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人教版高中生物选择性必修第三册·第1章- 第2节 微生物的培养技术及应用（课件PPT）
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第节 2微生物的培养技术及应用高中生物 选择性必修3第1章简述培养基的配方和微生物培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。阐明微生物选择培养的原理。进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。学习目标微生物原核:真核非细胞类：细菌、放线菌、支原体、蓝藻等酵母菌、霉菌等真菌：原生生物病毒、类病毒、朊病毒等①种类多；②分布广；③易培养；④个体微小；⑤结构简单；⑥繁殖快；⑦代谢强；⑧易变异。微生物的类群微生物的特性（一）球菌（二）杆菌（三）螺旋菌肺炎双球菌金黄色葡萄球菌乳酸链球菌大肠杆菌苏云金芽孢杆菌枯草芽孢杆菌霍乱弧菌幽门螺旋菌齿垢密螺旋体细菌的形态细菌的芽孢 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体（不是繁殖体），叫做芽孢。 芽孢的壁很厚，含水量极低，抗逆性极强（对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力）。 环境适宜时，芽孢可以萌发，形成一个细菌。 菌落具有大小、形状、光泽度、颜色、透明度等基本特征。 菌落是鉴定菌种的重要依据。菌 落 菌落由单个细菌（或其他微生物）细胞或少数同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落。病毒的繁殖 噬菌斑即噬菌体侵染细菌细胞，导致寄主细胞溶解死亡，因而在琼脂培养基表面形成的肉眼可见的透明小圆斑（“负菌落”）。 在适当条件下，一个噬菌体形成一个噬菌斑。 一 微生物的基本培养技术1. 接种工具：① 接种针：直线状，多用于固体培养基穿刺接种。② 接种环：环状，常用于细菌和酵母菌的斜面、平板接种。③ 接种钩：直角状，多用于霉菌和放线菌的接种。2. 涂布器：多用于菌种的分离或微生物平板活菌计数时涂布。3. 吸管：0.1、0.2、0.5、1、5、10mL等移液管，常用于液体接种及菌悬液系列稀释。4. 试管、培养皿、锥形瓶等5. 消毒、灭菌设备：酒精灯、干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅等。6. 无菌实验室、超净工作台等二、基本成分（一）碳源①无机碳源：②有机碳源：CO2、HCO3-等，适于自养生物。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等，适于异养生物。（二）氮源①无机氮源：②有机氮源：N2、NH4＋、NH3、NO3-等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等培养基 人们按照微生物对__________的不同需求，配制出供其 的营养基质叫培养基（三）无机盐1.种类：KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4、CaCl2、Ca(NO3)2、NaCl、FeSO4等。营养物质生长繁殖2.功能（1）参与酶的组成；（2）调节并维持细胞的渗透压；（3）调节pH的平衡。（四）水（1）良好溶剂，参与物质运输；（2）参与细胞内一系列化学反应；（3）酶催化的介质。 注一：最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖。注二：最常用的氮源是铵盐、硝酸盐。注三：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的 碳源、氮源、能源注四：在提供几种主要营养物质外，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2 的需求。例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；在培养霉菌时，需要将培养基调至酸性；在培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性；在培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。三、种类（一）按物理性质分1.5%-2.5%0.2%-0.7%否分离、计数、鉴定观察运动、鉴定菌种工业生产固体培养基：菌落半固体培养基：运动液体培养基：生长（二）按化学成分不明确明确工业大规模生产分类、鉴定（三）按培养基的功能（用途）1.基础培养基（1）成分：一般微生物生长繁殖所需要的基本物质（2）常用类型：牛肉膏蛋白胨培养基（20.0g琼脂）加入相应特殊营养物质或化学物质加入某种特殊的化学物质依据某些微生物的特殊营养需求或对某些物质的敏感性依据微生物的代谢产物与特殊化学物质发生特定的反应，产生明显的特征变化。从众多微生物中分离所需的微生物鉴别不同种类微生物①加入青霉素分离酵母菌和霉菌②缺氮培养基分离固氮菌③高浓度食盐的培养基分离金黄色葡萄球菌④无碳培养基分离自养型微生物①伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌②刚果红培养基鉴别纤维素分解菌一、含义 泛指在分离、接种和培养微生物的操作中，所有防止其他微生物污染的方法。是成功地培养微生物的关键。 无菌技术二、范围1.对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒。2.对培养器皿、接种用具、培养基等进行灭菌。3.在酒精灯旁操作4.已灭菌的材料与周围的物品分开。三、消毒、灭菌 （一）消毒：是指较为温和物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。（不包括芽孢、孢子）1.巴氏消毒法 70℃～75℃煮30min或在85℃煮15min；杀灭非芽孢致病菌，不破坏物料原风味；适用于对牛奶、啤酒等消毒。 2.煮沸消毒法在100℃煮沸5 ～6min可以杀死微生物细胞和部分芽孢。 3.化学药物消毒法①酒精消毒：使细胞脱水、蛋白质变性。 ②氯气消毒：氯气溶于水形成盐酸和次氯酸，次氯酸 可放出新生态的氧，从而杀死细胞。③其他：升汞、高锰酸钾、臭氧、甲酚皂、醋酸等等。4.紫外线消毒法例如，接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。（二）灭菌：强烈的理化方法，杀死物体内外所有微生物（包括芽孢、孢子）1.湿热灭菌 这是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌的效果最好。实验室常用的高压蒸汽灭菌锅（见左下图）就是以水蒸气为介质，在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，维持15～30min来灭菌的。（二）灭菌：强烈的理化方法，杀死物体内外所有微生物（包括芽孢、孢子）将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见下图）。此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。3.灼烧灭菌讨论:1．在高压蒸汽灭菌开始以前，为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽？ 在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到 100 kPa时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。2．灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？ 如果压力未降到零就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力不平衡的缘故 。3．接种操作为什么一定要在火焰旁边进行？ 空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染 。一、培养物与纯培养 在微生物在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。 由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。微生物的纯培养二、纯培养的过程配置培养基→灭菌→接种→分离和培养三、酵母菌的纯培养1.