新高考生物一轮复习学案：第33讲　微生物的培养与应用（含解析）

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高中生物一轮复习学案
第33讲 微生物的培养与应用
考点一　微生物的实验室培养

1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
(2)种类
①按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
②按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。
(3)成分：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2．无菌技术

3．大肠杆菌的纯化培养
(1)制备固体培养基的步骤
→→→→
(2)纯化大肠杆菌
①平板划线法

②稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养
a．系列稀释操作

b．涂布平板操作

(3)菌种的保存
①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
[基础诊断]
1．消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(包括芽孢和孢子)。(选修1　P15正文)(×)
2．培养基分装到培养皿后用高压蒸汽灭菌法灭菌，空的培养皿则可用干热灭菌法灭菌。(选修1　P16正文)(×)
3．制备牛肉膏蛋白胨培养基时，将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯。(选修1　P17正文)(√)
4．平板划线法操作中，第二次以及其后的划线操作，总是从上次划线的末端开始划线。(选修1　P18平板划线操作)(√)
5．平板划线法操作中，划线结束后，不需要把接种环再一次灼烧灭菌。(选修1　P18平板划线操作)(×)
[深度拓展]
1．(选修1　P18讨论1)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
提示：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少；在划线操作结束时，灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2．(选修1　P19涂布平板操作)在稀释涂布平板法中，判断操作成功的标准是什么？
提示：有两个或两个以上培养基菌落数目在30～300之间，则说明稀释操作比较成功，能够进行菌落计数。

1．常见物品的消毒或灭菌方法
(1)消毒方法及适用对象

(2)灭菌方法及适用对象

2．平板划线法和稀释涂布平板法的比较



1．(2022·山东济宁模拟)下表表示某培养基的配方，下列叙述正确的是(　　)

成分
蛋白胨
葡萄糖
K2HPO4
伊红
美蓝
蒸馏水
含量
10 g
10 g
2 g
0.4 g
0.065 g
1 000 mL
A.从用途看，该培养基属于选择培养基
B．培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
C．该培养基没有提供维生素等营养
D．该培养基调节到合适的pH后就可以接种使用
B　[从用途看，该培养基中有伊红和美蓝，属于鉴别培养基，A错误；微生物的营养物质主要包括氮源、碳源、水和无机盐等，培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨，B正确；蛋白胨可以提供氮源和维生素等，C错误；该培养基调节到合适的pH经灭菌后才可以接种使用，D错误。]
2．(2021·金牛区月考)如表是微生物培养基的成分。下列有关说法错误的是(　　)
编号
①
②
③
④
⑤
成分
(NH4)2SO4
KH2PO4
FeSO4
CaCl2
H2O
含量(g)
0.4
4.0
0.5
0.5
100 mL
A.此培养基可用来培养自养型微生物
B．此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源
C．若除去①，此培养基可培养硝化细菌
D．培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源
C　[此培养基中不含碳源，适合用来培养自养型微生物，A正确；此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源，B正确；硝化细菌能进行化能合成作用，但不能固氮，因此若除去①，此培养基不能培养硝化细菌，C错误；培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源，D正确。]

　自养型与异养型微生物培养基的区别
(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。
(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源

3．(2018·全国卷Ⅱ)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。
回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是____________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：　(1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃条件下加热1～2 h。耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃条件下煮30 min或在80 ℃条件下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少。(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。
答案：　(1)可以　(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　(3)破坏DNA结构　消毒液　(4)氯气　(5)未将锅内冷空气排尽

4．(2020·新课标Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。

回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是___________________________________________________________
_________________________________________________________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：___________________
________________________________________________________________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即_______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：　(1)培养基一般使用高压蒸汽灭菌，微生物的分离和筛选一般使用选择培养基，物质Y是琼脂，甲、乙培养基均属于以S为唯一碳源和氮源的选择培养基。(2)利用稀释涂布平板法对细菌进行计数，要保证每个平板上长出的菌落数不超过200，假设稀释倍数为a，在每个平板上涂布100 μL(0.1 mL)稀释后的菌液，则有(2×107/a)×0.1≤200，则稀释倍数a≥104。(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，可能会导致细菌细胞由于渗透作用失水过多，导致活性丧失。(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，主要实验步骤有淤泥中取样，然后进行梯度稀释，微生物的培养与观察，计数。(5)培养基的主要成分包括水、无机盐、碳源、氮源。
答案：　(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　 选择　(2)104　(3)细菌细胞由于渗透作用失水过多，丧失活性(S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长)　(4)淤泥中取样，然后进行梯度稀释，微生物的培养与观察，计数(取淤泥加入无菌水，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数)　(5)水、无机盐、碳源、氮源

