高中人教版 (2019)第3章 基因工程第1节 重组DNA技术的基本工具完美版课件ppt

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基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
1944年艾弗里等人证明DNA可在同种生物不同个体间转移。
1950年埃特曼发明了测定氨基酸序列的方法。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模性。
1958年梅塞尔森和斯塔尔实验证明了DNA的半保留复制。
1961年尼伦伯格和马太破译第一个编码氨基酸的密码子。
1967年科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切酶(简称限制酶)。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年,伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体构建重组DNA导入受体细胞中并成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年我国科学家朱作言等培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年穆里斯等人发明了PCR。
1990年人类基因组计划启动2003年完成。
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年张峰等首次报道基因组编辑技术，可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
重组DNA技术的基本工具
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
转基因番木瓜 (左) 与非转基因番木瓜(右)
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯断开。
都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，这就是回文序列。
大多数限制酶的识别序列由 6 个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由 4 个、8 个或其他数量的核苷酸组成。
能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列: 在切割部位，一条链从5’→3’读的碱基顺序与另一条链5’→3’读的顺序完全一致。
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
当限制酶在它识别序列的中轴线切开时，产生的是平齐末端。
形成的黏性未端(从5’→3’读)为 ；一个限制酶切割一次断 个磷酸二醋键形成 个黏性未端；同一种限制酶切割形成的黏性未端 ；两个黏性末端有 个游离的磷酸基团。
如：EcRⅠ限制酶： 识别序列为GAATTC， 切割部位为GA之间的磷酸二酯键。
如：SmaⅠ限制酶： 识别序列为CCCGGG 切割部位为CG之间的磷酸二酯键。
BamHⅠ( ） EcRⅠ（ ） HindⅢ（ ） BglⅡ （ ）
请写出下列限制酶切割形成的黏性末端
如何判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的呢？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个未端是用同一种限制酶切割
己知EcRⅠ 的识别序列和切点是-G↓AATTC-， BamHⅠ的识别序列和切点是-G↓GATCC-
同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性未端一般不相同
（解析: 具有专一性，识别的序列不同）
用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后， 序列 会明显 (增多、减少、不变)。
- TCTAGG -
两种同尾酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别。
限制酶存在于原核生物中的作用是什么?
原核生物容易受到外源DNA的入侵酶的作用:切割外源DNA,使之失效保证自身的安全
限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA?
DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者DNA分子被修饰(甲基化) ，使限制酶不能将其切开
用限制酶切割时需注意的事项:
获取目的基因和切割载体时，通常使用同种限制酶,目的是为了产生相同的黏性末端，便于连接；缺点：目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。可分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体。
选择限制酶切割位点的基本原则：1、切割目的基因时:能切下目的基因且不破坏目的基因；2、切割质粒时:至少保留一个完整的标记基因，便于筛选。
上图中可以选择限制酶 。
1、用图1中的质粒和图2中的外源DNA构重组质粒，不能使用Sma Ⅰ 切割，原因是 。
Sma Ⅰ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因
2、构建重组质粒时，最好选择限制酶BamH Ⅰ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。
确保目的基因与质粒的定向连接
如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线
1、用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是 (从“EcRⅠ"“BamH Ⅰ /HindⅢ”“Sma ⅠI /HindⅢ中选择) 。不能选择其他限制酶的理由分别是 。
BamH Ⅰ /HindⅢ
若选EcRⅠ 会破坏质粒的复制原点; 若选Sma Ⅰ/HindⅢ，有标记基因或复制原点
DNA连接酶——“分子缝合针”
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
E·cli DNA连接酶
只能连接具有互补配对的黏性末端，不能连接有平末端
既可以连接互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（连接平末端的效率相对较低）
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗， 为什么?
DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键
催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子
催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
①化学本质都是蛋白质②都是催化形成磷酸二酯键
DNA连接酶——“分子手术刀”
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
将目的基因转移到受体细胞中去
利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制
能在受体细胞中复制并稳定保存
具有一至多个限制酶切割位点，便于与目的基因相连
常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选
基因起始端的一段特殊DNA片段，RNA聚合酶识别和结合的部位
基因的尾端的一段特殊的DNA片断，使转录终止
质粒存在于细菌、放线菌、酵母菌等拟核DNA 或核DNA外的，能够自主复制的小型双链环状 DNA分子基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体,常含有特殊的标记基因，便于筛选和鉴定。
用抗性基因鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
常用标记基因：抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因、抗四环素基因荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因
实验·探究—DNA粗提取与鉴定
DNA的提取：①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2ml/L NaCl溶液。
DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
新鲜洋葱(也可以选择香蕉、菠菜、菜花和猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同)、研磨液、体积分数为95%的酒精、2ml / L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。