制备培养基（1）配置培养基称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000 mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000 mL。 （2）灭菌： 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15～30min。 将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃灭菌2h。防止污染和挥发灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，也起到隔绝空气中杂菌的作用（3）倒平板 培养基冷却至约50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板：②将瓶口迅速通过火焰，灼烧灭菌①左手拔出棉塞③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10 ～ 20 mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。①加琼脂的目的是什么?②在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的 锥形瓶的目的是什么？③培养皿能否用高压蒸汽灭菌？作为凝固剂。在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌.问题讨论答：用手触摸锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。问题讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，影响微生物的生长。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：最好不要用。因为空气中的微生物可能在此滋生。2.接种和分离酵母菌 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 平板划线的具体操作见下面的流程图：3.培养酵母菌 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 平板划线的具体操作见下面的流程图：问题讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？①操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物②杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。③及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。问题讨论3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。4.平板划线时不能划破培养基的原因？二 微生物的选择培养和计数1.选择培养基（1）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。（2）选择培养基的设计选择培养基配方的设计尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3 再转化为NO3-、NH4+ 等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。讨论如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？提示：培养基的配方中应含有微生物生长所需的营养要素——碳源、氮源、水、无机盐等。由于绝大多数微生物都能利用葡萄糖，分解尿素的细菌也能利用葡萄糖，可以用葡萄糖作为碳源，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，在培养基中加入尿素提供氮源，使培养基具有了选择作用。该培养基以尿素作为唯一氮源，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。讨论2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？该培养基与普通培养基相比较，共同点是都以有机碳（如葡萄糖）作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。101102103104105106（1）梯度稀释菌液：2.微生物的选择培养不超过0.1ml各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照（2）涂布平板：（1）梯度稀释菌液：2.微生物的选择培养（2）涂布平板：（1）梯度稀释菌液：2.微生物的选择培养1.涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第（2）步应如何进行无菌操作？ 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。问题讨论2.培养基的制作是否合格？ 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。3.接种操作是否符合无菌要求？ 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。例、平板划线法和稀释涂布平板法接种大肠杆菌的操作中，相同的是（ ） ①可以用相同的培养基 ②都需要使用接种针进行接种 ③菌液均需稀释后再接种④都可以用来计数活菌⑤依据的原理相同⑥都需要在火焰旁进行接种 A．①② B．③④ C．①⑥ D．②④C（1）显微镜直接计数：可以利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；个体小的细菌在显微镜下难以观察缺点3.微生物的数量测定（2）间接计数法（活菌计数法） ①常用方法： 当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。②原理：稀释涂布平板法思考：活菌计数法统计的菌落数是否与活菌实际数目吻合？为什么？统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只有一个菌落因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的做法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值注：误差太大，须重做或再多设几组?注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值将同一稀释度至少涂布三个平板作重复组，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数来表示。⑤每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 ?原因：⑴土样不同⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照组的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：a.如果结果与A同学一致，则证明A无误；b.如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。一、提出问题土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？土壤中分解尿素的细菌的分离与计数二、使用的培养基：1.从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基2.该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？③此培养基能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖氮源：尿素能。该培养基的唯一氮源为尿素，只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。H2O定容至1000mL三、实验设计㈠.土壤取样细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3 ～ 8 cm 的土壤层。在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤；在农村，则容易收集到农田或菜园里的土壤。