2024届人教版高中生物一轮复习基因工程学案

这是一份2024届人教版高中生物一轮复习基因工程学案，共26页。


1．基因工程的诞生(Ⅰ)
2．基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)
3．基因工程的应用(Ⅱ)
4．蛋白质工程(Ⅰ)
1．基因的结构与功能(生命观念)
2．基因工程的操作流程图及蛋白质工程的操作流程图等(科学思维)
3．基因工程的应用和蛋白质工程(科学探究)
4．正确看待转基因生物与环境安全问题(社会责任)

考点1　基因工程的基本工具及基本程序

1．基因工程的概念
(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)优点
①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。
①来源：主要来自原核生物。
②特点：具有专一性，表现在两个方面：
识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
切割——特定核苷酸序列中的特定位点。
③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
④作用结果

(2)DNA连接酶
种类
E·coli DNA连接酶
T4_DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点
③载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
3．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①从基因文库中获取
②人工合成
③利用PCR技术扩增
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成

(3)将目的基因导入受体细胞
①转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
②转化方法
生物类型
植物
动物
微生物
受体细胞
体细胞
受精卵
大肠杆菌或酵母菌等
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射法
感受态细胞法
(4)目的基因的检测与鉴定
方法
检测或鉴定目的
水平
DNA分子杂交技术
检测目的基因的有无
水平分子
分子杂交技术
目的基因是否转录
抗原—抗体杂交
目的基因是否翻译
抗虫或抗病接种实验
是否具有抗虫抗病特性
个体水平
4．PCR技术
(1)原理：DNA复制。
(2)前提：已知目的基因的一段核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
(3)条件：DNA模板、引物、热稳定DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
(4)扩增过程
过程
说明
图解
变性
温度上升到90～95 ℃左右，双链DNA解链为单链

复性
温度下降到55～60 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

延伸
温度上升到70～75 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸

(5)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。


1．限制酶的选择方法

图甲　　　　　　　　　图乙
根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
3．受体细胞的选择
受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，也没有核糖体等细胞器，不能合成蛋白质。


1．用基因工程生产乙肝疫苗时，若选用细菌为受体细胞，则不能得到引起免疫反应的基因表达产物，分析其原因。
提示：大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的内质网、高尔基体等结构，无法对核糖体合成的肽链进行加工。

2．用箭头及必要的文字简述基因组文库和部分基因文库构建过程。
提示：基因组文库的构建过程：某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体。
部分基因文库的构建过程：某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群体。
3．现有一长度为1 000碱基对(bp)的DNA分子，用限制酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1 000 bp；用KpnⅠ单独酶切，得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子片段；用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后得到200 bp和600 bp两种长度的DNA分子片段。尝试绘出该DNA分子的酶切图谱。
提示：

考查基因工程的工具
1．图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

图(a)

图(b)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是___________________________
_____________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。