　平板划线操作中每次灼烧的目的
项目
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者


考点二　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1．实验原理

2．实验流程

3．统计细菌数目的方法
(1)显微镜直接计数法

(2)间接计数法——活菌计数法
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

4．实验结果分析与评价

[基础诊断]
1．尿素是一种重要的农业氮肥，可以直接被农作物吸收。(选修1　P21课题背景)(×)
2．除了活菌计数法外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。(选修1　P22正文)(√)
3．在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的pH降低。(选修1　P26正文)(×)
[深度拓展]
1．(选修1　P22、P23正文)阅读教材“设置对照”部分相关内容，回答下面问题：
(1)你能通过设置对照，帮助A同学排除两个可能影响实验结果的因素吗？
(2)稀释涂布平板时，每个稀释浓度涂布三个平板，这一操作遵循了实验的什么原则？该操作的目的是什么？设置空白对照的目的是什么？
提示：(1)有两种方案：一种是可以让其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果与A同学结果一致，则A无误；如果不同，则A的操作有问题。另一种方案是，将A同学的培养基在不加土样的情况下培养，作为空白对照，以判断A同学的培养基是否污染。
(2)重复原则。重复的目的是排除偶然因素的影响，空白对照的目的是排除非测试因素的影响。
2．(选修1　P26正文)在分离尿素分解菌的实验中，为何对分离的菌种还需要作进一步的鉴定？
提示：在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，有些微生物可利用其他微生物代谢产物进行繁殖，因此在选择培养基上生长的不一定是尿素分解菌。

1．比较两种微生物计数方法
—
间接计数法
(稀释涂布平板法)
直接计数法
(显微计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝ ×M；C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
2.微生物的分离与计数实验中对照组和重复组的设置及作用
(1)两种对照组的设置及作用
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用
为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置3个平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。


1．(2021·山东高考)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是(　　)
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
B　[由题干信息可知，甲菌菌落周围呈现深蓝色，这说明甲菌可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，属于解脂菌，A正确；由题干信息可知，乙菌菌落周围不变色，这说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落又能够在培养基上生存，故该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，这样实验对比时更加直观，C正确；可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，进行对比观察时，可以观察菌落周围深蓝色圈的大小，从而判断解脂菌分泌脂肪酶的能力，D正确。]
2．(2019·全国卷Ⅰ)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。
Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题。
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是______________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________________________。
(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会________________，其原因是______________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是___________________________________。
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供____________和____________。
解析：　本题考查微生物的培养、分离和微生物代谢等知识，意在考查考生的理解能力和识记能力。(1)牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物提供了氮源，而Ⅱ号、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有机物是X。(2)因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，相当于是选择培养基，只有能降解X的细菌才能增殖，而不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖。(3)要对菌落进行计数，应采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸参与细菌的有氧呼吸，可以为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。
答案：　(1)牛肉膏、蛋白胨　X　(2)下降　不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖　(3)稀释涂布平板法　(4)能量　合成其他物质的原料