你打算选择什么样的土壤做实验呢？◆取样要求：先铲去表层土，再取样。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 （二）样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105 和1×106 倍稀释的稀释液进行平板培养。测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？如果不同，你打算选用多大的稀释范围？当你第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放宽一点。例如，可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30～300 的平板进行计数。◆应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。◆在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。 细菌稀释度为104、105、106 放线菌稀释度为103、104、105 真菌稀释度为102、103、104为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？原因：土壤中各类微生物的数量是不同的。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。（三）微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。本实验中，我们可以每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间：细 菌：30～37℃ 培养1～2d放线菌：25～28℃ 培养5～7d霉 菌：25～28℃ 培养3～4d一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种我微生物表现出稳定的菌落特征。包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。（四）操作提示 1. 将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。2. 要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。3. 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。4. 本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。 （五）结果分析与评价1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落 通过对照实验，若培养物有杂菌污染，对照的培养基菌落数偏高； 若培牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数远大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30 ～ 300 的平板？在这一稀释度下，是否至少有2 个平板的菌落数接近？提示：如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要重新实验。随堂练习1.某细菌固体培养基的组成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固剂是_______，碳源是_______，氮源是_______。已知只有能合成脲酶的细菌才能在该培养基上生长，故该培养基属于_______培养基。从同化作用类型上看，用该培养基培养的细菌属于________。琼脂 葡萄糖 尿素 选择 异养型 随堂练习2.下表表示某培养基的配方，下列有关叙述正确的是( )A.从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基B.培养基中属于碳源的物质主要是蛋白胨，属于氮源的物质也是蛋白胨C.该培养基缺少提供生长因子的物质D.该培养基调节到合适的 pH 后就可以接种菌种A 随堂练习3.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数D 谢 谢！
第节 2微生物的培养技术及应用高中生物 选择性必修3第1章简述培养基的配方和微生物培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。阐明微生物选择培养的原理。进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。学习目标微生物原核:真核非细胞类：细菌、放线菌、支原体、蓝藻等酵母菌、霉菌等真菌：原生生物病毒、类病毒、朊病毒等①种类多；②分布广；③易培养；④个体微小；⑤结构简单；⑥繁殖快；⑦代谢强；⑧易变异。微生物的类群微生物的特性（一）球菌（二）杆菌（三）螺旋菌肺炎双球菌金黄色葡萄球菌乳酸链球菌大肠杆菌苏云金芽孢杆菌枯草芽孢杆菌霍乱弧菌幽门螺旋菌齿垢密螺旋体细菌的形态细菌的芽孢 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体（不是繁殖体），叫做芽孢。 芽孢的壁很厚，含水量极低，抗逆性极强（对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力）。 环境适宜时，芽孢可以萌发，形成一个细菌。 菌落具有大小、形状、光泽度、颜色、透明度等基本特征。 菌落是鉴定菌种的重要依据。菌 落 菌落由单个细菌（或其他微生物）细胞或少数同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落。病毒的繁殖 噬菌斑即噬菌体侵染细菌细胞，导致寄主细胞溶解死亡，因而在琼脂培养基表面形成的肉眼可见的透明小圆斑（“负菌落”）。 在适当条件下，一个噬菌体形成一个噬菌斑。 一 微生物的基本培养技术1. 接种工具：① 接种针：直线状，多用于固体培养基穿刺接种。② 接种环：环状，常用于细菌和酵母菌的斜面、平板接种。③ 接种钩：直角状，多用于霉菌和放线菌的接种。2. 涂布器：多用于菌种的分离或微生物平板活菌计数时涂布。3. 吸管：0.1、0.2、0.5、1、5、10mL等移液管，常用于液体接种及菌悬液系列稀释。4. 试管、培养皿、锥形瓶等5. 消毒、灭菌设备：酒精灯、干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅等。6. 无菌实验室、超净工作台等二、基本成分（一）碳源①无机碳源：②有机碳源：CO2、HCO3-等，适于自养生物。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等，适于异养生物。（二）氮源①无机氮源：②有机氮源：N2、NH4＋、NH3、NO3-等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等培养基 人们按照微生物对__________的不同需求，配制出供其 的营养基质叫培养基（三）无机盐1.种类：KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4、CaCl2、Ca(NO3)2、NaCl、FeSO4等。营养物质生长繁殖2.功能（1）参与酶的组成；（2）调节并维持细胞的渗透压；（3）调节pH的平衡。（四）水（1）良好溶剂，参与物质运输；（2）参与细胞内一系列化学反应；（3）酶催化的介质。 注一：最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖。注二：最常用的氮源是铵盐、硝酸盐。注三：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的 碳源、氮源、能源注四：在提供几种主要营养物质外，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2 的需求。例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；在培养霉菌时，需要将培养基调至酸性；在培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性；在培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。