甲　　　　 乙　 　　　丙
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_____________和_______，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。
[解析]　(1)由题图可知，BamH Ⅰ和Sau3AⅠ两种限制性核酸内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
[答案]　(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可以)　(3)E·coli DNA连接酶　T4 DNA连接酶　T4 DNA连接酶(其他合理答案也可以)
2．(2021·湖南招生适应性测试)p53基因是一种抑癌基因，在恶性肿瘤患者中突变率达50%以上。与人相比，大象体内含有多对p53基因，推测是其很少患肿瘤的主要原因。设计实验探究人p53基因在乳腺肿瘤细胞中的作用。回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增p53基因：首先根据p53基因的核苷酸序列，设计并合成________。其能与变性p53基因单链结合，在____________________催化作用下延伸，如此循环多次。
(2)p53基因表达载体的构建：如图所示，表达载体上除了标注的DNA片段外，在p53基因上游还必须拥有的DNA片段(箭头所示)是________，其作用机理是_________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
外源p53基因插入载体中至少需要两种工具酶，包括准确切割DNA的限制性核酸内切酶和将双链DNA片段“缝合”起来的______________。
(3)乳腺肿瘤细胞培养：完成伦理学审查和病人知情同意书签署后，将患者乳腺肿瘤组织块剪碎，制成细胞悬液在适宜的条件下培养。培养环境中所需的主要气体包括细胞代谢必需的________和维持培养液pH的________。保持培养环境处于无菌无毒条件的操作包括___________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
(4)检测p53基因表达对乳腺肿瘤细胞增殖的影响：分别将空载体和p53表达载体转入肿瘤细胞培养，采用特殊方法检测细胞增殖情况，并从培养的肿瘤细胞中提取蛋白质，用相应的________进行杂交，检测p53基因翻译成蛋白质的情况，探索杂交带强度与细胞增殖率相关性。
[解析]　(1)用PCR技术进行DNA扩增，因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此首先要设计合成引物，使其和p53基因单链结合，在热稳定DNA聚合酶(Taq酶)的催化下延伸。(2)构建基因表达载体后为能保证基因的正常转录，在基因上游应拥有启动子，启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，基因表达载体构建需要限制性核酸内切酶将DNA切开，DNA连接酶将目的基因和载体连接起来。(3)细胞培养所需气体主要有O2和CO2，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95%空气加5%CO2的混合气体的培养箱中进行培养，为了保持无菌无毒的环境，会对培养液和所有培养用具进行无菌处理。通常还要在细胞培养液中添加一定量的抗生素，以防止培养过程中的污染。(4)根据分析，提取蛋白质用相应的抗体进行杂交，检测p53基因翻译成蛋白质的情况，探索杂交带强度与细胞增殖率相关性。
[答案]　(1)引物　热稳定DNA聚合酶(或Taq酶)　(2)启动子　RNA聚合酶识别、结合和开始转录的序列　DNA连接酶　(3)O2　CO2　培养液灭菌、加抗生素抑制细菌生长　(4)抗体
基因工程的操作程序
3．(2022·衡水中学检测)刺突糖蛋白(S蛋白)是新冠病毒入侵人体细胞及决定其抗原性的关键蛋白质。新冠病毒进入人体后，S蛋白与人体细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，从而侵入细胞内，某科研团队利用改造的腺病毒为载体，通过基因工程的技术手段，将腺病毒的一部分基因替换成新冠病毒的S蛋白基因，进行疫苗研发。回答下列问题：
(1)选用的腺病毒需要经过人工改造后，才能作为制备该疫苗的载体。改造后的腺病毒除了具有对宿主细胞无害、能够在细胞中自我复制的特点外，还应该具有____________、____________等。
(2)在制备疫苗的过程中，常采用________技术获取和扩增新冠病毒的S蛋白基因。扩增时，除了模板、四种脱氧核苷酸，还需要加入________和引物。加入的引物需要两种的理由是____________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)在将腺病毒的一部分基因替换成新冠病毒的S蛋白基因的过程中，需要用到的酶是__________和________。
(4)该疫苗的前期临床研究表明，接种疫苗后人体内产生了针对S蛋白的抗体，当新冠病毒侵染接种过疫苗的人体内后，无法侵入人体细胞进行繁殖，其原因是_________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)根据基因工程中载体的特点，同时结合疫苗的特点，改造后的腺病毒应有一至多个限制酶切割位点、对人体细胞无害、能够在细胞中自我复制、有标记基因等。(2)在制备疫苗的过程中，常采用PCR技术获取和扩增新冠病毒的S蛋白基因。在PCR扩增时，除了模板、四种脱氧核苷酸，还需要加入Taq酶(热稳定DNA聚合酶)和两种引物。DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增，因此需要两种引物分别和两条模板链结合。(3)在目的基因和载体重组的过程中，需要用限制酶切割后用DNA连接酶进行连接。(4)根据题干情境，S蛋白是新冠病毒入侵人体细胞及决定其抗原性的关键蛋白质，新冠病毒进入人体后，S蛋白与人体细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，从而侵入细胞内，当抗体与S蛋白结合后，病毒S蛋白无法和细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，病毒无法侵入人体细胞，从而失去增殖的能力。
[答案]　(1)(一至多个)限制酶切割位点　标记基因　(2)PCR　Taq酶(或热稳定DNA聚合酶)　DNA的两条链是反向平行的，DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增　(3)限制酶　DNA连接酶　(4)当新冠病毒侵入机体后，该抗体能够识别新冠病毒的S蛋白，并与之结合，导致病毒S蛋白无法和细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，病毒无法侵入人体细胞，从而失去增殖能力
4．(2022·衡水中学检测)2020年初，国内牛奶制品因为牧草进口成本上涨而涨价的现象引起了人们的关注。紫花苜蓿是一种重要的牧草。某研究团队拟将耐盐基因HLA1导入紫花苜蓿中培育耐盐牧草。具体实验流程如图甲。图乙是载体pCHLA1中T­DNA示意图。回答下列问题：

