高中生物人教版 (2019)选择性必修3第1节 重组DNA技术的基本工具复习练习题

这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3第1节 重组DNA技术的基本工具复习练习题，共36页。试卷主要包含了关于基因工程下列说法正确的有等内容，欢迎下载使用。
3.1 重组DNA技术的基本工具目标导航

教学目标
课程标准
目标解读
基因工程是一种重组DNA技术。
1. 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2. 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
1. 阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。
2. 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3. 进行DNA的粗提取和鉴定。
教学重点
1. 重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。
2. DNA粗提取和鉴定。
教学难点
1. 基因工程载体需要具备的条件。
2. DNA的粗提取和鉴定。
知识精讲

知识点01 基因工程
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术、基因拼接技术。
操作对象：基因
操作水平：DNA分子水平
操作原理：基因重组
操作环境：体外
基本过程：剪切→拼接→导入→表达
操作结果：定向地改造生物的遗传性状，获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品
优点：定向改造生物体的性状，目的性强（与诱变育种相比）
育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍（与杂交育种相比）

知识点02 基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要从原核生物中分离出来。
（2）种类：约4000种
（3）作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

（4）限制酶识别序列的长度最常见的为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个、或其他数量的核苷酸组成。
①在中轴线两侧切割，形成黏性末端。如：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，为6个核苷酸，并在G和A之间切开。

②在中轴线处切割，形成平末端。如：Sma I限制酶能识别CCCGGG序列，为6个核苷酸，并在G和C之间切开。

2.“分子缝合针”—— DNA连接酶
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。即把脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口连接起来。
(2)类型：

3.“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体
（1）载体作用：将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
（2）载体种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等
（3）最常用载体：质粒

特点：
①裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。
②有一个至多个限制酶切割位点。
③在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
④有特殊的标记基因，如：抗生素的抗性基因（四环素抗性基因(tetr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)等）、荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。
⑤对细胞无毒无害。
⑥大小适中，便于提取和操作。

知识点03 DNA的粗提取与鉴定
（一)提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
DNA粗提取的基本思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
（二)提取DNA的基本原理
1.DNA在NaCl中的的溶解性：

在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。
2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
（1）对酶的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。
（2）对温度的耐受性：大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
（3）对洗涤剂的耐受性：洗涤剂能够瓦解细胞膜，去除脂质和蛋白质但对DNA没有影响。
3.DNA在酒精溶液中的溶解性
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。
（三）DNA的鉴定
沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色


能力拓展

考点01 基因工程的基本工具
一、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。
限制作用实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。一般不切割自身的DNA分子，是由于甲基化的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护，通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为两大类，即I类酶和Ⅱ类酶。
其中，Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等，在所识别的特定碱基序列上有特定的酶切位点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。
限制酶识别DNA序列中的回文序列。回文序列指的是双链DNA或RNA分子中的特定的核苷酸片段，该片段在其中一条链上按5'到3'读取的序列与其互补链上按相同的5'到3'读取的序列一致。例如，DNA序列ACCTAGGT之所以是回文序列，是因为它的互补序列是TGGATCCA，而反向互补序列是ACCTAGGT，和其原来序列一致。有些限制酶的切割位点在回文的一侧（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端；另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平末端。
二、DNA连接酶
DNA连接酶分为两大类:一类是利用ATP 催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖ATP的DNA 连接酶；另一类是利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖NAD+的DNA 连接酶。DNA连接酶是通过催化形成磷酸二酯键把两条DNA（双股或是单股DNA）黏合成一条。
教材中提到的E·coliDNA连接酶，来源于大肠杆菌，可用于连接粘性末端；T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。E·coliDNA连接酶对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部分活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。T4DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键。
三、 载体
基因工程中常用的运载体主要有两类：
一类运载体是噬菌体或某些病毒等。
另一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核之外的环状DNA，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌拟核DNA中，随着拟核DNA的复制而复制。
质粒作为载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。
复制子是含有DNA复制起始位点的一段DNA，也包括表达由质粒编码的复制必需的RNA和蛋白质的基因。
克隆位点是限制性内切酶切割位点，外源性DNA可由此插入质粒内，而且并不影响质粒的复制能力，或为宿主提供选择性表型。一般地，载体都含有多克隆位点，多克隆位点的存在可以确保载体合适大部分的DNA片段，可以针对插入片段提供特定的酶切位点图谱，防止插入片段插入不恰当的位置，在质粒重组操作方面具有更大的灵活性。
编码抗生素抗性的基因是最普遍的细菌选择性标志（如pBR322）。主要的抗生素抗性基因有：氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因和卡那霉素抗性基因四种。
【典例1】下列有关基因工程基本工具的叙述,错误的是 ( )
A. DNA连接酶与限制酶作用的化学键相同
B. 限制酶可以对烟草花叶病毒的核酸进行切割
C. 载体质粒的复制和表达也遵循中心法则
D. E·coli DNA连接酶来自大肠杆菌,只能连接黏性末端
【答案】B
【解析】【解析】DNA连接酶与限制酶都作用于磷酸二酯键，A正确；烟草花叶病毒的核酸是RNA，限制酶切割的是DNA，B错误；质粒是一种小型环状DNA分子，其复制和表达的过程也遵循中心法则，C正确；E·coli DNA连接酶是从大肠杆菌中分离获得的，它只能连接黏性末端，D正确。
【典例2】下列有关DNA连接酶和DNA聚合酶的叙述正确的是（　　）
A. 二者都是基因工程基本操作程序中常用的工具酶
B. 两者都催化同一种化学键的形成
C. 二者都能将两条DNA单链间的氢键连接起来
D. 在PCR反应中，用到了DNA连接酶
【答案】B
【解析】解：A、DNA聚合酶不是基因工程基本操作程序中常用的工具酶，A错误；
BC、两者都催化同一种化学键（磷酸二酯键）的形成，B正确；C错误；
D、在PCR反应中，用到了热稳定DNA聚合酶，没有采用DNA连接酶，D错误。
故选：B。
基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂．
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键．
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒．
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确判断各选项．
【典例3】下列关于基因工程中限制酶的描述，错误的是（　　）
A. 一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列
B. 限制酶的活性受温度影响
C. 限制酶能识别和切割RNA
D. 限制酶是基因工程最基本的工具之一
【答案】C
【解析】解：A、限制酶具有专一性，一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，A正确；
B、酶的作用条件温和，其活性受温度、pH的影响，B正确；
C、限制酶只能识别和切割DNA，不能识别和切割RNA，C错误；
D、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体，所以限制酶是基因工程最基本的工具之一，D正确。
故选：C。
有关限制酶，考生可以从以下几方面把握：
（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来．
（2）特点：具有特异性，即能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂．
（3）作用结果：形成黏性末端或平末端两种．
本题考查基因工程的原理及技术，重点考查限制酶的相关知识，要求考生识记限制酶的来源、特点及作用，能结合所学的知识准确判断各选项，属于考纲识记层次的考查．限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA两条链分别切开时，产生的是黏性末端；限制酶在它识别序列的中心轴线将DNA切开时，产生的是平末端．
【典例4】如图是基因工程主要技术环节中的一个基本步骤，这一步骤需用到的工具是（　　）

