2024届高考生物二轮专题复习与测试专题九生物技术与工程高考命题热点十荧光定量PCR技术

这是一份2024届高考生物二轮专题复习与测试专题九生物技术与工程高考命题热点十荧光定量PCR技术，共10页。试卷主要包含了生命观念主要体现，科学思维主要体现，科学探究主要体现，社会责任主要体现等内容，欢迎下载使用。
与PCR技术相关的生物学科素养主要体现角度：
1．生命观念主要体现
(1)物质与能量观：PCR扩增目的基因需要模板、原料并消耗能量。
(2)结构与功能观：PCR仪、微量移液管、微量离心管等的使用以及注意事项。
2．科学思维主要体现
(1)归纳与概括：比较PCR技术和DNA体内复制的异同。
(2)分析与推理：PCR技术中引物的选取。
3．科学探究主要体现
(1)实验操作能力：探究DNA片段的扩增及电泳实验中PCR反应体系的配方的配制以及实验流程中的动手操作能力。
(2)实验现象的观察、分析能力：对DNA片段的扩增及电泳实验结果的观察、分析。
4．社会责任主要体现
PCR扩增的用途包括获取目的基因、对感染疾病(核酸检测)的诊断等。
(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备______________________。
(3)转化后，TDNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图1)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见图2，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DA1基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DA1基因后，应该用同种限制性内切酶核酸对DA1基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(TDNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因，由于TDNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
答案：(1)野生型
(2)运载体 启动子和终止子
(3)①DA1基因和卡那霉素抗性基因 ②75 ③自交 100 图见解析
1．(2023·广东梅州大埔县虎山中学校考模拟预测)新冠病毒的抗原性与感染性与其表面的S蛋白(刺突糖蛋白)密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建S蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。请回答下列问题。
(1)①过程所使用的酶为______，为保证PCR技术扩增S蛋白基因正常进行，该反应体系的主要成分有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
PCR技术中低温复性的目的是__________________。
(2)通过PCR技术可在cDNA分子中专一性扩增出S蛋白基因，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
PCR过程经过4次循环，需要的引物的数量是________个。
(3)构建好的重组质粒长度共2 000bp，用限制酶HindⅢ及限制酶HindⅢ和BamHⅠ分别对重组质粒进行切割并电泳，结果如图乙所示，可推测BamHⅠ在重组质粒上有______个酶切位点。
(4)腺病毒疫苗进入人体后，S蛋白基因利用人体细胞的蛋白质表达系统指导S蛋白的合成，其过程是________________________(用文字和箭头表示)。
解析：(1)①过程是利用RNA合成DNA的过程，是逆转录，需要逆转录酶，PCR过程中，其反应体系的主要成分有模板DNA、脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶；低温复性的目的是让引物结合到互补DNA链。(2)由于在PCR技术中引物是根据S蛋白基因的一段已知序列设计合成的，所以能够专一性的扩增出S蛋白基因。PCR技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n＋1－2，因此若一个该DNA分子在PCR仪中经过4次循环，需要24＋1－2＝30个引物。(3)用HindⅢ将质粒2 000bp切割后形成了形成了200bp、400bp和1 400bp共3个片段，而用HindⅢ和BamHⅠ将质粒切割后形成了200bp、420bp、560bp的片段，2 000＝420×2＋560＋200×3，所以一共形成了6个片段，因此有5个酶切位点，因此BamHⅠ在重组质粒上有5－2＝3个酶切位点。(4)腺病毒载体重组新型冠状病毒疫苗中决定S蛋白产生的为cDNA，S蛋白的产生包括以DNA的一条链为模板合成mRNA的转录过程和以mRNA为模板合成蛋白质的翻译过程，其过程如下：S蛋白的cDNA→转录→mRNA→翻译→蛋白。
答案：(1)逆转录酶 模板DNA、脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶 引物结合到互补DNA链
(2)引物是根据S蛋白基因的一段已知序列设计合成的 30
(3)3
(4)S蛋白的cDNA→转录→mRNA→翻译→蛋白
2．(2023·广东统考模拟预测)DNA条形码相当于物种的身份证，是利用短的标准DNA片段对物种进行快速鉴定的新技术，在发现新物种、保护野生动物、监督外来入侵物种等方面有重要作用。该技术的主要步骤为提取样本DNA、PCR扩增、产物测序及序列比对，最后将结果提交至DNA序列数据库。线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)被公认为动物DNA标准条形码片段并得到广泛应用。
(1)如何判断两个生物是否为同一物种？________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
但该方法不适用于只能进行无性生殖的生物，DNA条形码正好可弥补这一缺陷。
(2)采用稀释涂布平板法和平板划线法能将单个微生物分散在固体培养基上，经培养获得单菌落，最终通过观察菌落的____________等特征来进行初步的物种鉴定。
(3)已知某种动物COXⅠ基因单链的核苷酸序列(虚线处省略了部分序列)为5′—GGTCAACAA…TGAAGTTTA—3′，利用PCR扩增COXⅠ基因时所需的引物序列为(已知引物的长度为9个核苷酸)________________________________和________________________________，所需的酶为______________________________，该酶在实际PCR过程中的最适温度为________。
(4)扩增得到的PCR产物在测序之前一般先通过________对产物进行初步鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与
________________________________________________________________________
等有关，加样之前需要将PCR产物与________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。
解析：(1)能够在自然状态下相互交配并且产生可育后代的一群生物称为一个物种，不同物种间一般是不能相互交配的，即使交配成功，也不能产生可育的后代。(2)采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，经培养获得单菌落。一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，通过观察菌落的形状、大小和颜色等特征可初步进行物种鉴定。(3)由于子链合成的方向是从子链的5′端向3′端延伸，引物选择如箭头所示，，根据碱基互补配对原则，引物为5′—GGTCAACAA—3′和5′—TAAACTTCA—3′。PCR不需要DNA解旋酶，但需要耐高温的DNA聚合酶，该酶在实际PCR过程中的最适温度为72℃。(4)琼脂糖凝胶电泳可对DNA分子进行鉴定，也可实现样品中各种分子的分离。电泳过程中不同DNA分子产生的不同的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，加样之前需要将PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，凝胶载样缓冲液中的指示剂可以显示电泳过程，以便适时终止电泳。
答案：(1)能相互交配且能产生可育后代，则为同一物种；若不能交配或交配后不能产生可育后代，则为不同物种
(2)形状、大小和颜色
(3)5′－GGTCAACAA－3′ 5′－TAAACTTCA－3′ 耐高温的DNA聚合酶 72 ℃
(4)琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 凝胶载样缓冲液(内含指示剂)
3．(2023·广东一模)表面展示技术是通过重组DNA技术，将外源蛋白与细胞表面的蛋白质组装成融合蛋白，从而可展示在细胞表面。回答下列问题。
(1)若要将芽孢表面蛋白基因ctB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，下图中最适合通过绿色荧光(绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光)确定融合蛋白成功表达的是____。
注：Ampr为氨卡青霉素抗性基因；→表示转录方向；UAG，UAA，UGA是终止密码子，AUG是起始密码子。
(2)芽孢表面蛋白是实现表面展示技术的关键蛋白，结合上述材料，试分析该蛋白在表面展示技术中的作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)导入基因表达载体后的芽孢杆菌接种在含有____________的固体培养基上，以获得携带载体的单菌落，该过程被称为微生物的____培养。
(4)培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含________的单菌落，因此还需要对DNA进行提取，常用酒精初步分离DNA和蛋白质，这里酒精的作用原理是________________________________________________________________________
______________。
(5)若要确定表面展示技术在芽孢杆菌上构建成功，应在紫外光环境下对其进行______水平的检测。
解析：(1)若要将芽孢表面蛋白基因ctB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，则需要将ctB和gfp一起表达，即使用一个启动子和终止子，并且ctB在前，gfp在后，才能通过绿色荧光(绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光)确定融合蛋白成功表达，为了能够顺利表达gfp则中间不能出现终止密码子，转录时模板链的方向应是3′到5′，D中mRNA中间会出现终止密码。只有C项符合题意，C项正确。(2)蛋白在表面展示技术中的作用是芽孢表面蛋白是可以定位在细胞表面的，在与外源蛋白形成融合蛋白后，可将外源蛋白展示(定位在芽孢杆菌表面)。(3)由于表达载体中含有Ampr基因，则若转基因成功能够在含有氨苄青霉素的培养基上生长，所以可以将芽孢杆菌接种在含有氨苄青霉素的固体培养基上，以获得携带载体的单菌落，该过程被称为微生物的选择培养。(4)培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含空载体(不含目的基因的载体、不含外源基因的载体)的单菌落，因此还需要对DNA进行提取，然后进行鉴定，由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，所以可以用酒精初步分离DNA和蛋白质。(5)由于绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光，所以可在紫外光环境下对芽孢杆菌进行个体(细胞)水平进行检测。
答案：(1)C
(2)芽孢表面蛋白是可以定位在细胞表面的，在与外源蛋白形成融合蛋白后，可将外源蛋白展示/定位在芽孢杆菌表面
(3)氨苄青霉素/Amp 选择
(4)空载体(不含目的基因的载体、不含外源基因的载体) DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
(5)个体/细胞
4．(2023·广东一模)中国科学家采集了某深海海域的沉积物样品，分离、鉴定得到其中的深海放线菌，以期获得具有前景的抗生素替代品。据此回答下列问题：
(1)研究人员欲筛选出深海放线菌进行研究，取1 g沉积物样品接种在液体培养基中摇瓶培养，稀释后取菌液通过__________法接种到高氏一号(加数滴质量分数为10%的酚)培养基表面以获得单菌落。培养基中的酚能抑制细菌等杂菌的生长，而放线菌能在该培养基上正常生长，这种培养基属于__________(填“选择”或“鉴别”)培养基。
(2)通过PCR技术扩增分离得到的放线菌的16S rRNA基因可进行菌株的种属鉴定。PCR技术中起关键作用的酶是__________。该技术能在放线菌总的DNA中专一性扩增出16S rRNA基因的原因是________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________。
PCR产物一般可通过__________鉴定。
(3)紫色杆菌的紫色菌素(一种毒素，致死率高)能使培养基呈紫色，已知呋喃酮C30能明显抑制紫色菌素的产生。研究人员筛选出了放线菌菌株A，用甲醇将菌株A发酵产物提取后配制成溶液，对提取物能否抑制紫色菌素的产生进行了研究。
①将紫色杆菌菌液均匀地涂布在培养基表面，待菌液干燥后，将无菌圆纸片贴于培养基表面，按图1所示在滤纸片上滴加溶液。该实验以__________组为对照，通过比较A、B、C三组的__________可知提取物是否能抑制紫色菌素的产生。
②实验表明甲醇溶液不会影响紫色杆菌的繁殖，培养过程中对A、B、C三组紫色杆菌的数量进行监测，结果如图2所示，据图推测，深海放线菌A的提取物作为抗生素替代品的优点是________________________________________________________________________
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解析：(1)分离和纯化微生物常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，题干信息提示菌液已经先经过稀释，推知这里的接种方法是稀释涂布平板法。该培养基允许放线菌生长，同时抑制或阻止其他细菌等杂菌的生长，推知该培养基为选择培养基。(2)PCR技术的变性(90℃以上)、复性(50℃左右)、延伸(72℃左右)阶段需要的温度都比较高，所以需要耐高温的DNA聚合酶。引物是一段能与DNA母链部分碱基互补配对的短单链核酸，因此能特异性扩增出目的基因片段，该PCR中引物能与16S rRNA基因特异性结合，因此能在放线菌总的DNA中专一性扩增出16S rRNA基因。PCR扩增的产物是DNA分子，DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH条件下，这些基团可以带上正电荷或者负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带的电荷相反的电极移动，因此PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。(3)①研究提取物的作用时，一般需要设置空白对照和阳性对照。由题干可知呋喃酮C30能明显抑制紫色菌素的产生，推知阳性对照滴加5μL呋喃酮C30，而菌株A发酵产物通过甲醇提取，推知空白对照滴加5μL甲醇溶液，即该实验以A、C组为对照。由于紫色菌素使得培养基呈紫色，若提取物能抑制紫色菌素产生，则会产生褪色圈(透明圈)，根据褪色圈的直径即可推知其抑制作用大小。②由图1可知，滴加呋喃酮C30和菌株A提取物后，紫色杆菌的数量与空白对照组(滴加甲醇溶液)差别不大，推知提取物不会影响致病菌的生长，但是致病菌产生的紫色菌素却有区别，推知提取物不会对致病菌进行选择，使得其不会产生耐药性。
答案：(1)稀释涂布平板/涂布平板 选择
(2)耐高温的DNA聚合酶 引物能与16S rRNA基因特异性结合/引物是根据16S rRNA基因一段已知序列设计合成的 琼脂糖凝胶电泳
(3)①A、C 褪色(透明)圈直径 ②不会影响致病菌的生长，从而不会胁迫致病菌使其产生耐药性/不易对致病菌形成选择压力而导致其产生耐药性
5．(2023·广东一模)β-丙氨酸作为重要的中间体，广泛应用于医药、食品、化工等领域。L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)能够催化β-丙氨酸的生成，但天然PanD活力(酶活力是指酶催化一定化学反应的能力)较低且易失活。研究人员运用蛋白质工程对酶基因进行分子改造，在未知PanD三维结构和功能关系的情况下，通过易错PCR技术引入随机突变，再进行定向筛选，最终获得活力和稳定性均较高的PanD。回答下列问题。
(1)易错PCR与普通PCR相似，每次循环也包括了__________________________三步，但可通过改变PCR反应条件来提高碱基错配的几率。在PCR反应体系中，Mg2＋可以提高已发生错配区域的稳定性，Mn2＋可以降低DNA聚合酶对底物的专一性。因此，与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当______(填“提高”或“降低”)Mg2＋浓度、______(填“提高”或“降低”)Mn2＋浓度。通过多轮的易错PCR及筛选，可以获取所需的PanD基因。
(2)研究人员对比改造前后的两种PanD，发现改造后的PanD的第305位氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸，推测突变后酶活力升高的原因是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)为将能表达高活力PanD的大肠杆菌应用于工业发酵生产β-丙氨酸，研究人员还探究了发酵的最佳反应条件，研究中发现了随着底物浓度升高，β-丙氨酸产量下降的现象，推测其原因可能是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
因此在工业生产中，要采用________________(填“一次足量添加”或“多次分批补料”)的投料策略。
解析：(1)PCR每次循环包括：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③升温延伸：合成子链。易错PCR与普通PCR相似，每次循环也包括了变性、复性、延伸三步。PCR技术是指通过DNA的双链复制，在耐高温的TaqDNA聚合酶的催化下，遵循碱基互补配对原则，扩增DNA片段。TaqDNA聚合酶的负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2＋可以降低DNA聚合酶对底物的专一性，也就是说Mn2＋能提高碱基与模板链的错配，增加其突变率；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg2＋可以提高该错配区的稳定性，因此与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当提高Mg2＋浓度，提高Mn2＋浓度。(2)组成PanD酶的305位氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸后，由于该酶的氨基酸种类改变，导致酶的空间结构发生改变，结构决定功能，进而使酶活力提升。(3)将能表达高活力PanD的大肠杆菌应用于工业发酵生产β丙氨酸，随着底物浓度升高，导致发酵液浓度增加，进而使大肠杆菌失水较多，甚至死亡，不能高效的表达高活力PanD，为了维持发酵液的浓度，在工业生产中，要采用多次分批补料的投料策略。
答案：(1)变性、复性、延伸 提高 提高
(2)组成PanD的氨基酸种类改变，导致酶的空间结构发生改变，进而使酶活力提升
(3)随着底物浓度升高，导致发酵液浓度增加，进而使大肠杆菌失水较多，甚至死亡，不能高效的表达高活力PanD 多次分批补料