3．(2021·城固县月考)二硝基甲苯遇碱变红，如图表示从被二硝基甲苯污染的土壤中分离具有降解二硝基甲苯能力的光合细菌——球形红细菌的过程。请回答下列问题：

(1)将10 g土壤样品加入装有无菌水的三角瓶中制备土壤浸出液。②过程的目的是____________________；③过程所用的接种方法为______________法。
(2)在5个培养基平板上分别接种稀释倍数为105的土壤样液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191，则每毫升土壤样液中的细菌数量约为__________________个。用此方法测定的球形红细菌数量比实际活菌数量少，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)图中甲、乙培养基需置于有光条件下培养，主要原因是_________________。挑出纯化获得的菌落接种在含二硝基甲苯的培养基中，培养结束后，可通过_____________________来判断菌种降解二硝基甲苯的能力。
解析：　(1)图中②稀释涂布平板接种的目的是获得单个菌落；由图中菌落的分布可知，③过程所用的接种方法为平板划线法。(2)在5个培养基平板上分别接种稀释倍数为105的土壤样液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191，一般取菌落数在30～300之间的平板计数，则每毫升土壤样液中的细菌数量为×105÷0.1＝1.75×108(个)。用此方法测定的球形红细菌数量比实际活菌数量少，原因是一个菌落可以由一个或多个球形红细菌形成。(3)由于球形红细菌进行光合作用需要光，因此图中甲、乙培养基需置于有光条件下培养。挑出纯化获得的菌落接种在含二硝基甲苯的培养基中，由于二硝基甲苯遇碱变红，因此培养结束后，可通过调节培养基的pH至碱性后观察培养基颜色来判断菌种降解二硝基甲苯的能力。
答案：　(1)获得单个菌落　平板划线　(2)1.75×108　一个菌落可以由一个或多个球形红细菌形成　(3)球形红细菌进行光合作用需要光　调节培养基的pH至碱性后观察培养基颜色

考点三　分解纤维素的微生物的分离

1．纤维素酶
(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
(2)作用：
纤维素纤维二糖葡萄糖
2．纤维素分解菌的筛选
(1)方法：刚果红染色法。
(2)原理：
―→红色复合物
(3)实验流程

[基础诊断]
1．在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，可以通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。(选修1　P29资料二)(√)
2．纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。(选修1　P30正文)(√)
[深度拓展]
(选修1　P29旁栏)根据教材纤维素分解菌的选择培养基和鉴别培养基的配方，回答下列问题：

(1)选择培养基和鉴别培养基的配方分别是液体培养基还是固体培养基？为什么？两种培养基的物理状态与其功能有什么关系？
提示：根据琼脂的有无判断，选择培养基是液体培养基，液体培养基中微生物更能与营养物质充分接触，有利于其繁殖，从而增大微生物浓度；鉴别培养基是固体培养基，只有在固体培养基上才能长出菌落，进而根据菌落判断微生物的种类。
(2)你能否设计一个对照实验，说明选择培养的作用？
提示：设置普通培养基(如牛肉膏蛋白胨培养基)为对照，若普通培养基菌落数目多，则说明选择培养基有选择作用。
(3)该过程中一定要进行选择培养吗？选择培养的目的是什么？
提示：不一定。选择培养的目的是增加样品中所需菌种的浓度。

1．微生物的筛选方法

2．微生物的鉴别方法



1．(2022·泰州模拟)某兴趣小组用从不同环境中采集的土壤等进行了“分解纤维素的微生物的分离”实验，实验过程为：土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落，实验结果见下表1。
表1　不同土壤微生物对纤维素的分解
组别
1
2
3
样品
松针腐
叶花盆土
表层草地土
菌料
目的菌落类型
细菌、真菌
细菌
霉菌为主
透明圈直径
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
注：“＋”越多直径越大。
(1)上述实验过程中“选择培养”的目的是____________________________________。
(2)与30 ℃相比，37 ℃培养时霉菌类纤维素分解菌生长迅速，菌丝会________其他菌落，对后续菌种的分离造成困扰，因此采用30 ℃培养为佳。
(3)兴趣小组在鉴别菌种时尝试了两种方案：A.先培养微生物，再加入刚果红染色；B.直接在加入刚果红的鉴别培养基上培养微生物。结果发现：A方案在漂洗多余刚果红的过程中，易出现菌落浮起被带走的现象，从而造成____________，故选方案B。由于刚果红在高温下容易被分解，应在培养基灭菌______(填“前”或“后”)加入。
(4)有小组成员根据表1结果中的________________________，认为菌料中的目的菌分解纤维素的能力最强，其他成员对此观点提出异议。兴趣小组继续对三组样品进行透明圈直径、菌落直径和酶活力的测定，实验结果如表2。
表2　不同H/C值纤维素分解菌酶活性的比较
组别
H(透明圈直径)
(单位：cm)
C(菌落直径)
(单位：cm)
H/C值
酶活力
(U/mL)
1
2.06
0.48
4.3
1.7
2
1.68
0.30
5.6
2.4
3
2.62
0.41
6.4
2.9
你认为将______________________________作为判断纤维素分解菌分解能力大小的依据更合理，其大小与酶活力呈______相关。
(5)兴趣小组欲对培养液中的纤维素分解菌进行计数，具体做法是：先在培养基上加入若干质量较轻的小球，然后在平板上滴加一定体积的培养液，盖上培养皿盖后左右摇晃。试分析这样做的目的是________________。

解析：　(1)根据以上分析可知，选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需的微生物。(2)根据题意，与30 ℃相比，37 ℃培养时霉菌类纤维素分解菌生长迅速，导致菌丝会覆盖其他菌落，对后续菌种的分离造成困扰，因此采用30 ℃培养为佳。(3)分析两种方案可知，A方案先培养微生物，再加入刚果红染色，A方案中在用氯化钠溶液漂洗多余刚果红的过程中，易出现菌落浮起被带走，从而造成菌落的混杂的现象，故选B方案，即直接在加入刚果红的鉴别培养基上培养微生物。由于刚果红在高温下容易被分解，培养基一般采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，因此应在培养基灭菌后添加刚果红。(4)根据以上分析可知，在纤维素分解菌的培养基中加入刚果红，刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。分析表1结果可知，表1中的组别3中透明圈直径最大，小组成员认为菌料中的目的菌分解纤维素的能力最强，但是其他成员对此观点提出异议。兴趣小组继续对三组样品进行透明圈直径、菌落直径和酶活力的测定，分析表2中的数据可知，随着值的增大，酶活力增强，因此将透明圈与菌落直径之比(值)作为判断纤维素分解菌分解能力大小的依据更合理，其大小与酶活力呈正相关。(5)根据题意可知，该题测定纤维素分解菌的方法类似血球计数板计数法，具体做法是：先在培养基上加入若干质量较轻的小球，然后在平板上滴加一定体积的培养液，盖上培养皿盖后左右摇晃，这样使得菌液分布均匀，计数较为准确。
答案：　(1)增加纤维素分解菌的浓度　(2)覆盖　(3)菌落的混杂　后　(4)组别3中透明圈直径最大　透明圈与菌落直径之比(值)　正　(5)使菌液均匀分布

2．(2020·聊城一模)“纸片扩散法”测定病原菌对抗生素敏感性的实验是在某病原菌均匀分布的平板上，铺设含有不同种抗生素的纸片后进行培养。下图示为某测定实验的结果，其中抑菌圈是在纸片周围出现的透明区域。下列叙述正确的是(　　)

A．在图示固体培养基上可用平板划线法接种病原菌
B．形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物较敏感
C．未出现抑菌圈可能是病原菌与抗生素接触后发生抗性变异
D．“纸片扩散法”实验中的自变量是不同种的抗生素
D　[根据题干“某病原菌均匀分布的平板上”可知，图示固体培养基上采用的接种方法是稀释涂布平板法，A错误；形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物敏感程度较低，B错误；未出现抑菌圈可能是病原菌对该抗生素不敏感，C错误；根据题干“铺设含有不同种抗生素的纸片后进行培养”判断，“纸片扩散法”实验中的自变量是不同种的抗生素，D正确。]
3．(2019·北京高考)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。


菌种
菌落直径：
C(mm)
透明圈直径：
H(mm)
H/C
细菌Ⅰ
5.1
11.2
2.2
细菌Ⅱ
8.1
13.0
1.6
有关本实验的叙述，错误的是(　　)
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
C　[微生物的培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等，A正确。筛选分解淀粉的细菌时，实验流程为取样→梯度稀释→样品涂布到鉴别分解淀粉的细菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落，B正确。由题意可知，淀粉被分解后经稀碘液处理才能出现透明圈，淀粉分解需要淀粉酶的催化，图中两种细菌都出现了以菌落为中心的透明圈，说明以上两种细菌均能将淀粉酶分泌到细胞外发挥作用，C错误。透明圈是细菌分解淀粉得到的，H表示透明圈直径，C表示菌落直径，因此H/C值可以反映两种细菌分解淀粉能力的差异，即H/C值越大，细菌分解淀粉的能力越强，D正确。]

1．(2019·高考全国卷Ⅱ)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________________。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。