A. 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 B. DNA聚合酶和限制性核酸内切酶
C. DNA连接酶和解旋酶 D. DNA聚合酶和RNA聚合酶
【答案】A
【解析】解：图中构建基因表达载体时，首先要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA和运载体，其次要用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA。
故选：A。
分析题图：图示表示基因表达载体的构建过程，是基因工程的核心步骤。
本题结合模式图，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作工具及操作步骤，掌握各操作工具的作用及操作步骤的需注意的细节，再结合所学的知识准确答题。
【典例5】图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，其等位基因d位于图1中虚线方框内的碱基对为T-A，图2表示某质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC，↓GATC、CCC↓GGG．下列有关叙述不正确的是（　　）

A. 若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的DNA片段有537bp、790bp、661bp三种长度
B. 从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，得到5种不同长度的DNA片段
C. 若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，则应选用BamHⅠ
D. 为了筛选出含有上述重组质粒的大肠杆菌，可选择添加抗生素B的培养基进行培养
【答案】B
【解析】解：A、SmaⅠ识别的序列为CCCGGG，切割会产生平末端；图1中DNA片段含有两个SmaⅠ识别位点，第一个识别位点在左端534 bp序列向右三个碱基对的位置；第二个识别位点在右端658bp序列向左三个碱基的位置，从而两个位点切割后产生的DNA片段的长度分别为534+3，796-3-3，658+3，即得到的DNA片段长度为537bp、790bp、661bp，A正确；
B、在杂合子体内含有基因D和基因d，基因D的序列中含有两个识别位点，经过SmaI完全切割会产生537bp、790bp和661bp三种不同长度的片段，基因d的序列中含有一个识别位点，经过切割后会产生1327bp和661bp两种长度的片段，综上所述，杂合子中分离到该基因的DNA片段经过切割后会产生4种不同长度的片段，B错误；
C、能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为GGATCC的BamH I和识别序列为GATC的MboI，若使用Mbo I会同时破坏质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因，所以要用BamHI来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的抗生素B抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的大肠杆菌，C正确；
D、用限制酶BamHⅠ切割质粒会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能在含有抗生素B的培养基上生存，因此为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加抗生素B的培养基培养，D正确。
故选：B。
根据题意和图示分析可知：
图1中DNA片段含有2个限制酶SmaⅠ切割位点，若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，能产生2个平末端，产生长度为534+3=537bp、796-3-3=790bp、658+3=661bp的三种DNA片段。基因D两侧序列为GGATCC，可被限制酶BamHⅠ切割。
图2中：质粒含有CCGG序列、GGATCC序列和GATC序列，其中CCGG序列可被限制酶MspⅠ切割，GGATCC序列和GATC序列可被限制酶MboⅠ切割。用限制酶BamHⅠ切割破坏了抗生素A抗性基因，但没有破环抗生素B抗性基因，因此含有重组质粒的大肠杆菌能抗抗生素B，但不能抗抗生素A。
本题考查基因工程操作的相关知识，意在考查考生的识记能力和理解所学知识要点的能力；能运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确的结论的能力。

考点02 DNA的粗提取与鉴定
1. 实验材料的选取：
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
2.破碎细胞，获取含DNA的滤液
如果是动物细胞，则破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
3.去除滤液中的杂质：
法一：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。当氯化钠的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。
法二：是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA，从而使提取的DNA与蛋白质分开；
法三：是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
【典例1】如图是“DNA粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，相关叙述正确的是（　　）

