第2章　细胞工程 第2节　动物细胞工程课件PPT

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第2节　动物细胞工程目 标 素 养1.通过对动物细胞培养过程及条件的分析,形成物质观、稳态与平衡观。2.结合对动物细胞培养、单克隆抗体制备、动物体细胞核移植过程的分析,建立结构与功能观。3.运用对比、归纳与概括的方法,总结动物细胞融合与植物细胞融合的原理及过程,分析两者的异同,培养知识迁移能力。4.关注动物细胞培养、单克隆抗体、动物体细胞核移植技术的应用,关注克隆动物的应用前景和最新进展,树立科学的价值观以及人与社会协调发展的生态观。知 识 概 览一、动物细胞培养1.概念动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后在适宜的培养条件下,让这些细胞生长和增殖的技术。2.地位动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等,其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。3.动物细胞培养的条件(1)营养。细胞在体外培养时,培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。在使用合成培养基时,通常需要加入血清等一些天然成分。(2)无菌、无毒的环境。①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理;②在无菌环境下进行操作;③培养液还需要定期更换,以便清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。(3)温度、pH和渗透压。维持细胞生存必须有适宜的温度。哺乳动物细胞培养的温度多以(36.5±0.5) ℃为宜。多数动物细胞生存的适宜pH为7.2~7.4。此外,渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。(4)气体环境。O2是细胞代谢所必需的;CO2的主要作用是维持培养液的pH。4.动物细胞培养的过程 5.相关概念(1)细胞贴壁:细胞悬液中分散的细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上的现象。大多数细胞贴壁生长。(2)接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞通常会停止分裂增殖的现象。(3)原代培养:分瓶之前的细胞培养,即动物组织经处理后的初次培养。(4)传代培养:分瓶后的细胞培养。6.干细胞培养及其应用(1)胚胎干细胞存在于早期胚胎中,具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞,并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。(2)成体干细胞具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织,不具有发育成完整个体的能力。微点拨1不是所有细胞都存在接触抑制,如癌细胞增殖时不存在接触抑制,在培养瓶中可以形成多层细胞。微思考1植物组织培养的原理是细胞的全能性,动物细胞培养能体现细胞的全能性吗?提示:植物组织培养的结果一般是形成完整的植株,体现了植物细胞的全能性。而动物细胞培养的目的是获得细胞或细胞产物,没有发生细胞分化,其过程不能体现细胞的全能性。二、动物细胞融合技术1.概念动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2.结果融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。3.诱导方法(1)物理法:电融合法等。(2)化学法:PEG融合法等。(3)生物法:灭活病毒诱导法等。4.意义细胞融合技术突破了有性杂交的局限,使远缘杂交成为可能。5.应用成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段,特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术,为制造单克隆抗体开辟了新途径。微思考2动物细胞融合完成的标志是什么?提示:动物细胞融合完成的标志是细胞核融合。微训练下列有关动物细胞融合的叙述,错误的是(　　)A.使远缘杂交成为可能B.杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息C.其基本原理是细胞膜的选择透过性D.