三、种类（一）按物理性质分1.5%-2.5%0.2%-0.7%否分离、计数、鉴定观察运动、鉴定菌种工业生产固体培养基：菌落半固体培养基：运动液体培养基：生长（二）按化学成分不明确明确工业大规模生产分类、鉴定（三）按培养基的功能（用途）1.基础培养基（1）成分：一般微生物生长繁殖所需要的基本物质（2）常用类型：牛肉膏蛋白胨培养基（20.0g琼脂）加入相应特殊营养物质或化学物质加入某种特殊的化学物质依据某些微生物的特殊营养需求或对某些物质的敏感性依据微生物的代谢产物与特殊化学物质发生特定的反应，产生明显的特征变化。从众多微生物中分离所需的微生物鉴别不同种类微生物①加入青霉素分离酵母菌和霉菌②缺氮培养基分离固氮菌③高浓度食盐的培养基分离金黄色葡萄球菌④无碳培养基分离自养型微生物①伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌②刚果红培养基鉴别纤维素分解菌一、含义 泛指在分离、接种和培养微生物的操作中，所有防止其他微生物污染的方法。是成功地培养微生物的关键。 无菌技术二、范围1.对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒。2.对培养器皿、接种用具、培养基等进行灭菌。3.在酒精灯旁操作4.已灭菌的材料与周围的物品分开。三、消毒、灭菌 （一）消毒：是指较为温和物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。（不包括芽孢、孢子）1.巴氏消毒法 70℃～75℃煮30min或在85℃煮15min；杀灭非芽孢致病菌，不破坏物料原风味；适用于对牛奶、啤酒等消毒。 2.煮沸消毒法在100℃煮沸5 ～6min可以杀死微生物细胞和部分芽孢。 3.化学药物消毒法①酒精消毒：使细胞脱水、蛋白质变性。 ②氯气消毒：氯气溶于水形成盐酸和次氯酸，次氯酸 可放出新生态的氧，从而杀死细胞。③其他：升汞、高锰酸钾、臭氧、甲酚皂、醋酸等等。4.紫外线消毒法例如，接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。（二）灭菌：强烈的理化方法，杀死物体内外所有微生物（包括芽孢、孢子）1.湿热灭菌 这是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌的效果最好。实验室常用的高压蒸汽灭菌锅（见左下图）就是以水蒸气为介质，在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，维持15～30min来灭菌的。（二）灭菌：强烈的理化方法，杀死物体内外所有微生物（包括芽孢、孢子）将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见下图）。此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。3.灼烧灭菌讨论:1．在高压蒸汽灭菌开始以前，为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽？ 在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到 100 kPa时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。2．灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？ 如果压力未降到零就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力不平衡的缘故 。3．接种操作为什么一定要在火焰旁边进行？ 空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染 。一、培养物与纯培养 在微生物在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。 由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。微生物的纯培养二、纯培养的过程配置培养基→灭菌→接种→分离和培养三、酵母菌的纯培养1.制备培养基（1）配置培养基称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000 mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000 mL。 （2）灭菌： 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15～30min。 将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃灭菌2h。防止污染和挥发灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，也起到隔绝空气中杂菌的作用（3）倒平板 培养基冷却至约50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板：②将瓶口迅速通过火焰，灼烧灭菌①左手拔出棉塞③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10 ～ 20 mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。①加琼脂的目的是什么?②在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的 锥形瓶的目的是什么？③培养皿能否用高压蒸汽灭菌？作为凝固剂。在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌.问题讨论答：用手触摸锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。问题讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，影响微生物的生长。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：最好不要用。因为空气中的微生物可能在此滋生。2.接种和分离酵母菌 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 平板划线的具体操作见下面的流程图：3.培养酵母菌 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 平板划线的具体操作见下面的流程图：问题讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？①操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物②杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。③及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。问题讨论3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。4.平板划线时不能划破培养基的原因？二 微生物的选择培养和计数1.选择培养基（1）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。（2）选择培养基的设计选择培养基配方的设计尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3 再转化为NO3-、NH4+ 等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。讨论如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？提示：培养基的配方中应含有微生物生长所需的营养要素——碳源、氮源、水、无机盐等。由于绝大多数微生物都能利用葡萄糖，分解尿素的细菌也能利用葡萄糖，可以用葡萄糖作为碳源，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，在培养基中加入尿素提供氮源，使培养基具有了选择作用。该培养基以尿素作为唯一氮源，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。讨论2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？该培养基与普通培养基相比较，共同点是都以有机碳（如葡萄糖）作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。