图甲　实验流程图

图乙　T­DNA示意图
(1)过程①称为______________，过程②需要使用的工具酶是____________。过程③的转化方法是______________________。
(2)已知Basta是一种除草剂，则为达到培养并筛选的目的，过程④的培养基应有哪些成分？__________________。
(3)过程④得到的幼苗________(填“一定”“一定不”或“不一定”)含有HLA1基因，为进一步确认，可用PCR扩增的方法进行鉴定，则进行PCR反应的引物应根据_________设计。
(4)判断本实验的目的是否达到，还应进行________实验。
[解析]　(1)过程①为从酵母菌中获取目的基因，过程②为基因表达载体的构建，需要限制酶和DNA连接酶，过程③为农杆菌转化法。(2)过程④植物组织培养需要筛选出导入成功的细胞。培养基的营养成分应包括有机营养、无机营养、植物激素，此外还应加入除草剂Basta进行筛选。(3)可能存在仅导入了空载体的情况，因此不一定含有目的基因。应根据HLA1基因序列设计PCR引物。(4)耐盐牧草是否培育成功还需要对牧草进行耐盐检测实验。
[答案]　(1)目的基因的获取　限制酶、DNA连接酶　农杆菌转化法　(2)有机营养、无机营养、植物激素、Basta　(3)不一定　HLA1基因序列　(4)耐盐检测
考点2　基因工程的应用和蛋白质工程

1．植物基因工程
(1)抗虫转基因植物：用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。
(2)抗病转基因植物：使用最多的是病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因。
(3)抗逆转基因植物：抗逆基因有抗盐碱基因、抗旱基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因等。
(4)利用转基因改良植物的品质：如提高玉米中赖氨基酸含量、延长番茄储存时间、培育新花色的矮牵牛等。
2．动物基因工程
(1)用于提高动物生长速度：将外源生长激素基因转入动物体内，可以提高生长速率。
(2)用于改善畜产品的品质：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大减低。
(3)用转基因动物生产药物：将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，培育乳腺生物反应器。
(4)用转基因动物作器官移植的供体。
3．基因工程药品
(1)受体细胞：多为原核细胞。原因是其繁殖快、多为单细胞，遗传物质相对较少。
(2)方式：利用基因工程培育“工程菌”来生产药品。
(3)成果：利用“工程菌”可生产细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
4．基因治疗
(1)概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。
(2)类型：体外基因治疗和体内基因治疗。
(3)实质：正常基因的表达掩盖病变基因的表达，达到治疗疾病的目的。
(4)成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入患者的淋巴细胞中，治疗复合型免疫缺陷症。
5．蛋白质工程
(1)概念
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
(2)流程图

写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B．翻译，C．分子设计，D．多肽链，E．预期功能。
(3)蛋白质工程与基因工程的比较
①区别
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
②联系
a．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
b．基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。



1．基因工程技术已成功应用于人类生产生活中的诸多方面，请从植物育种或人类疾病预防与治疗方面举一实例，并说明制备该转基因产品的基本技术流程。(限100字以内)
提示：实例一：转基因抗虫棉。从细菌中克隆Bt蛋白基因，构建重组载体，导入棉花细胞后进行组织培养，经过对再生植株中目的基因的检测，获得转基因棉花。
示例二：基因工程胰岛素。克隆人的胰岛素基因，构建重组载体，转入大肠杆菌后，检查目的基因，筛选高产菌株并进行培养，生产胰岛素。

2．通过对Bt蛋白质三维结构图及氨基酸序列进行分析，发现若将该蛋白质结构中一段由14个氨基酸组成的螺旋结构缺失，结构变化后的Bt蛋白质能使棉铃虫具有更高的致死率。若要根据蛋白质工程的原理设计实验对Bt蛋白进行改造，以提高其致死率，写出其实验设计思路。
提示：参照密码子表，找到合成该14个氨基酸的碱基对序列所在的基因位置，将这些碱基对序列进行缺失处理。