(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明____________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明____________________________。
解析：　本题考查了土壤中目标菌的筛选等，意在考查考生的理解能力。(1)要从土壤中分离出能降解含氮有机物W的目标菌，所用选择培养基应以该特定物质W为氮源。(2)图示信息显示，在乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W，若要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。(3)若要通过设计实验确定甲、乙两种细菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①实验应遵循单一变量原则，故C处应滴加缓冲液。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
答案：　(1)W　(2)乙　乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W　(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源　(4)①缓冲液　②缓冲液不能降解W　酶E与天然酶降解W的能力相近
2．(2018·新课标Ⅰ)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。
回答下列问题：
(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有____________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有____________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是___________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是____________________
________________________________________________________________________。
解析：　(1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故所加入的氮源可参与以上物质的合成。(3)能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解成麦芽糖，淀粉遇碘变蓝，向加有淀粉的培养基中加入碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。(4)统计菌落数时一般选择菌落数在30～300个的平板，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。
答案：　(1)细菌　选择　(2)碳源、无机盐　蛋白质、核酸　(3)碘液　淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈　(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差


析个性
第1题本题考查筛选培养基的配制和使用，针对不同要求的目标菌种，选择不同物质配制不同筛选作用的培养基。第2题考查了微生物的实验室培养，包括培养基的成分、选择培养基配制的原则
找共性
两个题目都通过实验的形式，重点考查微生物的分离与培养，考查学生的识记能力和判断能力，以及运用所学知识综合分析问题和解决问题的能力


　
1．从混合样品中获得某种微生物的方法通常有两种
(1)可利用该分离对象对某一营养物质有一“嗜好”的原理，专门在培养基中加入或不加该营养物质，从而使它成为一种选择培养基(如在含高浓度NaCl的培养基上分离金黄色葡萄糖球菌，在不含N的培养基上分离圆褐固氮菌)；或根据分离对象对pH、温度和氧气浓度的喜好，改变培养环境的理化性质，使环境条件最适宜该微生物的生存，从而达到分离的目的。
(2)可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑制物，经培养后，原来占优势的微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增殖，使之在数量上占优势(如在加入青霉素的培养基上分离真核微生物)。
2．培养基的成分：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
3．微生物培养的计数过程中，为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。



1．(2019·全国卷Ⅲ)回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是________________________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上________(填“能够”或“不能”)生长，原因是________________________________________。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。
(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是_________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
解析：　本题考查微生物的培养等，意在考查考生的理解能力。(1)细菌培养时常用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏能提供碳源、氮源、磷酸盐、维生素，蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO3不能为微生物提供碳源。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH是不同的，应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是化能自养型细菌，可以空气中的CO2为碳源，因此在没有碳源的培养基上能够生长。(2)在平板培养基上培养细菌时，一般需将平板倒置，这样可以防止皿盖上的水珠落入培养基。(3)不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同种细菌在一定培养条件下表现出各自稳定的菌落特征，可以作为菌种鉴定的重要依据。(4)使用后的培养基在丢弃前需进行灭菌处理，以免污染环境。
答案：　(1)蛋白胨　不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同　能够　硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源　(2)倒置　(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征　(4)灭菌
2．(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：

(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有____________。
(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步____________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。
(3)下图为连续划线法示意图，在图中____________(填图中序号)区域更易获得单菌落。


(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为____________。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度(mg/L)





1
如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________(填序号：①5　②10　③20)倍后，再进行比色。
解析：　(1)富集培养基中蛋白胨、苯酚都是含碳的有机物，可作为碳源。(2)欲富集酚降解菌，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离；平板培养基是固体培养基，除含有水、营养物质(碳源、氮源、无机盐等)外，还需添加琼脂作为凝固剂。(3)利用连续划线法接种时，最后的划线区域(③)中，菌体的密度较小，容易获得单菌落。(4)因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/L，故1～5号比色管中的苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L；根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1 mg/L，需将残留液稀释20倍左右。
答案：　　(1)蛋白胨、苯酚　(2)增加　稀释涂布　凝固剂　(3)③　(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8　③

一、网络构建

二、要语必记
1．培养基及无菌技术
(1)微生物培养基的成分一般包括水、无机盐、碳源、氮源及生长因子等。
(2)制备固体培养基的步骤包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板等。
(3)消毒指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
2．微生物的分离与培养
(1)纯化微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法和稀释涂布平板法都能获得单细胞菌落。平板划线法不能对微生物计数，而稀释涂布平板法能对微生物计数。
(2)用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
3．微生物的利用
(1)纤维素酶是一种复合酶，它至少包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
(2)尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都需使用选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
(3)鉴定尿素分解菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，鉴定纤维素分解菌的方法为刚果红染色法。