A. 图1中溶液a是0.14 mol•L-1的NaCl溶液
B. 图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
C. 图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
D. 图2试管1的作用是证明2 mol•L-1 NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
【答案】C
【解析】解：A、图1中溶液a是2mol•L-1的NaCl溶液，A错误；
B、图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶，B错误；
C、图2所示实验操作中有一处明显错误（试管2中未将DNA溶于2mol•L-1的NaCl溶液中），可能导致试管2中蓝色变化不明显，C正确；
D、图2试管1的作用是证明2 mol•L-1 NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，D错误。
故选：C。
1、DNA粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
2、DNA粗提取和鉴定的过程：
（1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
（3）去除滤液中的杂质：
方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。
方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
（4）DNA的析出与鉴定
①将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA．用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
②取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
本题考查DNA的粗提取和鉴定，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如实验的原理、实验采用的方法、实验现象及结论等，需要考生在平时的学习过程中注意积累。

分层提分


题组A 基础过关练
单项选择题
1.下列关于基因工程的叙述，错误的是（）
A. 基因工程的基本工具是限制性核酸内切酶、DNA连接酶和运载体
B. 重组质粒的形成是在细胞内完成的
C. 抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
D. 基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿定向改造生物，培育新品种
【答案】B
【解析】
【分析】
本题主要考查基因工程，意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，形成知识的网络结构的能力。
【解答】
A.基因工程的工具包括：限制酶、DNA连接酶、运载体，其中常使用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，A正确；
B.重组质粒的形成是在细胞外完成的，B错误；
C.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达，需要进行检测和鉴定，C正确；
D.基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿定向改造生物，培育新品种，D正确。
故选B。  
2.下图表示一项重要生物技术的关键步骤，X是获得外源基因并能够表达的细胞。下列有关说法错误的是（    ）

A. X是能合成胰岛素的细菌细胞
B. 质粒应具有一个或多个限制酶切点
C. 基因与载体的重组只需要DNA连接酶
D. 该细菌的性状被定向改造
【答案】C
【解析】
【分析】
本题结合基因工程操作过程图，考查基因工程的原理和技术，要求考生识记基因工程的原理、工具、操作步骤及意义，能准确判断图中各结构和各过程的名称，再结合所学的知识准确判断各选项。
【解答】
A.X是含有胰岛素基因的细菌细胞分裂形成的，含有胰岛素基因，因此能合成胰岛素，A正确；
B.质粒通常有一个至多个标记基因和一个至多个限制酶切点，这样便于目的基因的插入和筛选含有重组DNA的细胞，B正确；
C.基因与运载体的重组除了需要DNA连接酶，还需要限制酶，C错误；
D.基因工程能定向改造生物的性状，该细菌是采用基因工程技术培育形成的，所获得外源基因能够表达，因此其性状已被定向改造，D正确。
​故选C。  
3.在基因工程中，科学家所用的“剪刀”“针线”和“载体”分别是指(    )
A. 大肠杆菌病毒、质粒、DNA连接酶 B. 噬菌体、质粒、DNA连接酶
C. 限制酶、RNA连接酶、质粒 D. 限制酶、DNA连接酶、质粒
【答案】D
【解析】
【分析】
本题比较基础，考查基因工程的相关知识，重点考查基因工程的工具，要求考生识记基因工程的三种操作工具及其作用，能根据题干要求作出准确的判断，属于考纲识记层次的考查。
【解答】
基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）--分子“剪刀”，DNA连接酶--分子“针线”，质粒、动植物病毒或噬菌体--运载体，所以D正确，ABC错误。
故选D。
4.关于基因工程下列说法正确的有（      ）
①重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体
②基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计施工
③限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列
④只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达
⑤所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
⑥基因工程可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上
⑦质粒是基因工程中惟一用作运载目的基因的载体
A. 2项 B. 3项 C. 4项 D. 5项
【答案】A
【解析】
【分析】
本题属于简单题，属于考纲中识记层次的要求，考查了基因工程的工具和操作步骤等方面的知识，要求考生能区分工具和工具酶，并且理解细菌作为受体细胞的优点等知识。
【解答】
①重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶，运载体不属于工具酶，①错误；
②基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计施工，②正确；
③一种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，其具有特异性，所以限制酶的切口不都是GAATTC碱基序列，③错误；
④目的基因进入受体细胞不一定能成功实现表达，④错误；
⑤一种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，即具有特异性，⑤错误；
⑥基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，因而可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上，⑥正确；
⑦基因工程常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等，⑦错误。
综上所述，A正确，BCD错误。
故选A。
5.在基因工程中用来修饰改造生物基因的工具酶是（）
A. 限制酶和载体 B. 限制酶和水解酶
C. DNA连接酶和载体 D. 限制酶和DNA连接酶
【答案】D
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的操作工具的相关知识，意在考查学生能识记并理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。
【解答】
基因工程中所用的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，其中限制酶和DNA连接酶是用来修饰、改造生物基因的工具酶。
综上所述，ABC错误，D正确。  
6.某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。下列有关这一过程的叙述不正确的是（）

A. 连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②
B. 获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①
C. 基因a进入马铃薯细胞后，可随马铃薯DNA分子的复制而复制，传给子代细胞
D. 通过该技术人类实现了定向改造马铃薯的遗传性状
【答案】A
【解析】
【分析】  
本题考查基因工程的相关知识，意在考查能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。
【解答】
A.DNA连接酶作用于磷酸二酯键，即①处， A错误；
B.获取基因a时，限制酶的作用部位是磷酸二酯键，即图中的①处，B正确；
C.目的基因进入受体细胞后整合到受体细胞的染色体DNA分子中，会随着马铃薯DNA分子的复制而复制，传给子代细胞，C正确；
D.基因工程是按照人类的意愿将一种生物的基因转移到另一种生物细胞内，定向改变生物的遗传性状的技术手段，D正确。
故选A。
7.下表是基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是（）