101102103104105106（1）梯度稀释菌液：2.微生物的选择培养不超过0.1ml各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照（2）涂布平板：（1）梯度稀释菌液：2.微生物的选择培养（2）涂布平板：（1）梯度稀释菌液：2.微生物的选择培养1.涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第（2）步应如何进行无菌操作？ 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。问题讨论2.培养基的制作是否合格？ 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。3.接种操作是否符合无菌要求？ 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。例、平板划线法和稀释涂布平板法接种大肠杆菌的操作中，相同的是（ ） ①可以用相同的培养基 ②都需要使用接种针进行接种 ③菌液均需稀释后再接种④都可以用来计数活菌⑤依据的原理相同⑥都需要在火焰旁进行接种 A．①② B．③④ C．①⑥ D．②④C（1）显微镜直接计数：可以利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；个体小的细菌在显微镜下难以观察缺点3.微生物的数量测定（2）间接计数法（活菌计数法） ①常用方法： 当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。②原理：稀释涂布平板法思考：活菌计数法统计的菌落数是否与活菌实际数目吻合？为什么？统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只有一个菌落因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的做法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值注：误差太大，须重做或再多设几组?注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值将同一稀释度至少涂布三个平板作重复组，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数来表示。⑤每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 ?原因：⑴土样不同⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照组的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：a.如果结果与A同学一致，则证明A无误；b.如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。一、提出问题土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？土壤中分解尿素的细菌的分离与计数二、使用的培养基：1.从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基2.该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？③此培养基能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖氮源：尿素能。该培养基的唯一氮源为尿素，只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。H2O定容至1000mL三、实验设计㈠.土壤取样细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3 ～ 8 cm 的土壤层。在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤；在农村，则容易收集到农田或菜园里的土壤。你打算选择什么样的土壤做实验呢？◆取样要求：先铲去表层土，再取样。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 （二）样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105 和1×106 倍稀释的稀释液进行平板培养。测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？如果不同，你打算选用多大的稀释范围？当你第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放宽一点。例如，可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30～300 的平板进行计数。◆应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。◆在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。 细菌稀释度为104、105、106 放线菌稀释度为103、104、105 真菌稀释度为102、103、104为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？原因：土壤中各类微生物的数量是不同的。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。（三）微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。本实验中，我们可以每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间：细 菌：30～37℃ 培养1～2d放线菌：25～28℃ 培养5～7d霉 菌：25～28℃ 培养3～4d一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种我微生物表现出稳定的菌落特征。包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。（四）操作提示 1. 将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。2. 要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。3. 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。4. 本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。 （五）结果分析与评价1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落 通过对照实验，若培养物有杂菌污染，对照的培养基菌落数偏高； 若培牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数远大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30 ～ 300 的平板？在这一稀释度下，是否至少有2 个平板的菌落数接近？提示：如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要重新实验。随堂练习1.某细菌固体培养基的组成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固剂是_______，碳源是_______，氮源是_______。已知只有能合成脲酶的细菌才能在该培养基上生长，故该培养基属于_______培养基。从同化作用类型上看，用该培养基培养的细菌属于________。琼脂 葡萄糖 尿素 选择 异养型 随堂练习2.下表表示某培养基的配方，下列有关叙述正确的是( )A.从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基B.培养基中属于碳源的物质主要是蛋白胨，属于氮源的物质也是蛋白胨C.该培养基缺少提供生长因子的物质D.该培养基调节到合适的 pH 后就可以接种菌种A 随堂练习3.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数D 谢 谢！
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