为制造单克隆抗体开辟了新途径答案:C解析:动物细胞融合的原理是细胞膜具有流动性,C项错误。三、单克隆抗体及其应用1.传统的抗体制备(1)方法:向动物体内反复注射某种抗原,使动物产生抗体,然后从动物血清中分离所需抗体。(2)缺点:产量低、纯度低、特异性差。2.单克隆抗体制备原理(1)B淋巴细胞:每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体,但在体外培养条件下,一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。(2)骨髓瘤细胞:在体外培养条件下,能无限增殖,但不能产生抗体。(3)杂交瘤细胞:将一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合,得到的杂交瘤细胞,既能迅速大量增殖,又能产生抗体。3.单克隆抗体制备过程 微点拨2制备单克隆抗体时,要对小鼠注射抗原进行免疫。B淋巴细胞要经过免疫过程,即受抗原刺激后才能增殖、分化为有特异性免疫功能的浆细胞,进而产生相应的抗体,所以与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是浆细胞。四、动物体细胞核移植技术和克隆动物1.概念动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中,使这个重新组合的细胞发育成新胚胎,继而发育成动物个体的技术。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。2.类型哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植,因为动物胚胎细胞分化程度低,表现全能性相对容易,而动物体细胞分化程度高,表现全能性十分困难。3.过程微点拨3克隆动物的亲本有3个,分别是供体(提供细胞核)、提供去核卵母细胞的动物和代孕母体。克隆动物的绝大部分性状与供体动物相同,少数性状与提供去核卵母细胞的动物相同,与代孕动物的性状无遗传关系。克隆动物的产生过程属于无性生殖,基因型不变。微判断利用动物体细胞核移植技术成功培育出了克隆动物验证了动物体细胞的全能性。( )×一 动物细胞培养、动物体细胞核移植技术重难归纳1.动物细胞培养的原理:细胞增殖。易错提醒 动物细胞培养的原理是细胞增殖,其结果是得到克隆细胞群,而不是得到动物个体。2.动物细胞培养过程常用胰蛋白酶分散细胞的原因在从动物体取出的成块组织中,细胞与细胞靠在一起,彼此限制了生长和增殖。同时动物细胞间一般存在接触抑制现象,并且单个细胞与外界的物质交换更迅速,因此,在进行细胞培养时要用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。胰蛋白酶的作用是分解组织细胞间质中的胶原蛋白使细胞相互分散,分散后细胞能与培养液充分接触,以保证细胞所需氧气和营养物质的供应,以及细胞代谢物的及时排出。3.动物细胞培养的过程可归纳为4个“2”(1)培养材料为“2”:即动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,因为这些组织或器官中的细胞生命力旺盛、分化程度低、分裂能力强。(2)培养过程为“2”:即原代培养和传代培养。原代培养和传代培养以分瓶为界,即配制细胞悬液后转入培养液中的初次培养为原代培养,分瓶后的细胞培养(无论分瓶多少次)均为传代培养。(3)胰蛋白酶使用“2”次:即原代培养和传代培养中均使用。第一次使用胰蛋白酶处理组织使之分散成单个细胞;第二次使用胰蛋白酶的目的是使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来,分散成单个细胞。(4)原代培养的细胞生长特点有“2”个:即细胞贴壁生长和接触抑制。4.动物体细胞核移植(1)原理:动物细胞核的全能性。(2)体细胞核移植的过程理解。①将卵母细胞去核的原因是保证克隆动物的遗传物质主要来自有重要利用价值的供体动物。②核移植过程中,供体理论上是提供细胞核,但操作过程中可以把整个体细胞注入去核的卵母细胞中,原因是体细胞体积相对较小,取核难度较大,另外细胞膜对核融合的障碍性较小。③细胞融合后构建重构胚,并移植到代孕母体内获得克隆动物,需要胚胎工程技术的支持,因此克隆动物用到的技术有动物细胞培养、动物细胞融合和胚胎移植。规律总结 (1)重组细胞:体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞之后形成的细胞。(2)杂交细胞:不同动物细胞融合形成的细胞。我国科学家于2017年培育成功了世界上首批体细胞克隆猴“中中”和“华华”。(1)克隆技术为什么用MⅡ期的去核卵母细胞作为核移植的受体细胞?