供体
剪刀
针线
运载体
受体
A.
质粒
限制性内切酶
DNA连接酶
提供目的基因的生物
大肠杆菌等
B.
提供目的基因的生物
DNA连接酶
限制性内切酶
质粒
大肠杆菌等
C.
提供目的基因的生物
限制性内切酶
DNA连接酶
质粒
大肠杆菌等
D.
大肠杆菌等
DNA连接酶
限制性内切酶
提供目的基因的生物
质粒
A. A B. B C. C D. D
【答案】C
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的相关知识，重点考查基因工程的工具，要求考生识记基因工程常用的工具及其作用，能结合所学的知识作出准确的判断，属于考纲识记层次的考查。
【解答】
供体是指提供目的基因的生物；限制酶能切割 DNA分子，是基因的剪刀；DNA连接酶能将DNA片段连接起来，是基因的针线；运载体包括质粒、噬菌体或动植物病毒；基因工程的受体可以是动物细胞、植物细胞或微生物细胞，但常以大肠杆菌等微生物细胞作为受体。综上所述，C正确，ABD错误。
故选C。
 8.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（　　）
A. 用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B. DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C. 预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D. 用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
【答案】A
【解析】
【分析】
本题考查DNA的粗提取和鉴定，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如要求考生识记DNA粗提取和鉴定的原理、实验步骤及各步骤中的细节、实验采用的试剂及试剂的作用等，需要考生在平时的学习过程中注意积累。
【解答】
A、兔属于哺乳动物，其红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，A错误；
B、DNA分子从细胞中被释放出来且除去蛋白后是非常容易断裂的，如果太过剧烈的搅拌，DNA链可能会被破环，因此轻柔搅拌的目的是为了获得较完整的DNA分子，B正确；
C、在冷的95%酒精溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大。如果用热的95%酒精会提高DNA的溶解度，不能完全使DNA沉淀，C正确；
D、将析出的DNA溶解在2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色，D正确。  

题组B 能力提升练
一、单项选择题
1.关于基因工程下列说法正确的有（    ）
①限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列  ②基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计施工  ③重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和运载体  ④只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达  ⑤所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列   ⑥基因工程可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上  ⑦质粒是基因工程中惟一用作运载目的基因的运载体
A. 2项 B. 3项 C. 4项 D. 5项
【答案】A
【解析】
【分析】
本题属于简单题，属于考纲中识记层次的要求，考查了基因工程的工具和操作步骤等方面的知识，要求考生能区分工具和工具酶，并且理解细菌作为受体细胞的优点等知识。 
【解答】 
①一种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，其具有特异性，所以限制酶的切口不都是GAATTC碱基序列，①错误； 
②基因工程又称转基因技术，是在DNA上进行的分子水平的设计施工，②正确； 
③重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶，运载体不属于工具酶，③错误； 
④目的基因进入受体细胞需要检测和鉴定，不一定能成功实现表达，④错误； 
⑤一种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，即具有特异性，⑤错误； 
⑥基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，因而可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上，⑥正确； 
⑦基因工程常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等，⑦错误。 
综上，A正确，BCD错误。
故选A。  
2.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是（    ）

A. 重组 DNA 技术所用的工具酶是限制酶、DNA 连接酶和运载体
B. 只有用同种限制酶切割 DNA 产生的粘性末端才能互补
C. 用图中质粒和外源基因 DNA 构建重组质粒，可使用 SmaⅠ切割
D. 使用 EcoRⅠ同时处理质粒和外源 DNA，可能会发生质粒或者目的基因的自身环化
【答案】D
【解析】
【分析】
本题考查了基因工程的工具和操作步骤等方面的知识，要求考生能认真审题并区分工具和工具酶、熟悉基因工程的操作步骤等知识是解题关键。DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。每一种限制酶都具有特异性。
【解答】
A.重组 DNA 技术中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶，运载体不属于工具酶，A错误；
B.可用同种限制酶切割DNA 产生互补的粘性末端，也可用双酶切法切割DNA产生互补的粘性末端，B错误；
C.若使用SmaⅠ切割质粒和外源基因DNA 会导致质粒中抗生素抗性基因（标记基因）和目的基因被破坏，C错误；
D.使用 EcoRⅠ同时处理质粒和外源DNA，可能会产生质粒与质粒的结合、目的基因与目的基因的结合即自身环化，D正确。
故选D。  
3.下图是四种不同质粒的示意图,其中ori为复制必需的序列,amp为氨苄青霉素抗性基因,tet为四环素抗性基因,箭头表示同一种限制性核酸内切酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是（    ）