基因工程的应用
1．(2022·江西南昌高三联考)胶原蛋白广泛应用于医学、化妆品、化工原料等领域，科研人员开展利用家蚕生产人胶原蛋白的研究。请回答下列问题：
(1)家蚕核型多角体病毒(BmNPV)专性寄生于鳞翅目昆虫，将人胶原蛋白基因与________重组后，构建________。体外克隆目的基因的方法是_____________________________。
(2)BmNPV的p10基因是极强的启动子，将目的基因连接在p10基因的下游，目的是____________。目的基因与p10基因连接时，断裂与连接的化学键都是____________。
(3)重组BmNPV感染家蚕幼虫后，在幼虫淋巴液中提取蛋白质，用____________的方法检测目的基因是否成功表达。相比于大肠杆菌，选择家蚕作为人胶原蛋白的生物反应器，其优点是__________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析]　(1)因为BmNPV专性寄生于鳞翅目昆虫，故将目的基因与BmNPV基因重组，构建基因表达载体，更有利于将目的基因导入家蚕细胞。PCR是指在体外复制特定DNA片段，可在短时间内大量扩增目的基因。(2)启动子位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录。将目的基因与载体连接时，限制酶和DNA连接酶作用的都是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质，可用抗原－抗体杂交的方法。大肠杆菌为原核细胞，家蚕为真核生物，家蚕细胞中的内质网和高尔基体会对人胶原蛋白进行加工，与人体内表达的蛋白质结构和功能更相似。
[答案]　(1)BmNPV基因　基因表达载体　PCR技术　(2)使目的基因在p10基因的驱动下高效表达　磷酸二酯键　(3)抗原－抗体杂交　家蚕细胞中的内质网和高尔基体会对人胶原蛋白进行加工，使表达的胶原蛋白与人的胶原蛋白的结构和功能相似
2．CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，对该研究有突出贡献的科学家被授予2020年诺贝尔化学奖。我国科学家领衔的团队利用CRISPR/Cas9等技术，将人的亨廷顿舞蹈病致病基因(HTT基因)第1外显子(其中含150个CAG三核苷酸重复序列)“敲入”猪基因组内，获得了人—猪“镶嵌”HTT基因，利用胚胎工程技术成功地构建了亨廷顿舞蹈病的动物模型。回答下列问题：
(1)PCR技术是获得人HTT基因常用的方法，制备PCR反应体系时，向缓冲溶液中分别加入人HTT基因模板、4种脱氧核糖核苷酸及____________等，最后补足H2O。
(2)CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于______________酶。与CRISPR/Cas9相比，限制酶的特性决定了其具有___________的局限性。
(3)在实验过程中，为确认实验猪细胞基因组内是否含有人—猪“镶嵌”HTT基因，常用的检测手段包括PCR技术及__________________。
(4)含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞在体外培养时通过细胞分裂，数量不断增加，当细胞贴壁生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖，这种现象称为________________。贴满瓶壁的细胞常用________进行消化处理，以便进行传代培养。
(5)将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程，称为__________________。此后进行体外胚胎培养并移植到代孕母猪体内，最终获得亨廷顿舞蹈病动物模型。
[解析]　(1)PCR技术需要的条件是目的基因模板、4种脱氧核糖核苷酸以及引物和Taq酶等。(2)Cas9可以切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于限制性核酸内切酶。与CRISPR/Cas9相比，限制酶只能识别和切割特定序列，这一特性决定了其具有作用对象单一的局限性。(3)在实验过程中，为确认实验猪细胞基因组内是否含有人—猪“镶嵌”HTT基因，常用的检测手段包括PCR技术及DNA分子杂交技术。(4)当细胞贴壁生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖，这种现象称为接触抑制。贴满瓶壁的细胞常用胰蛋白酶进行消化处理，以便进行传代培养。(5)将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程，称为动物体细胞核移植。
[答案]　(1)引物、Taq酶　(2)限制(性核酸内切)　只能作用于特定的碱基序列　(3)DNA分子杂交技术　(4)接触抑制　胰蛋白酶　(5)动物体细胞核移植
蛋白质工程及应用
3．(2022·河北唐山模拟)枯草杆菌蛋白酶广泛用于洗涤、制革、食品以及医疗等行业中。某研究小组利用蛋白质工程技术提高了枯草杆菌蛋白酶的催化活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程是指通过________或________________，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。
(2)目的基因的获得是利用基因工程改造蛋白质的第一步，目前常用的获取目的基因的方法有______________、________________和________________。
(3)为使目的基因与质粒连接，通常会用两种不同的________________对质粒和目的基因两侧进行切割，其目的是______________。再用__________处理形成重组质粒。
(4)研究小组将该蛋白酶中第188位丙氨酸替换为脯氨酸、第239位谷氨酰胺替换为精氨酸、第262位缬氨酸替换为亮氨酸，结果发现该酶的催化活性大幅度提高。其原因可能是________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。(2)获取目的基因的方式，常见的有从基因文库中获取、利用PCR技术进行扩增、利用DNA合成仪通过化学方法直接人工合成。(3)对目的基因和质粒的切割会用到限制(性核酸内切)酶。用不同限制酶的原因是避免质粒的自我连接、目的基因的自我连接，确保目的基因的插入方向，切割完以后使用DNA连接酶处理，形成重组质粒。(4)题干中描述蛋白酶中的多个氨基酸被替换，因此改变了蛋白酶的空间结构，提高了酶与底物的亲和力，催化活性大幅度提高。
[答案]　(1)基因修饰　基因合成　(2)从基因文库中获取　利用PCR技术扩增　人工合成　(3)限制(性核酸内切)酶　避免质粒的自我连接、目的基因的自我连接，确保目的基因的插入方向　DNA连接酶　(4)改变了蛋白酶的空间结构，提高了酶与底物的亲和力

1．(2022·全国乙卷改编)新冠肺炎出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疾病防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT－PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是________________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是___________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT－PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(或反转录酶)。(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(90～95 ℃)、复性(55～60 ℃)、延伸(70～75 ℃)，故其中温度最低的一步是复性(或退火)。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒或注射过新冠疫苗，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。(4)基因工程的基本操作流程是获取目的基因→基因表达载体的构建(基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与载体结合的基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)。
[答案]　(1)逆转录酶(或反转录酶)　(2)特异性核苷酸序列　退火(或复性)　(3)曾感染新冠病毒，已康复　已感染新冠病毒，是患者　(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与载体结合的基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)
2．(2022·广东选择性考试)“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。

回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__________________，终止子的作用是____________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是____________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于______________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
[解析]　(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的3′端延伸子链。(2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，CO2等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的CO2等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放CO2，而且还可以消耗工业废气中的CO2，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
[答案]　(1)引物　(2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞　终止转录，使转录在需要的地方停下来　(3)CO2等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长　(4)废物的资源化　不仅不排放CO2，而且还可以消耗工业废气中的CO2
3．(2022·湖南选择性考试)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是________________，物质b是________________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是________________。

(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有________________、____________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是________________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是_________________。


(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路________________________。
[解析]　(1)据分析可知，物质a是氨基酸序列，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码的简并，即一种氨基酸可能对应多种密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；酒精消毒后用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
[答案]　(1)氨基酸序列　mRNA　密码的简并　(2)从基因文库中获取目的基因　通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成　DNA双链复制　(3)种类　提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度的破坏　(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；酒精消毒后用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
4．(2022·北京等级考)生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌性激素类物质(E物质)污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白(GFP)等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是____________。
(2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质－受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是______，因而被用于制备监测鱼(MO)。

方案1

方案2
(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本(X)杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ．启动子：________。
①ERE　②UAS　③使基因仅在生殖细胞表达的启动子(P生)　④使基因仅在肌细胞表达的启动子(P肌)
Ⅱ．基因：________。
A．GFP
B．Gal4　　
C．雌性激素受体基因(ER)
D．仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)
(4)SM不育的原因是成体SM自身产生雌性激素，与受体结合后_____________________________________________________________________
________________________________________________造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是______________。
[解析]　(1)将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。(2)由图可知，方案1E物质－受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2E物质－受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。(3)MO和另一亲本(X)杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的，所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)。(4)成体SM自身产生雌性激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。(5)监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。
[答案]　(1)显微注射　(2)监测灵敏度更高 (3)Ⅰ．②　Ⅱ．D　(4)激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 (5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题