新高考生物二轮复习讲练测热点链接 基因工程的相关热点（2份，原卷版+解析版）

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随着生物技术的飞速发展，曾经遥不可及的PCR技术逐步走进了高中实验室。PCR技术应用广泛，如实时荧光定量RT-PCR技术、重叠延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢式PCR等，高考试题中有关PCR的问题越来越多，设问考查深度也明显提升。各种PCR技术不是孤立的，它们均已常规PCR为基础，为实现特定目的而进行了一定改进，但也有各自的局限性，因此在必要时可同时使用几种扩增技术，如多重巢式PCR、反向实时荧光定量PCR等。
在高考备考中，要关注不同扩增技术的本质差异，同时总结此类试题的解题步骤；一是寻找题图有效信息，确定所考PCR类型；二是迅速再忆所考PCR的独特性，猜测出题人可能得意图；二是根据设问对前述猜测进行验证，并领悟出题人挖掘的新考点，进而对知识框架进行完善。
命题点：PCR技术与病毒检测、基因定点突变与基因改造、基因编辑技术、同尾酶等。
一、PCR技术及其应用
1、PCR技术与病毒检测——实时荧光定量PCR(RT－PCR)
新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光 PCR 鉴定。先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。
RT(reverse transcriptin)-PCR即反转录聚合酶链反应，是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增 （PCR） 相结合的技术。
（2）优点：早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。
2、重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。
PCR扩增过程
高温变性：温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链
低温复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
中温延伸：温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3、大引物PCR技术
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。
（1）引物设计需要遵循以下原则：
①引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
②引物序列在模板内应当没有相似性较高的序列，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
③引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
④引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
⑤引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
⑥ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
⑦引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/ml）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
⑧ 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点。
4、反向PCR测定未知DNA区域
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。
（1）PCR技术由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA 的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火 (复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至 55℃左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链
二、同尾酶
同尾酶中，识别序列不同的限制酶，虽然识别的碱基序列不同，但是切开的黏性末端的碱基却能够正好相互配对，在DNA连接酶的作用下能形成重组DNA分子，如：限制酶BamHⅠ识别的碱基序列为—G↓GATCC—，限制酶BglⅡ识别的碱基序列为—A ↓GATCT—，限制酶MbⅠ识别的碱基序列为—↓GATC—，限制酶BamHⅠ切开的DNA两条链的黏性末端中没有被配对的碱基是GATC—，限制酶BglⅡ和限制酶MbⅠ切开的黏性末端未配对的碱基也都是GATC—，因此也可以通过碱基互补配对的形式重组。
定义：来源不同，识别的碱基序列也不相同，但能切割产生相同末端的限制酶叫同尾酶。
同尾酶识别的靶序列不相同，但能切割产生相同的黏性末端，因此也可以通过碱基互补配对的形式重组。
启动子的类型
组成型启动子：在生物体的所有组织中都有活性的启动子。其调控不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性。例如，在双子叶植物中最常用的组成型启动子是花椰菜花病毒启动子、T7噬菌体启动子。
诱导型启动子：能被诱导表达的启动子。表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。常见的诱导型启动子有Lac乳糖操纵子以及在此基础上衍生出的多种诱导型启动子。
组织热异性启动子：只有在特定的器官或组织中才能启动基因的表达，如神经细胞等组织特异性启动子。
启动子的作用：
①RNA聚合酶识别结合的位点，从而影响基因的表达
②通过改变启动子的序列，可以控制基因的表达模式，从而改变基因的功能
③启动子可用来改变基因组中某一特定基因的表达量
④启动子可以用来控制基因组中某一特定基因的表达量
1、临床上常采用RT-PCR技术，对受测者咽拭子取样后进行新型冠状病毒核酸检测。RT-PCR是指以病毒的RNA为模板合成cDNA，并对cDNA进行PCR扩增的过程。为定量测定样品中病毒的核酸，常采用实时荧光PCR扩增技术，该技术原理如下图所示。在PCR反应体系中每加入一对引物的同时，加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光信号生成。CT值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。下列说法错误的是（）
A．引物、荧光探针均具有特异性，通过氢键与cDNA中的目的基因特异性结合
B．荧光探针的水解发生在PCR过程中的延伸阶段
C．样本中初始病毒核酸量越多，CT值就越大
D．Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸
【答案】C
【详解】A、引物、荧光探针由特定序列构成具有特异性，它们都可以与cDNA中的目的基因通过碱基互补配对特异性结合，结合处形成氢键，A正确；
B、“当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针”，所以荧光探针的水解发生在PCR过程中的延伸阶段，B正确；
C、样本中初始病毒核酸量越多，达到阈值所需要的循环数就越少，CT值就越小，C错误；
D、Taq DNA聚合酶催化DNA的合成时，子链的延伸方向是从5′端向3′端，D正确。
2、人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。
【答案】 SalI EcRI 6 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7以及R位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列；
2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，限制酶Xh Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。
【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xh Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xh Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xh Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xh Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xh Ⅰ 、DNA连接酶；
（2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达；
（3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
【点睛】对基因工程中PCR技术的掌握，对基因工程的第二步，基因表达载体的构建的过程的分析，双酶切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。
3、反向PCR流程如图所示，该技术可利用一段已知DNA序列设计合理的引物，扩增已知序列两端的未知序列。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“5’-AACTATGCGCTCATGA-……-GCAATGCGTAGCCTCT-3'”。下列叙述错误的是（ ）
A．I酶切：用一种限制酶切割DNA，以使两端未知序列形成相同的黏性末端
B．II连接：使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键
C．设计的两种引物分别是“5'-AACTATGCGCTCATGA–3’”和“5'-AGAGGCTACGCATTGC-3’”
D．对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。该DNA单链序列可能为“5'-AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'”
【答案】C
【详解】A、根据图示可以看出经过I酶切过程后，由于用一种限制酶切割DNA，从而使两端未知序列形成相同的黏性末端，A正确；
B、II过程是将DNA片段连接起来，该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，B正确；
C、设计的两种引物需要与已知序列发生碱基互补配对，而后向两侧延伸合成未知序列，因此合成的引物分别是“5'-TCATGAGCGCATAGTT–3’”和“5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3’”，C错误；
D、对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列，由于F序列是未知序列，根据C项中的引物序列做出判断，该DNA单链序列可能为“5'-AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'”，D正确。
4、某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。

下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；
B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；
C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；
D、用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。
5、不对称PCR技术是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1/50〜1/100．PCR反应的最初若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），在限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA．下列相关说法正确的是（ ）