A. 基因amp和tet是一对等位基因,常作为基因工程中的标记基因
B. 质粒包括细菌细胞中能自我复制的小型环状的DNA和病毒中的DNA
C. 限制性核酸内切酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的氢键
D. 用质粒4将目的基因导入大肠杆菌,该菌不能在含四环素的培养基上生长
【答案】D
【解析】
【分析】
本题考查基因工程知识，属于理解层次，意在使学生能运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确的结论。
【解答】
A.基因amp和tet是并列的两个独立基因，而不是等位基因，但都可作为基因工程中的标记基因，A错误；
B.质粒不包括动植物病毒的DNA，B错误；
C.限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来，具有特异性即能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，而不是两个核苷酸之间的氢键，C错误；
D.用质粒4将目的基因导入大肠杆菌，由于破坏了四环素抗性基因，该菌不能在含四环素的培养基上生长，D正确。
​故选D。  
4.EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶识别的序列均由6个核苷酸组成，但切割后产生的结果不同，其识别序列和切割位点（图中箭头处）如图所示，据图分析下列说法正确的是（　　）

A. 所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
B. SmaⅠ切割后产生的是黏性末端
C. 同一DNA连接酶可将上述两种限制酶切割的DNA片段通过形成磷酸二酯键而连接起来
D. 细菌细胞内的限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵，不能切割自身的DNA
【答案】D
【解析】
【分析】
本题考查限制酶的特点、功能的相关知识，意在考查学生提取信息、分析推理能力，平时应该加强训练。
【解答】
A、限制酶的识别位点一般由4、5、6或8个核苷酸序列组成，A错误；
B、据图分析，SmaⅠ限制酶切割后产生的是平末端，B错误；
C、DNA片段遵循碱基互补配对的原则，通过形成磷酸二酯键而连接起来，黏性末端和平末端无法连接，C错误；
D、细菌细胞内限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵，是一套完善的防御机制，D正确。  
5.下列是一种生物技术，对此技术过程的说法，错误的是（     ）

A. a和d的切割需用同一种限制酶
B. 该生物技术的优点是可以产生新基因
C. 重组DNA转移至受体细胞，主要通过细菌或病毒侵染细胞的途径
D. a是常用的运载体，存在于细菌及酵母菌细胞中
【答案】B
【解析】
【分析】
本题结合基因表达载体的构建过程图，考查基因工程的相关知识，特别是基因工程的工具，要求考生识记相关知识点，理解限制酶的专一性，明确限制酶和DNA连接酶的作用，重点掌握它们的切割部位和连接部位，属于高频考点。
分析题图：图示表示基因工程中基因表达载体的构建过程，a表示质粒，其中含有限制酶切割位点；b表示限制性核酸内切酶，能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；c表示DNA连接酶，能将目的基因和运载体连接形成重组质粒；d表示目的基因。
【解答】
A.要获得相同的黏性末端，需要用同种限制酶切割目的基因和运载体，A正确；
B.该生物技术的优点是可以定向改造生物的性状，但不能产生新基因，B错误；
C.基因工程中，重组DNA转移至受体细胞，主要通过细菌或病毒侵染细胞的途径，C正确；
D.a是质粒，是基因工程常用的运载体，存在于细菌及酵母菌细胞中，D正确。
故选B。  
6.如图1表示DNA的平面结构示意图，图2表示某种限制酶的识别序列和作用位点，下列相关说法正确的是（  ）
​
A. 图2所示的DNA片段被限制酶切割后获得的末端形式与图1相同
B. 图1中a所示部位即图2中箭头所示部位
C. E•co1iDNA连接酶可以将两个图1所示结构连接成为一个DNA片段
D. 基因工程的载体必须具有图2所示的碱基序列
【答案】B
【解析】
【分析】
本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具及操作步骤，掌握各操作工具的特点及作用，能结合所学的知识准确判断各选项。
【解答】
A.图2所示的DNA片段被限制酶切割后获得的末端为黏性末端，与图1末端不同，A错误；
B.图1中a所示部位即图2中箭头所示部位，都为磷酸二酯键，B正确；
C.T4DNA连接酶还可以连接平末端，因此T4DNA连接酶可以将两个图1所示结构连接成为一个DNA片段，C错误；
D.基因工程的载体必须具有限制酶的切割位点，但不一定具有图2所示的碱基序列，D错误。
​故选B。  
7.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知图中Gene I和Gene II表示两种标记基因，限制酶I的识别序列和切点是－G↓GATCC－，限制酶II的识别序列和切点是－↓GATC－。根据图示判断下列操作正确的是（    ）

A. 质粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶II切割
B. 质粒用限制酶II切割，目的基因用限制酶I切割
C. 目的基因和质粒均用限制酶I切割
D. 目的基因和质粒均用限制酶II切割
【答案】A
【解析】
【分析】
本题考查基因工程限制酶的相关知识，意在考查考生能运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确的结论的能力。
【解答】
限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶 II的识别序列和切点是—↓GATC—，可知限制酶II能够识别和切割限制酶I切割后的黏性末端。据题图可知，目的基因两端分别是限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC—和限制酶 II的识别序列和切点是—↓GATC—，只有用限制酶II才能将目的基因切割下来。质粒有GeneI 和GeneⅡ 表示两种标记基因，分别有限制酶 II的识别序列和限制酶I的识别序列；如果用限制酶II切割，则GeneI 和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因；用限制酶I切割，则破坏GeneⅡ，保留GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以连接。综上，A正确，BCD错误。
​故选A。  
8.经研究发现，PVY﹣CP基因位于某种环状DNA分子中。将PVY﹣CP基因导入马铃薯，使之表达即可获得抗PVY病毒的马铃薯。如图表示构建基因表达载体的过程，相关酶切位点如下表。以下说法错误的是（）
BamHI
HindⅢ
BglII
SmaI
G↓GATCC
CCTAG↑G
A↓ACCTT
TTCGA↑A
A↓GATCT
TCTAG↑A
CCC↓GGG
GGG↑CCC