提示:①选择卵母细胞的原因:卵母细胞体积大,易于操作;卵黄多,营养物质丰富,能满足早期胚胎发育对营养物质的需求;卵母细胞的细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质,能激发重组细胞分裂、分化。②MⅡ期的卵母细胞具备受精能力,细胞质中能合成与分裂、分化有关的物质,并能刺激融合后的重组细胞进行分裂、分化,形成重构胚。(2)培养动物细胞所用培养基和植物组织培养所用培养基有什么区别?提示:动物细胞培养一般使用的是液体培养基,通常需要添加一定量的动物血清等天然成分,以便为细胞提供营养物质和生长因子。植物组织培养一般使用的是固体培养基,需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素。典例剖析1.一般来说,动物细胞体外培养需要满足的条件是(　　)①无毒的环境　②无菌的环境　③合成培养基中需加入血清　④适宜的温度　⑤需要O2,也需要CO2　⑥适宜的pHA.①②③④⑤⑥　　 B.①②③④C.①②④⑤⑥ D.①②③④⑥答案:A解析:动物细胞体外培养要求环境无菌、无毒,含有一定的营养物质,合成培养基中通常需要加入血清等一些天然成分,哺乳动物细胞培养的温度多以(36.5±0.5 ℃)为宜,多数动物细胞生存的适宜pH为7.2~7.4。O2是细胞代谢所必需的,CO2可以维持培养液的pH。2.下列关于动物体细胞核移植技术和克隆动物的叙述,正确的是(　　)A.目前在实验中,科学家可以用类似植物组织培养的方法获得完整的动物个体B.动物体细胞核移植中所用的卵母细胞需在体外培养至减数分裂Ⅱ中期C.动物体细胞分化程度高,表现全能性相对容易D.用体细胞核移植技术培育的克隆动物,其核基因发生改变答案:B解析:与植物细胞相比,动物细胞的全能性受到限制,目前,还不能用类似植物组织培养的方法获得克隆动物。动物体细胞分化程度高,表现全能性十分困难,用体细胞核移植技术培育的动物,其核基因未发生改变。学以致用1.下列关于动物细胞培养的叙述,错误的是(　　)A.动物细胞培养液中应添加一定量的抗生素,以防止培养过程中的污染B.用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理剪碎的动物组织,可使其分散成单个细胞C.动物细胞培养的气体环境是含有95%O2和5%CO2的混合气体D.动物细胞培养没有体现动物细胞的全能性C解析:动物细胞培养液中应添加一定量的抗生素,以防止培养过程中杂菌的污染,A项正确。用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理剪碎的动物组织,可使其分散成单个细胞,B项正确。动物细胞培养的气体环境是含有95%空气和5%CO2的混合气体,C项错误。动物细胞培养没有发生细胞分化,没有体现动物细胞的全能性,D项正确。2.下列对动物体细胞核移植技术的叙述,错误的是(　　)A.动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植B.细胞核遗传物质来自提供细胞核的体细胞C.细胞质遗传物质来自去核的卵母细胞D.细胞核移植是体细胞克隆的关键步骤答案:C解析:动物体细胞与胚胎细胞相比,分化程度高,表现全能性十分困难,因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植,A项正确。细胞核遗传物质完全来自供体,而细胞质遗传物质来自供体和去核卵母细胞,B项正确,C项错误。细胞核移植是体细胞克隆的关键步骤,D项正确。二 动物细胞融合技术与单克隆抗体重难归纳1.动物细胞融合技术(1)原理:细胞膜的流动性。(2)结果:形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞。如果只考虑两两融合,融合形成的杂交细胞具有两种细胞的遗传信息,通过动物细胞培养,杂交细胞表现出两个亲本细胞的特点。(3)灭活病毒(失去感染能力,保留融合活性)诱导细胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用,使细胞互相凝聚,细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。融合过程如下图所示。易错提醒 (1)细胞融合也称为细胞杂交。“细胞杂交”是动物细胞融合的过程,“杂交细胞”是“细胞杂交”的产物。(2)用灭活病毒诱导是动物细胞融合的特有方法,不适用于植物原生质体融合。(3)用病毒作为诱导剂时,必须事先灭活,使病毒失去感染和增殖能力,但不破坏病毒的抗原结构。不灭活的病毒不能作为诱导剂,因为其会感染细胞,不能诱导细胞融合。(4)融合后的细胞不能直接用于培养,还需要进一步筛选。因为诱导融合后形成的融合细胞有多种,需要筛选出所需要的杂交细胞。