A．两种引物与模板链结合时，需将温度控制在72℃左右
B．PCR扩增时，在DNA解旋酶的作用下双链DNA解聚为单链
C．通过不对称PCR技术最后大量获得的ssDNA的碱基序列与图中甲链的相同
D．PCR扩增时，子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸
【答案】C
【详解】A、两种引物与模板链结合即复性过程，该过程中温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，A错误；
B、PCR扩增时，当加热至90 ℃以上时， DNA解聚为单链，不需要加入DNA解旋酶，B错误；
CD、PCR扩增时，需要引物与DNA单链结合，在耐高温 DNA聚合酶作用下，将4种脱氧核苷酸添加至引物的3'端，完成DNA单链的延伸，限制性引物数量少，会先耗尽，而非限制性引物数量多，其与乙链结合，最后大量获得的ssDNA 的碱基序列与图中甲链的相同，C正确，D错误。
6、重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理见图。下列说法正确的是（ ）
A．过程②的扩增缓冲溶液中一般要添加Mg2+
B．若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生4种DNA分子
C．经过过程④获得的杂交DNA有2种,都可以经过过程⑤获得目的基因
D．过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸,需要引物
【答案】A
【详解】A、过程②为PCR反应，需要在一定的添加Mg2+的缓冲液中才能进行，A正确；
B、两个反应系统中各自形成两种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故总共形成3种DNA分子，B错误；
C、过程④获得的杂交DNA有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，5′端为单链的杂交DNA为所需DNA，C错误；
D、过程⑤是延伸过程，该过程使用耐高温的DNA聚合酶进行催化，不需要引物，D错误。
7、通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点。有关叙述不正确的是（ ）
A．两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入
B．一个DNA分子在第2轮PCR后，得到的四个DNA分子各不相同
C．第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4
【答案】C
【详解】A、引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向定点插入运载体，避免发生自身环化，A正确；
B、第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，一个DNA分子在第2轮PCR后，得到的四个DNA分子各不相同，B正确；
C、在第3轮PCR中，物质②是引物2以引物1拓展得到的DNA链为模板进行复制得到的，故引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因，C错误；
D、在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，总DNA分子共8个，所以比例为1/4，D正确。
8、新冠病毒包膜表面的S蛋白能识别人体细胞膜表面的ACE2受体并导致病毒入侵人体细胞。制备重组亚单位新冠疫苗的线路是：提取新冠病毒RNA→通过RT-PCR（反转录酶聚合酶链式反应）技术扩增筛选RBD蛋白（S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分）基因（图1）→构建基因表达载体（图2）→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。图3为利用电泳技术对PCR的产物进行纯度鉴定，1号泳道为标准（Marker），2号泳道为阳性对照组，3号泳道为实验组。下列相关叙述错误的是（ ）
A．利用RT-PCR技术获取RBD蛋白基因时，需加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶
B．利用PCR扩增含有限制酶切点的RBD蛋白基因时，应选择的引物为引物4、引物5
C．2号泳道是以（提纯的）RBD蛋白基因片段为材料所做的阳性对照组
D．为提高目的基因和运载体的正确连接效率，应选择限制酶EcRI切割
【答案】D
【详解】A、RT-PCR技术是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入逆转录酶、Taq酶，A正确；
B、引物与模板链的3'端碱基互补配对，故引物1、引物2、引物7和引物8不合适，扩增得到的RBD蛋白基因也应该含有限制酶的酶切位点，故引物3和引物6不合适，故选引物4和引物5，B正确；
C、PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准（Marker），2号泳道是以RBD蛋白基因片段为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组，C正确；
D、质粒上没有SmaⅠ酶切位点，且若使用EcRⅠ酶切，易造成目的基因和质粒自身环化，故应该选择BamHⅠ和HindⅢ，D错误。
9、（不定项）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物，对PCR扩增产物经AccI酶切后电泳。如图所示，已知引物1为5′-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3′，AccⅠ酶的识别位点为5′-GTATAC-3′，两引物之间无另外的AccI酶的识别位点。下列叙述不正确的是（ ）

A．该实验中需设计的引物2为5′一TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3′
B．若电泳结果只能观察到530bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型
C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带
D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同
【答案】ABD
【详解】A、分析题图可知，引物的延伸方向为5'→3'，故图示所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链，故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同，而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板，故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2为5'－ATGATTTAACGAGAGTTGAA－3'，A错误；
B、若酶切产物只能观察到450bp的DNA条带，则表明第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，GAI 该水稻品种为GG型，B错误；
C、若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT，故GT杂合型水稻品种的G能被酶切成两段，而T不能被酶切，故酶切电泳结果为3条条带，C正确；
D、组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的数目不同，D错误。
10、In-Fusin技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15-20bp），然后用In-Fusin酶处理即可实现无缝连接。它的操作步骤大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusin酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题。

(1)过程①需要用到的酶是 。过程③中，同源序列1与同源序列2中的碱基序列不同，这样设计的好处是 。
(2)为保证扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因，引物A或引物B要依据 序列进行设计。
(3)若目的基因是氨苄青霉素抗性基因，以大肠杆菌作为受体细胞。为检测已转化大肠杆菌的抗性效果，在含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的培养基上分别接种等量的已转化大肠杆菌并培养相同时间，然后采用 法进行计数，若结果较真实值偏小，原因是 。
(4)与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusin技术的优势有 。（至少答出两点）
【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶（或TaqDNA聚合酶） 防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因自身环化 (2)目的基因与质粒
(3) 稀释涂布平板 当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落
(4)不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏
【详解】（1）过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程，该过程属于PCR技术的应用，故需要TaqDNA聚合酶；过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列1、2中的碱基排序不同，这样设计的好处是防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达。
（2）目的基因经引物A或引物B扩增后需要与目的基因和线性化质粒连接，故为保证扩增出所需的目的基因，引物A或引物B要依据目的基因和质粒序列进行设计。
（3）能对微生物进行计数的方法有用显微镜计数法和稀释涂布平板法（用于活菌计数）；由于在用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落，故导致结果较真实值偏小。
（4）由题意可知，好吧对比传统构建重组质粒，In-Fusin 技术的优势有不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等。
11、金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动物肝脏细胞中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将MT基因导入大肠杆菌构建工程菌，利用这一工程菌吸附工业废水中的重金属。回答下列问题：
(1)为获取目的基因，从 中提取mRNA，通过 法获得MTcDNA。MTcDNA的碱基序列与细胞中MT基因的碱基序列 （填“相同”或“不同”）。
(2)为了提高工程菌MT蛋白的产量，将MT基因与外源表达增强元件连接（图甲表示引物对应的位置）。
利用PCR检测连接是否成功，可选择的引物组合是 （填字母），该PCR反应体系中需加入 酶。
A．①+③B．①+④C．③+②D．③+④
(3)将改造后的目的基因进行PCR扩增，得到的片段末端为平末端，而载体E只有能产生黏性末端的酶切位点。为了能够将MT基因与载体E相连，可以在上述引物的 （填“5′”或“3′”）端添加能产生黏性末端的限制酶识别序列；也可以借助中间载体P将MT基因接入载体E。（图乙表示载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列）
后者具体操作步骤如下：
①选用 酶将载体P切开，再用DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接。为了提高获得重组质粒的效率，除了考虑适宜的外界条件、目的基因的浓度外，还需考虑 （写出两点）。
(4)将重组质粒导入到用 处理的大肠杆菌中完成转化；利用含有 的培养基筛选出MT工程菌。
(5)通过检测发现MT基因已经成功导入大肠杆菌，但该菌不能吸附工业废水中的重金属，可能的原因是： 。
【答案】(1) 动物肝脏细胞 逆转录/反转录 不同
(2) B TaqDNA聚合酶/耐高温的DNA聚合酶
(3) 5′ EcRV 启动子 终止子 XhI和PstI 质粒的浓度、质粒的纯度、DNA连接酶的浓度DNA连接酶活性
(4) CaCl2 卡那霉素
(5)转入大肠杆菌中的MT基因不表达/表达量少/表达不及预期
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）分析题意，金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动物肝脏细胞中的金属结合蛋白，为获取目的基因，可从动物肝脏细胞中提取mRNA，通过逆转录（反转录）法获得MTcDNA；MTcDNA是经过逆转录得到的，该过程中由于成熟的mRNA已经经过剪切等过程，不含内含子等非编码序列，故MTcDNA的碱基序列与细胞中MT基因的碱基序列不同。
（2）PCR扩增时，应选择一对引物，引物需要与模板的3’端结合，本操作中将MT基因与外源表达增强元件连接，利用PCR检测连接是否成功，需要扩增表达增强元件和目的基因，结合题图可知，可选择的引物组合是①+④ ，故选B；由于PCR过程中所需温度较高，故PCR反应体系中需加入TaqDNA聚合酶/耐高温的DNA聚合酶。
（3）PCR扩增时与引物的3‘端结合，’为了能够将MT基因与载体E相连，可以在上述引物的5′端添加能产生黏性末端的限制酶识别序列。
①PCR所用的DNA聚合酶扩增出的M基因的末端为平末端，则可用EcRV酶将载体P切开，形成平末端，由于T4DNA连接酶可以连接平末端，所以用T4DNA连接酶将M基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②由于载体P'不具有表达M基因的启动子和终止子，所以选用XhI和PstI酶组合对载体P'和载体E进行酶切，将切下的M基因和载体E用DNA连接酶进行连接，得到含有启动子和终止子的表达载体；为了提高获得重组质粒的效率，除了考虑适宜的外界条件、目的基因的浓度外，还需考虑质粒的浓度、质粒的纯度、DNA连接酶的浓度DNA连接酶活性等。
（4）将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法，故可将重组质粒导入到用CaCl2处理的大肠杆菌中完成转化；结合图示可知，重组质粒含有的标记基因是卡那霉素，故利用含有卡那霉素的培养基筛选出MT工程菌。
（5）由于转入大肠杆菌中的MT基因不表达/表达量少/表达不及预期，故通过检测发现MT基因已经成功导入大肠杆菌，但该菌不能吸附工业废水中的重金属。
12、人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由a链和β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ也可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图1为其制备的基本方案。
(1)构建基因表达载体。图中获取hCGβ基因的方法属于. ，hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，在重组酶作用下发生同源切割，将目的基因直接插入。本方案中研究人员运用同源切割的方式在hCGβ基因两端加上一组同源序列A、B，然后将hCGβ基因与线性质粒载体混合后，在重组酶和DNA连接酶的作用下可形成环化质粒。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶是 。
(2)扩增基因表达载体。阶段Ⅱ将环化质粒导入用 处理的大肠杆菌，然后在含有 的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。
(3)鉴定基因表达载体。为了检验目的基因是否融合成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引物对融合基因进行PCR，再将扩增产物进行电泳。电泳时需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，以防 。电泳后得到图2所示结果，据图可判断 号样品最符合要求。
(4)导入受体细胞。阶段IV时，需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分 （A．氨苄青霉素B．组氨酸C．无机盐D．琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。
(5)目的基因检测与鉴定。转化成功后的酵母菌菌株接种到液体培养基中，30℃恒温摇床上培养后获得培养物。将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经 处理后，再次离心取上清液，用抗hCGβ单克隆抗体分别进行检测。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ蛋白，则说明 。
(6)发酵罐生产。从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优势在于 。
【答案】(1) 化学合成法 有利于hCGβ进入内质网中加工，并分泌到细胞外 限制酶
(2) CaCl2 氨苄青霉素
(3) 条带迁移出凝胶 3
(4)AB
(5) 破碎 hCGβ基因在酵母菌细胞中得到表达，并能分泌到细胞外
(6)可以通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ基因的表达hCGβ蛋白的合成
【分析】图示Ⅰ为基因表达载体的构建过程，Ⅱ是将重组DNA导入大肠杆菌，Ⅲ是提取并鉴定所需要的重组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是提取目的基因的产物。
【详解】（1）根据题图可知，图示获取hCGβ基因是通过查询基因数据库中hCGβ的基因序列后通过人工合成的。甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ进入内质网中加工，并分泌到细胞外。传统重组质粒构建过程需要使用限制酶和DNA连接酶，而该过程是运用同源切割的方式在hCGβ基因两端加上一组同源序列A、B，然后将hCGβ基因与线性质粒载体混合后，在重组酶和DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，该过程没有使用限制酶。
（2）将重组质粒导入大肠杆菌时，应先用CaCl2处理大肠杆菌，使其成为感受态。由于线性质粒上含有氨苄青霉素基因，因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，因此应在含有氨苄青霉素的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。
（3）电泳时需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，通过该指示剂可显示溴酚蓝在凝胶中的扩散速率，而溴酚蓝在凝胶中的扩散速率比DNA的扩散速率快，故可以防止条带迁移出凝胶。环化质粒的长度为630+320=940kb，因此电泳结果为3图示的，说明受体细胞含有环化质粒，符合要求。
（4）由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入组氨酸和氨苄青霉素，但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体。
（5）hCGβ是一种分泌蛋白，可被分泌到细胞外，将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经破碎处理后，再次离心取上清液，可获得较多的hCGβ，用抗hCGβ单克隆抗体分别进行检测。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因在酵母菌细胞中得到表达，并能分泌到细胞外。
（6）AOXⅠ为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1作为hCGβ基因启动子，可以通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ基因的表达hCGβ蛋白的合成。
13、影响小鼠内耳形态的基因A突变会导致遗传性耳聋，研究人员尝试进行基因治疗。
(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统由sgRNA及Cas9蛋白组成。图1所示，sgRNA与目标DNA结合，引导Cas9蛋白切割靶序列的双链DNA，导致 键断裂。
(2)同源重组是指在DNA断裂的情况下，含有同源区段的DNA之间发生的重组。科研人员尝试利用同源重组原理对耳聋小鼠进行基因治疗。
①利用 技术扩增野生型小鼠的基因A，再用图2中的限制酶 切割基因A与腺病毒载体形成黏性末端，最后利用 酶进行拼接，构建腺病毒表达载体。科研人员尝试利用该载体与耳聋小鼠的DNA进行同源重组，效果不佳。
②在上述基础上，科研人员又将sgRNA基因、Cas9基因接入了腺病毒表达载体（见图3），同时引入sgRNA的识别序列，目的是 。图3所示的腺病毒表达载体还需要哪些必要的结构或基因 （多选）。
A．启动子和终止子
B．RNA聚合酶基因
C．标记基因
D．起始密码子和终止密码子
E．反密码子
F．复制原点
(3)将腺病毒表达载体注入耳聋小鼠的单侧耳组织细胞。为评估该治疗方案的效果，研究人员使用同一只小鼠的非注射耳作为对照，而不是另一只没有注射腺病毒表达载体的小鼠，好处是可以排除 对实验结果的影响。
(4)进一步研究结果表明该方案可以有效纠正小鼠的突变基因，从而治疗小鼠的遗传性耳聋。人体内基因A突变也会导致遗传性耳聋，欲将该方案用于临床治疗，从安全性角度还应关注 。
【答案】(1)磷酸二酯键
(2) PCR SpeI和Sal DNA连接酶 通过CRISPR/Cas9基因编辑系统切割腺病毒表达载体DNA和耳聋模型鼠染色体DNA，使DNA发生断裂，启动同源重组 ACF
(3)小鼠的个体差异
(4)该技术对其他功能基因是否存在非特异性编辑
【分析】1、实现基因工程的操作至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的 “分子手术刀”——限制酶、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”——DNA连接酶和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”——载体。
2、基因工程技术的基本步骤： 目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）DNA分子的单体间通过磷酸二酯键相连接，Cas9蛋白切割靶序列的双链DNA，导致靶序列磷酸二酯键断裂。
（2）①PCR为体外扩增DNA分子的一项技术，若要扩增野生型小鼠的基因A，则要用到PCR技术。如图2所示，若要利用同源重组原理对耳聋小鼠进行基因治疗，则构建的基因表达载体中应包含同源区a、b，所用的限制酶要能同时把基因A中的同源区a、b切割下来。因此，所用的限制酶是SpeI和Sal，即能把基因A中的同源区a、b切割下来，也在腺病毒载体上有相应切口。利用限制酶所获取的目的片段和腺病毒载体片段，还要用DNA连接酶进行连接，形成重组的基因表达载体。
②利用图2所示的载体与耳聋小鼠的DNA进行同源重组，效果不佳，有可能是未启动重组。将sgRNA基因、Cas9基因接入了腺病毒表达载体，同时引入sgRNA的识别序列，目的是通过CRISPR/Cas9基因编辑系统切割腺病毒表达载体DNA和耳聋模型鼠染色体DNA，使DNA发生断裂，启动同源重组。一个能正常表达的重组基因表达载体应包含有目的基因、标记基因、启动子和终止子、复制原点，因此图3所示的腺病毒表达载体还需要标记基因、启动子和终止子、复制原点，故选ACF。
（3）实验过程要遵循单一变量原则，研究人员使用同一只小鼠的非注射耳作为对照，而不是另一只没有注射腺病毒表达载体的小鼠，好处是可以排除小鼠的个体差异对实验结果的影响。
（4）欲将该方案用于临床治疗，从安全性角度还应关注该技术对其他功能基因是否存在非特异性编辑。