A. 推测Klenow酶的功能与DNA聚合酶类似
B. 由步骤③获取的目的基因有1个黏性末端
C. 步骤④应选用的限制酶是BamHⅠ和SmaⅠ
D. NPTⅡ基因可能是用于筛选的标记基因
【答案】C
【解析】
【分析】
本题考查基因工程相关知识，意在考查学生的识记能力和分析问题解决问题的能力。
【解答】
A.由图可知，步骤②中用Klenow酶处理后，黏性末端变成平末端，说明Klenow酶能催化DNA链的合成，从而将DNA片段的粘性末端变成平末端，故Klenow酶将DNA单链补全成双链，Klenow酶的功能与DNA聚合酶类似，A正确；       
B.据图示可知，由步骤③获取的目的基因一端平齐，一端为粘性末端，故共有1个粘性末端，B正确；
C.由于目的基因只有一个粘性末端，质粒是顺时针转录，使用BamHⅠ切割会导致目的基因无法转录，需选择一种粘性末端相同的限制性内切酶，另一种选择平末端限制酶，故步骤④中选用的限制酶是BglⅡ或SmaⅠ，C错误；
D.NPTⅡ基因可能是用于筛选的标记基因，D正确。
​故选C。  
9.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（　　）
A. 羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B. 提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C. 预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D. 在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
【答案】A
【解析】
【分析】
本题考查DNA的粗提取和鉴定，要求考生识记DNA提取和鉴定的原理、条件、过程等基础知识，能结合所学的知识准确判断各选项。
1、DNA粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
2、DNA粗提取和鉴定的过程：
（1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
（3）去除滤液中的杂质：
方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。
方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
（4）DNA的析出与鉴定
①将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
②取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
【解答】
A、羊的成熟红细胞不含细胞核，不能作为提取DNA的材料，A错误；
B、提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，其中洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，食盐的作用是溶解DNA，B正确；
C、预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，C正确；
D、在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，D正确。
故选A。  
二、填空题
10.酵母菌的维生素、蛋白质含量高,可用于生产食品和药品等。科学家将大麦细胞中的LTP1基因植入啤酒酵母菌细胞中,获得的啤酒酵母菌可产生LTP1蛋白,并酿出泡沫丰富的啤酒,基本的操作过程如图。请回答下列有关问题:

(1) 该技术能定向改变酵母菌的遗传性状,其遗传学原理是______,该技术又称为_____或_____。该技术是在DNA上进行的____水平的设计施工。 
(2) 本操作中为了将LTP1基因导入酵母菌细胞内,所用的载体是____。该载体的化学本质是____,除此外,目前常用的载体还有_______。 
(3) 要使载体与LTP1基因连接,首先应使用______进行切割,该酶作用的化学键是________。 
(4) 切割完成后,利用____将载体与LTP1基因连接,该过程遵循的原则是_______________。 
【答案】(1) 基因重组;基因拼接技术;DNA重组技术;分子
(2) 质粒;环状DNA;噬菌体和动植物病毒
(3) 限制性核酸内切酶(限制酶);磷酸二酯键
(4) DNA连接酶;碱基互补配对
【解析】题图表示将LTP1基因植入啤酒酵母菌中,使其产生LTP1蛋白,该蛋白能使酿出的啤酒有丰富泡沫。图中a为获取目的基因的过程;b为质粒;c为基因表达载体(重组质粒)。
(1)图示技术称为转基因技术、DNA重组技术或基因拼接技术,它实现了不同物种之间的基因重组,能定向地改造某种生物的性状,是在DNA上进行的分子水平的设计施工。
(2)图示中的运载体为质粒。该运载体的化学本质是环状DNA,除此之外,目前常用的运载体还有噬菌体和动植物病毒。
(3)要使目的基因与运载体连接,需用同一种限制酶切割运载体和含目的基因的DNA分子,使它们具有相同的黏性末端。
(4)当用限制酶切割以后,可采用DNA连接酶将运载体与目的基因连接,连接后得到的DNA分子称为重组DNA分子,这个过程遵循的原则是碱基互补配对。

题组C 培优拔尖练
一、 单项选择题
1.限制性内切酶EcoRI识别并切割，双DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（　　）
A. 6 B. 250 C. 4000 D. 24000
【答案】C
【解析】解：据图可知，EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为××××=，即4096≈4000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRI的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4000。
故选：C。
限制性核酸内切酶能识别特定的DNA序列，切割特定的位点，在特定的碱基之间切割磷酸二酯键。
本题考查基因工程的相关知识，重点考查基因工程的操作工具，要求考生识记基因工程的操作工具、特点及其作用，能结合所学的知识准确判断各选项。
2.近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割（见如图）。下列相关叙述错误的是（　　）

A. Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成
B. 向导RNA中的双链区遵循碱基配对原则
C. 向导RNA可在逆转录酶催化下合成
D. 若α链剪切位点附近序列为…TCCAGAATC…则相应的识别序列为…UCCAGAAUC…
【答案】C
【解析】
【分析】
本题考查了基因表达的相关知识，意在考查学生的理解和应用所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。
【解答】
A、核糖体是蛋白质的合成场所，故Cas9蛋白质由相应基因指导在核糖体中合成，A正确；
B、向导RNA中的双链区碱基对间遵循碱基配对原则，B正确；
C、向导RNA可通过转录形成，逆转录酶以RNA为模板合成DNA，C错误；
D、由于α链与识别序列的互补链序列相同，故两链碱基相同，只是其中T与U互换，D正确。
故选：C。  
3.粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（　　）
A. 加入适量的木瓜蛋白酶
B. 37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟
C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D. 加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14mol/L
【答案】A
【解析】解：A、利用木瓜蛋白酶分解杂质蛋白，提取杂质较少的DNA，A正确；
B、DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中保温10～15min能去除滤液中的杂质，B错误；
C、加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精是析出DNA，C错误；
D、DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，通过控制NaCl 的浓度去除杂质，加入2mol/LNaCl溶液→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14mol/L→过滤→丝状物再溶解在2mol/LNaCl溶液，D错误。
故选：A。
DNA粗提取和鉴定的过程：
（1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
（3）去除滤液中的杂质：
方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。
（4）DNA的析出与鉴定
①将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA．用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
②取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
本题考查DNA的粗提取和鉴定实验，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如实验的原理、实验步骤、实验采用的试剂及试剂的作用等，需要考生在平时的学习过程中注意积累。
4.下列关于基因工程技术及应用叙述正确的是（）
A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶，连接酶和运载体
B. 基因治疗主要是针对有缺陷的细胞进行修复
C. 可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D. 只要目的基因进入受体细胞就能成功表达
【答案】C
【解析】
【分析】
本题考查基因工程中的基本工具、基本步骤及基因治疗的相关问题，意在考查学生理解能力及运用能力。
【解答】
A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶，连接酶，运载体不是酶，A错误；
B.基因治疗主要是将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，B错误；
C.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒，C正确；
D.目的基因进入受体细胞不一定成功表达了，还要进行抗原-抗体的杂交，检测是否翻译出相应的蛋白质，D错误。
​故选C。  
5.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是（　　）
A. 提高受体细胞在自然环境中的耐药性
B. 有利于对目的基因是否导入进行检测
C. 增加质粒分子的分子量
D. 便于与外源基因连接
【答案】B
【解析】
【试题解析】
【分析】
本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生的识记能力和理解所学知识要点，把握知识间内在联系，形成知识网络结构的能力；能运用所学知识，对生物学问题作出准确判断和得出正确结论的能力。、
作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点，便于与外源基因连接；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。
【解答】
A.抗性基因的作用是筛选导入目的基因的受体细胞，A错误；
B.抗性基因是标记基因，有利于对目的基因是否导入进行检测，B正确；
C.细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，其作用不是增加质粒分子的分子量，C错误；
D.质粒上含有限制酶切割位点时，便于与外源基因连接，D错误。
故选B。
6.2018年1月30日，加拿大食品检验局批准了第三种耐褐变转基因苹果品种上市。研究人员通过RNA沉默技术，特异性降低苹果细胞内多酚氧化酶基因的表达水平，使苹果被切开后即使长时间暴露在空气中也不会被氧化褐变。如图是此过程原理示意图，下列有关的叙述错误的是（　　）

A. 细胞内多酚氧化酶基因的表达包括图示中的①②过程
B. 将目的基因成功导入苹果细胞中需限制酶、DNA连接酶和RNA聚合酶
C. “RNA沉默”的含义是mRNA不能翻译产生多酚氧化酶
D. 目的基因的表达序列与多酚氧化酶基因的表达序列互补，且要同时在同一细胞内表达
【答案】B
【解析】
【分析】
本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，能正确分析题图，再结合图中信息准确判断各选项。
分析题图：图中①为转录过程，②为翻译过程，图中α和β可互补配对，这样能使多酚氧化酶基因转录形成的mRNA沉默，使翻译过程不能进行，即不能形成多酚氧化酶。
【解答】
A、基因表达包括①转录和②翻译过程，A正确；
B、将目的基因成功导入苹果细胞中需限制酶、DNA连接酶，但不需要RNA聚合酶，B错误；
C、由以上分析可知，“RNA沉默”的含义是mRNA不能翻译产生多酚氧化酶，C正确；
D、目的基因的表达序列与多酚氧化酶基因的表达序列互补，且要同时在同一细胞内表达，这样才能使多酚氧化酶基因转录形成的mRNA沉默，D正确。
故选：B。  
7.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（　　）

A. ①②③④ B. ①②④③ C. ①④②③ D. ①④③②
【答案】C
【解析】解：限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。
故选：C。
分析图解：图①双链DNA分子中间出现了黏性末端，图②两个具有黏性末端的DNA片段连接成一个完整的DNA分子，图③中DNA分子的双链解开，图④是以解开的单链DNA作为模板形成子链的过程。
本题通过作用效果图解考查了限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶的作用，意在考查考生的识图能力、区分能力、识记并理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。
8.某种线性DNA含有限制性核酸内切酶EcoR I的1个酶切位点．该DNA样品（甲）经EcoR I 酶切后，在DNA连接酶催化下形成产物乙（如图）．则反应液中产物乙共有（　　）

