·泰州高三联考)IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，如图所示。下列说法错误的是A.PCR1中使用的引物有引物A、引物CB.PCR2中使用的引物有引物B、大引物b链C.PCR1过程需要扩增3轮才能获得目标产物D.PCR2过程中，为减少错误DNA片段的产生可适 当升高复性温度
6.(2024·苏州高三调研)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列相关叙述错误的是A.PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、 延伸3个阶段B.耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形成磷 酸二酯键C.最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA 的含量呈正相关D.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。7.(2024·衡阳高三质检)研究人员用图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点)，将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。下列叙述正确的是A.构建重组质粒的过程应选用BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ两种限制酶B.使用DNA连接酶将酶切后的质粒和 目的基因片段进行重组C.能在添加四环素的培养基上生存一 定是含有重组质粒的大肠杆菌D.利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙
8.(2024·南通高三调研)如图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T－DNA插入的具体位置。下列有关说法正确的是A.农杆菌在自然条件下主 要侵染单子叶植物和裸 子植物，T－DNA存在 于其Ti质粒上B.利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列C.若扩增循环n次，需要2n＋1－2个引物D.将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T－DNA的插入位置
9.实时荧光定量RT－PCR技术需要在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光探针，荧光染料能特异性掺入DNA双链中，从而发出荧光信号。在流感流行季节，对怀疑流感病毒感染的患者，可以通过实时荧光定量RT－PCR技术进行核酸检测。下列相关叙述不正确的是
A.图中的探针可能是利用荧光分子 标记的流感病毒独特的基因序列B.核酸检测是通过检测荧光信号来 确定样本中是否有病毒核酸的C.PCR技术利用了DNA双链复制的 原理，需要解旋酶和耐高温的 DNA聚合酶的催化D.用荧光RT－PCR技术测定病毒的 核酸具有特异性
三、非选择题10.(2023·江苏，22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有____________，扩增程序中最主要的不同是___________。
(2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________________________。
限制酶、(T4)DNA
(3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。A.稀释涂布平板需控制每个平 板30～300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的原 因一般是培养基温度太高C.抗性平板上常常会出现大量 杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
(5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_____________________________________________________________________。
电泳只能检测DNA分子的大小(长度)，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
11.基因工程在农业方面的应用发展迅速，我国转基因作物的种植面积在世界有较高排名。请回答下列相关问题：(1)目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能，目的基因往往从相关的___________________的基因中进行筛选。
(2)目的基因可以人工合成、从基因文库中获取，还可以利用PCR技术获取和扩增。如图1展示了PCR技术获取和扩增目的基因的原理，请分析回答下列问题：
①PCR技术利用了DNA半保留复制原理和_____________原理。PCR的一次循环包括变性、复性和延伸三个过程，复性的作用是______________________________________。
互补配对与两条单链结合
②将一个DNA分子进行扩增，理论上目的基因最早在第______次循环后获得；第5次循环后，可扩增得到______个目的基因。
(3)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如图所示。图中链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。请回答相关问题：①EcR Ⅰ酶切后得到的—AATT称为黏性末端，“黏性”的含义是___________________________________________，EcR Ⅰ切割得到黏性末端的原因是_______________________________。
切割位点在识别序列中心轴线两侧
②不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是_________________________________。③图4中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是______(填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物______(填“含有”或“不含”)EcR Ⅰ的酶切位点。
端序列未知，无法设计引物
12.乙烯受体是乙烯感受和转导信号的初始元件，广泛存在于各种植物中，并决定植物各种组织对乙烯反应的敏感性。通过对多种植物研究表明，钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体Ers1基因，通过基因工程将Ers1基因反向连接在启动子后，筛选转入反义Ers1基因的草莓，达到延长储藏期的效果。回答下列问题：
(1)草莓DNA的提取：取草莓植株叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉碎后，加入400 μL SDS DNA提取液继续研磨，提取液中含有_____________可防止DNA被水解。待充分研磨后收集至离心管中，离心后取①于另一干净离心管中，加入200 μL异丙醇，离心10 min之后弃去管中的②，加入80 μL体积分数为70%的乙醇，离心5 min之后取③保存。过程中的①②③分别是______________________(填“上清液”或“沉淀”)。
(2)通过上述方法获得DNA后，需要通过PCR技术进行扩增Ers1基因(如图1)。为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物扩增Ers1基因时需添加限制酶XhⅠ的识别序列(5′－CTCGAG－3′)。已知Ers1基因左端①处的碱基序列为－TTCCAATTTTAA－，则其中一种引物设计的序列是5′_______________________3′。在PCR体系中，加入的dNTP可提供___________。PCR产物通过电泳进行分离后，可割下______回收扩增的Ers1基因。
CTCGAGTTCCAATTTTAA
(3)经XhⅠ酶切后的载体和Ers1基因进行连接(如图)，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、Ers1基因与载体正向连接、Ers1基因与载体反向连接。为鉴定这3种连接方式，选择Hpa Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，请在图2中画出电泳结果，需标明电泳片段DNA大致长度。
(4)用______________处理农杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，将筛选得到的反向连接质粒与处理后农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌，完成______实验。将农杆菌涂布接种于添加有卡那霉素的LB固体培养基上，目的是_________________________。
Ca2＋(或CaCl2)
筛选含有重组质粒的农杆菌
(5)用阳性农杆菌感染植物细胞，目的基因就会随__________整合到植物染色体DNA中，最后通过______________技术培育出完整的转基因植株。为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、____________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻，其原因是____________________________________________________________________________。
物与Ers1基因的转录产物碱基互补配对结合，使翻译过程受阻
反义Ers1基因的转录产