2.单克隆抗体及其应用(1)单克隆抗体制备的过程分析。①B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的获取:用特定的抗原对小鼠进行免疫,并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞;骨髓瘤细胞可以通过先获得骨髓细胞再诱发癌变获取,也可从患骨髓瘤的小鼠体内提取。②杂交细胞:诱导融合形成的杂交细胞有多种,若仅考虑两两融合,则形成的杂交细胞有3种:B—B型、B—瘤型、瘤—瘤型。其中B—瘤型才是我们所需要的,即杂交瘤细胞。所以需用特定的选择培养基进行筛选。③两次筛选的目的。 ④单克隆抗体的获取场所。a.体外培养——从细胞培养液中获取。b.注射到小鼠腹腔内——从小鼠腹水中获取。(2)血清抗体与单克隆抗体的比较。①血清抗体:向动物体内反复注射某种抗原,使动物产生抗体,然后从动物血清中分离所需抗体。用这种方法制备的抗体不仅产量低、纯度低,而且特异性差。②单克隆抗体:由杂交瘤细胞分泌,能准确地识别抗原的细微差异,与特定抗原发生特异性结合,并且可以大量制备。(3)技术手段:人工免疫、动物细胞培养、动物细胞融合。特别提醒 与体外培养相比,杂交瘤细胞在小鼠腹腔内培养的优点是不需要特定的培养基,不需要严格的外界环境条件。(4)单克隆抗体的应用。单克隆抗体被广泛用作诊断试剂,在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要的作用。在医药领域,单克隆抗体药物占有非常重要的地位。单克隆抗体药物包括单克隆抗体制品和单克隆抗体偶联物,由于单克隆抗体对相应靶分子(抗原)的识别具有高度的特异性,所以单克隆抗体药物已用于肿瘤、病毒性感染、类风湿关节炎、心血管疾病以及器官移植中的抗排异反应。单克隆抗体药物在医学和生物学领域得到了广泛应用,近年来其作为治疗剂又再度成为生物技术药物领域引人注目的研究热点。(1)单克隆抗体制备与动物细胞融合、动物细胞培养有什么关系?提示:单克隆抗体的制备,首先要通过细胞融合获得多种杂交细胞,然后用选择培养基筛选获得杂交瘤细胞,而杂交瘤细胞要发挥其能大量增殖、产生特异性抗体的优点,需通过动物细胞培养才能实现。所以无论是动物细胞融合还是单克隆抗体的制备,都要以动物细胞培养为基础。(2)动物细胞融合与受精作用有什么区别?提示:①受精作用是在同种生物之间进行的,精子和卵细胞来自同一种生物个体。精子与卵细胞不需要任何诱导剂就能形成受精卵,受精卵内具有同种生物的两个亲本的遗传物质。②动物细胞融合是在同种或不同物种间进行的体细胞融合。自然条件下不能融合成杂交细胞,必须在诱导剂作用下才能融合。形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。典例剖析①~⑥是应用动物细胞工程获取单克隆抗X抗体的具体操作步骤,下列相关叙述错误的是(　　)①将X抗原注入小鼠体内,获得能产生抗X抗体的B淋巴细胞　②从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞　③利用电融合法等方法使细胞发生融合　④将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔培养　⑤筛选出能产生抗X抗体的杂交瘤细胞　⑥从小鼠腹水中获取抗体A.实验顺序应该是①②③⑤④⑥B.④过程中产生的多个杂交瘤细胞也称为克隆C.③过程获得的细胞均可无限增殖D.③~⑤的过程中通常要经过两次筛选答案:C解析:利用电融合法等方法使细胞发生融合,若只考虑两个细胞的融合,则有三种融合细胞:两个骨髓瘤细胞融合形成的细胞、两个能产生抗X抗体的B淋巴细胞融合形成的细胞和杂交瘤细胞,其中两个能产生抗X抗体的B淋巴细胞融合形成的细胞不能无限增殖。学以致用用动物细胞融合技术获得单克隆抗体,下列操作步骤错误的是(　　)A.将抗原注入小鼠体内,获得能产生抗体的B淋巴细胞B.用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C.用聚乙二醇作诱导剂,诱导能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合D.筛选杂交瘤细胞,并从中选出能产生所需抗体的细胞群,培养后获取单克隆抗体B解析:将抗原注入小鼠体内,获得能产生抗体的B淋巴细胞,小鼠骨髓瘤细胞与能产生抗体的B淋巴细胞在聚乙二醇或灭活病毒的诱导下融合,融合后的杂交瘤细胞具有原来两个细胞的特性,一方面可以迅速大量增殖,另一方面可以分泌特异性抗体,即单克隆抗体。B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞是动物细胞,无细胞壁,可直接在聚乙二醇或灭活病毒的诱导下进行融合,不需要用纤维素酶进行处理。1.在动物细胞培养过程中,下列处理不恰当的是(　　)A.培养液和培养用具要进行灭菌处理B.提供种类齐全的营养物质C.提供纯氧以保证细胞的呼吸作用D.提供适宜的温度和pH答案:C解析:动物细胞体外培养过程中要保证环境是无菌、无毒的,即需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作,A项正确。培养液中营养成分要充足,以满足细胞增殖的需要,B项正确。动物细胞培养过程需要的气体环境应为含有95%空气和5% CO2的混合气体,空气中的O2是细胞代谢所必需的,CO2用于维持培养液的pH,C项错误。细胞在体外培养时需要适宜的温度和pH,D项正确。D解析:离体动物细胞培养需要无菌、无毒的环境,甲过程表示从实验小鼠身上取下皮肤组织,该过程需要对小鼠进行消毒,A项正确。皮肤细胞培养前需用胰蛋白酶等处理皮肤组织使细胞分散开,并制成细胞悬液,B项正确。丙过程表示原代培养,该过程中会出现接触抑制现象,C项正确。丁过程表示传代培养,由于接触抑制,正常的动物细胞进行培养时在培养瓶壁上只能形成单层细胞,D项错误。3.动物细胞融合属于动物细胞工程的技术手段之一。下列有关动物细胞融合的叙述,正确的是(　　)A.动物细胞融合产生的细胞称为重组细胞B.融合后形成的细胞为单核或多核细胞C.常用的诱导融合的生物诱导剂是聚乙二醇、灭活病毒等D.细胞融合也称细胞杂交,可由两个或多个动物细胞结合形成一个细胞答案:D解析:动物细胞融合产生的细胞称为杂交细胞,核移植产生的细胞称为重组细胞,A项错误。融合后形成具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,B项错误。诱导动物细胞融合的生物诱导剂是灭活病毒,聚乙二醇属于化学诱导剂,C项错误。动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程,D项正确。4.下图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程,下列有关叙述错误的是(　　)A.图中实验小鼠注射的甲是能与抗人体胃癌抗体特异性结合的抗原B.利用PEG融合法、灭活病毒诱导法和电融合法等方法均可诱导细胞融合获得乙C.用特定的选择培养基对乙进行筛选,融合细胞均能生长,未融合细胞均不能生长D.丙需要进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选后可获得足够数量的能分泌所需抗体的丁C解析:题图中从注射了甲的小鼠中获得的B淋巴细胞可以产生特异性抗体,所以甲为相应的抗原,A项正确。利用PEG融合法、灭活病毒诱导法和电融合法等方法均可诱导细胞融合获得杂交细胞,B项正确。用特定的选择培养基对乙进行筛选,在该培养基上,未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡,只有杂交瘤细胞才能生长,C项错误。经过选择培养基的筛选并经克隆化培养和抗体检测呈阳性后,即可获得产生所需抗体的杂交瘤细胞,D项正确。5.下列对动物体细胞核移植技术的叙述,错误的是(　　)A.哺乳动物核移植包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植B.体细胞核移植的过程中可通过显微操作去除卵母细胞中的细胞核C.体细胞核移植过程中通常需将卵母细胞在体外培养到MⅡ期D.通过体细胞核移植方法生产的克隆动物对供核动物进行了100%的复制答案:D解析:哺乳动物核移植包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植,胚胎细胞核移植的成功率更高,A项正确。可通过显微操作去除卵母细胞中的细胞核,B项正确。体细胞核移植中,卵母细胞要在体外培养到MⅡ期,C项正确。通过体细胞核移植方法得到的克隆动物含有供体动物的遗传物质和去核卵母细胞细胞质中的遗传物质,生物的性状还受环境的影响,所以克隆动物的性状与供核动物性状并不完全一致,D项错误。6.下图是单克隆抗体制备流程示意图。请据图回答下列问题。 (1)根据培养基的用途分类,图中HAT培养基属于　　　　培养基。(2)诱导动物细胞融合除了可用诱导植物原生质体融合常用的方法,还可以用　　　　　　法。 (3)最终选出的杂交瘤细胞具有　　　　　、　 　　　　的特点。 (4)最终筛选出的杂交瘤细胞,既可在体外培养,也可注射到小鼠　　　　内进行体内培养,从而获取大量的单克隆抗体。 (5)单克隆抗体与常规的血清抗体相比,最主要的优点是　　 　　,并且可以大量制备。 答案:(1)选择(2)灭活病毒诱导(3)迅速大量增殖　产生特异性(专一)抗体(4)腹腔(5)能准确地识别抗原的细微差异,与特定抗原发生特异性结合