A. 1种 B. 2种 C. 3种 D. 4种
【答案】C
【解析】解：根据题意可知，线性DNA含有限制性核酸内切酶EcoR I的1个酶切位点，因此经过该酶切割后会形成两个相同的黏性末端，但是黏性末端两侧的序列不同，可以分别用a和b表示．
由于a和b具有相同的黏性末端，因此利用DNA连接酶催化后，能够产生aa连接、bb连接、ab连接三种产物．
故选：C．
限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂．
DNA连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类： E．coliDNA连接酶、T4DNA连接酶．
这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低．
（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键．
本题考查基因工程的原理及技术，要求考生掌握基因工程的工具酶，重点掌握限制酶和DNA连接酶的特点及作用，明确DNA连接酶能够连接相同的黏性末端，最后选出正确的答案，考生易错选A项．
9.如图为某个基因的部分片段，关于该结构的叙述，正确的是（　　）

A. ①所圈定的部位是腺嘌呤 B. DNA连接酶作用于②处
C. 限制酶作用于③处 D. 解旋酶作用于④处
【答案】B
【解析】
【分析】
本题考查了DNA分子的结构，考查学生的识图能力和识记能力。
分析题图：该图为某个基因的部分片段，①为腺嘌呤脱氧核苷酸；②是磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键；③是碱基之间的氢键；④是含氮碱基和脱氧核糖之间的化学键。
【解答】
A.分析题图：①所圈定的部位是腺嘌呤脱氧核苷酸，A错误；
B.DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，即②处，B正确；
C.限制酶的作用是切割磷酸二酯键，即②处，C错误；
D.解旋酶作用于氢键，即③处，D错误。
故选B。  
10.如图为限制酶BamHⅠ和BglⅡ的识别序列及切割位点，实验中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅡ切割质粒，并将它们拼接得到重组质粒。下列相关叙述正确的是（  ）

A. 在酶切过程中，要控制好酶的浓度、温度和反应速率等因素
B. 经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别
C. 目的基因经BglⅡ切割后形成的黏性末端是-CTACG
D. 分别用两种限制酶切割，保证了目的基因定向的插入质粒
【答案】B
【解析】
【分析】
​本题考查了基因工程的有关知识，要求考生能够掌握限制酶的作用特点，根据题干信息判断两种酶切割后的黏性末端是否能发生重组以及连接的方式，同时要求考生能够写出切割后形成的黏性末端以及连接后的碱基序列，再结合题干信息准确判断各项。
【解答】
A.影响酶促反应的因素有温度、pH、酶浓度、底物浓度等，因此酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素，A错误；
B.经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别，B正确；
C.目的基因经BglⅡ切割后形成的黏性末端是-CTAG或-GATC，C错误；
D.分别用两种限制酶切割，由于形成的黏性末端相同，因此并不能保证目的基因定向插入质粒，D错误。
故选B。  
11.用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别降解一个1 000bp（1bp即1个碱基对）的DNA分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，凝胶电泳结果如下图所示。该DNA分子的酶切图谱（单位：bp）正确的是（　　）

A. B.
C. D.
【答案】C
【解析】解：A、A选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切会得到600bp和200bp两种长度的DNA分子，与题意不符，A错误；
B、B选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切会得到600bp和400bp两种长度的DNA分子，与题意不符，B错误；
C、C选项中的DNA用KpnⅠ酶切后得到的DNA分子是1000bp，用EcoRⅠ单独酶切得到200bp和800bp两种长度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后得到200bp和400bp两种长度的DNA分子，与题意相符，C正确；
D、D选项中的DNA用KpnⅠ酶切后得到400bp和600bp两种长度的DNA分子，与题意不符，D错误。
故选：C。
用限制性核酸内切酶KpnⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，由此可推知该DNA分子为环状DNA；用EcoRⅠ单独酶切会得到800bp和200bp两种长度的DNA分子；用EcoRI，KpnⅠ同时酶切后得到200bp和400bp两种长度的DNA分子知答案C符合要求。
本题结合题图，考查基因工程的原理和技术，尤其是限制酶的相关知识，要求考生识记限制酶的作用，能根据题干信息分析各选项，选出正确的答案，属于考纲识记和理解层次的考查。对于此类试题，考生也可以采用代入法解决问题。
二、 填空题
12.根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有 ______ 和 ______ ．
（2）质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如图所示。为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是 ______ ．
（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即 ______ DNA连接酶和 ______ DNA连接酶。
（4）反转录作用的模板是 ______ ，产物是 ______ ．若要在体外获得大量反转录产物，常采用 ______ 技术。
（5）基因工程中除质粒外， ______ 和 ______ 也可作为运载体。
（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是 ______ ．

【答案】（1）黏性末端；平末端
（2）切割产生的DNA片段末端与EcoRI切割产生的相同
（3）E．coli；T4
（4）mRNA（或RNA）；cDNA（或DNA）；PCR
（5）噬菌体；动植物病毒
（6）未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的相关知识，重点考查基因工程的工具，只要考生识记基因工程三种工具的相关知识即可，属于考纲识记层次的考查，这需要考生在平行的学习过程中构建相关知识网络结构。
基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种。DNA连接酶分为两类： E．coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。基因工程常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【解答】
（1）经限制性核酸内切酶切割后能形成两种类型的末端，即平末端和黏性末端。
（2）为了便于相连，两种不同限制酶切割之后所产生的黏性末端必须相同。
（3）DNA连接酶分为两类： E．coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（4）反转录是以mRNA为模板逆转录先合成单链DNA，再合成双链DNA，利用PCR技术进行大量扩增。
（5）基因工程常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
（6）当受体细胞是细菌时，为了增大导入的成功率，常用Ca2+处理，得到感受态细胞，此时细胞壁和细胞膜的通透性增大，容易吸收重组质粒。未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱。