2022年《南方新课堂 高考总复习》生物 选修3 专题1、4 基因工程、生物技术的安全性和伦理问题课件

这是一份2022年《南方新课堂 高考总复习》生物 选修3 专题1、4 基因工程、生物技术的安全性和伦理问题课件，共60页。PPT课件主要包含了思维网络，生物技术的，安全性和伦理问题，考情分析，原核生物，回文对称，切如下图所示，磷酸二酯键，限制酶选择的注意事项，PstⅠ等内容，欢迎下载使用。
考点一1.限制性核酸内切酶
DNA 重组技术的基本工具[考点梳理]
(1)来源：多数来自____________。(2)作用特点。①主要切割外源 DNA，而对自身的 DNA 不起作用，达到保护自身的目的。②专一性：只能识别 DNA 分子中特定的核苷酸序列，且
只能在每一条链中特定的部位进行切割。
(3)识别序列的特点：限制酶识别的序列大多数为________结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。
(4)作用结果——黏性末端和平末端。
①黏性末端：是限制酶在它识别序列的中轴线两侧将 DNA
的两条链分别切开时形成的(错位切)，如下图所示：
②平末端：是限制酶在识别序列的中轴线切开时形成的(平
(5)作用实质：使特定部位的两个核苷酸之间的__________断开。
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 PstⅠ和 EcR Ⅰ两种限制酶( 但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶 SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
(1)作用：将限制酶切割下来的 DNA 片段______________
_______________。
(3)DNA 连接酶和限制酶的关系。
(3)作用：______________________________________。(4)特点：可在细胞中进行自我复制或整合到染色体 DNA上，随染色体 DNA 进行同步复制。
携带外源 DNA 片段进入受体细胞
1.DNA 连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(
答案：×2.E·cli DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。
)答案：×3. 每个质粒 DNA 分子上至少含一个限制酶切割位点。)答案：√
4.质粒是小型环状 DNA 分子，是基因工程常用的载体。
)答案：√5.切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别 6 个核
1.下列属于“分子缝合针”的是(
②DNA 连接酶B.①②D.②④
①E.cil DNA 连接酶④解旋酶 ⑤RNA 聚合酶A.①②③C.①②⑤答案：B
2.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙
A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒B.DNA 连接酶和 RNA 聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶C.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达答案：B
考点二1.基因工程的概念
基因工程的基本操作程序[考点梳理]
(1)供体：提供__________。(2)操作环境：______。(3)操作水平：________水平。(4)原理：___________。(5)受体：表达目的基因。
(6)本质：性状在______体内的表达。
(7)优点：克服_________________的障碍，定向改造生物的遗传性状。(8)基本操作程序。
2.目的基因的获取(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。(2)获取方法。
说明：基因文库相当于某种生物的基因仓库，储存着大量该物种的基因。
3.基因表达载体的构建——重组质粒的构建(1)构建基因表达载体的目的。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下
②使目的基因能够表达和发挥作用。(2)构建步骤。
(3)基因表达载体的组成。
4.将目的基因导入受体细胞的方法
5.目的基因的检测与鉴定
[易错诊断]1.为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只
答案：×2.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体 DNA 上也未
答案：√3.检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。
[基础测评]1.某蔬菜地栽种了一种抗虫大白菜，是运用转基因技术把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因 DXT 转移到大白菜细胞中培育而成的，在这一过程中要进行基因表达载体的构建。根据所学知
识推断，作为重组载体应具备的结构有(
A.目的基因、启动子B.目的基因、终止子C.目的基因、启动子、终止子D.目的基因、启动子、终止子、标记基因答案：D
2.下图为基因表达载体的模式图，若结构 a 是基因表达载
体所必需的，则 a 最可能是(A.氨苄青霉素抗性基因B.启动子C.限制酶D.DNA 连接酶答案：B
3. 从浩瀚的“基因海洋”中获得特定目的基因的方法有
②PCR 扩增技术扩增
①从基因文库中获取目的基因③人工合成基因 ④RNA 复制
B.①②③④D.①②③
A.①②④C.②③④答案：D
基因工程的应用、生物技术的安全性及蛋白质工程
[考点梳理]1.基因工程的应用(1)基因工程的应用举例。
①来源：主要来自转基因的工程菌，也可来自各类生物反
②成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
③作用：预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各
种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。
(3)比较基因治疗与基因诊断。
2.生物技术的安全性和伦理问题(1)转基因生物的优缺点。
(2)试管婴儿与克隆人。
①试管婴儿和设计试管婴儿的比较。
a.不同点：设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断或基因诊断，试管婴儿不需进行遗传学诊断或基因诊断。图中①②③是试管婴儿的培育过程，①②④⑤是设计试管婴儿的培育过程。
应用：试管婴儿主要是解决不孕不育夫妇的生育问题，设计试管婴儿主要用于白血病、贫血症等疾病的治疗。b.相同点：都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都
要经过胚胎移植，都属于有性生殖。②治疗性克隆和生殖性克隆的比较。
(3)生物武器的特点及传播途径。
①特点：传染性强；污染面广，危害时间长；难以防治；
具有一定的潜伏期；受自然条件影响大。
②传播途径：经食物和水传播；空气传播；接触传播；虫
媒传播；病原体直接传播。
(1)概念。①基础：蛋白质分子的_________及其与_________的关系。②手段：通过_________或_________，对现有蛋白质进行
(2)蛋白质工程流程图。
(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出____________。(4)应用：主要集中应用于对____________进行改造，改良
(5)基因工程和蛋白质工程的比较。
[易错诊断]1. 蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操
作，定向改变分子的结构。(答案：×
2.基因工程只能产生自然界已存在的蛋白质。(
答案：√3.动物基因工程的实施主要是为了改善畜产品的品质，不
一定是为了产生体型巨大的个体。(答案：√
4.由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(
答案：×5.利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物
的乳腺细胞中。(答案：×
1.蛋白质工程的基本途径是(
②推测应有的氨基酸序列
④形成预期功能的蛋白质
⑥设计预期的蛋白质结构B.⑤③②⑥④①D.⑥①②⑤③④
氧核苷酸序列(基因)A.①②③⑤⑥④C.①⑥②⑤③④答案：C
2.科学家已能运用基因工程技术，让羊的乳腺合成并分泌
人体某些种类的抗体，以下叙述不正确的是(
A.该技术可导致定向变异B.表达载体中需要加入乳腺蛋白的特异性启动子C.目的基因是抗原合成基因D.受精卵是理想的受体细胞答案：C
3.基因工程与蛋白质工程的区别是(
A.基因工程需对基因进行分子水平操作，蛋白质工程不需对基因进行操作B.基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程可以合成自然界不存在的蛋白质C.基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平(或性状水平)操作D.基因工程与蛋白质工程完全不同答案：B
[典例 1](2019 年新课标Ⅰ卷)基因工程中可以通过 PCR 技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括____________和____________。(2)生物体细胞内的 DNA 复制开始时，解开 DNA 双链的酶是____________。在体外利用 PCR 技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板 DNA 解链为单链的条件是____________。上述两个解链过程的共同点是破坏了 DNA 双链分子中的____________。
(3)目前在 PCR 反应中使用 Taq 酶而不使用大肠杆菌 DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________________________________________________________。[解析](1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括基因组文库和 cDNA 文库。(2)生物体细胞内的 DNA 复制开始时，解开 DNA 双链的酶是解旋酶。在体外利用 PCR 技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板 DNA 解链为单链的条件是加热至 90～95 ℃。上述两个解链过程的共同点是破坏了 DNA 双链分子中的氢键。(3)目前在
PCR 反应中使用 Taq 酶而不使用大肠杆菌 DNA 聚合酶的主要原因是 Taq 酶热稳定性高，而大肠杆菌 DNA 聚合酶在高温下会失活。
[答案](1)基因组文库
加热至 90～95 ℃
(3)Taq 酶热稳定性高，而大肠杆菌 DNA 聚合酶在高温下会失活
与 DNA 技术有关的酶的比较
(1)DNA 连接酶连接两个 DNA 片段，而 DNA 聚合酶只能
将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。
(2)限制性核酸内切酶的作用是识别、切割某种特定的脱氧核苷酸序列，使两条链在特定的位置断开，而解旋酶是将连接DNA 的两条链的氢键打开形成单链。
(3)基因工程中目的基因的获取和质粒的切割都由相同的
限制性核酸内切酶切割。
(4)DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、逆转录酶分别以 DNA 单链或 RNA 单链为模板，形成磷酸二酯键；而 DNA 连接酶不需要模板。
(5)上述酶的化学本质都是蛋白质。
[考向预测]1.(2019 年江苏徐州模拟)已知限制性内切酶 Xma Ⅰ和 SmaⅠ的识别序列分别为—C↓CCGGG—和—CCC↓GGG—。有关
这两种酶及应用的叙述，错误的是(
A.这两种酶作用的底物都是双链 DNAB.DNA 中出现这两种酶识别序列的概率不同C.XmaⅠ切割 DNA 形成的黏性末端是—GGCCD.使用这两种酶时需注意控制反应温度、时间等
解析：限制酶作用的底物是双链DNA 分子，A 正确；这两种限制酶识别的序列相同，故 DNA 中这两种酶识别序列出现的概率相同，B 错误；根据碱基互补配对原则，CCCGGG 的互补链是GGGCCC，并根据 XmaⅠ的切割位点可知，切割后的黏性末端是—GGCC，C 正确；温度能影响酶的活性，所以使用酶时需要注意控制反应温度和时间等，D 正确。
2.将某病毒的外壳蛋白(L1)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因连接，构建 L1—GFP 融合基因，再将融合基因与质粒连接构建下图所示表达载体。图中限制酶 E1 至 E4 处理产生的黏性末端
均不相同。下列叙述不正确的是(
A.构建 L1—GFP 融合基因需要用到 E1、E2、E4 三种酶B.E1、E4 双酶切确保 L1—GFP 融合基因与载体的正确连接C.GFP 可用于检测受体细胞中目的基因是否表达D.将表达载体转入乳腺细胞，可培育乳汁中含 L1 蛋白的转基因羊
解析：构建 L1—GFP 融合基因需要先用内切酶处理获得L1 基因和 GFP 基因，并将二者连接，故需要用到 E1、E2、E4三种酶，A 正确；图中限制酶 E1 至 E4 处理产生的黏性末端均不相同，E1、E4 双酶切可以有效减少载体自身连接和融合基因自身连接，保证 L1—GFP 融合基因与载体准确连接，B 正确；绿色荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达，C 正确；为了获得L1 蛋白，可将表达载体转入受精卵中而不是乳腺细胞，用于培育乳汁中含有 L1 蛋白的转基因羊，D 错误。
[典例 2](2018 年海南卷)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜________(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是______________________________________。
(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中______________已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为 1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到____________(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。
(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用________作为外植体进行组织培养。
(4)通常，基因工程操作主要有 4 个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为______________________________________________________________。[解析](1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，理由是叶片伤口处的细胞会释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与
一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为 1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用茎尖作为外植体进行组织培养。(4)通常，基因工程操作主要有 4 个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。
[ 答案](1) 受伤的
叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物
质，可吸引农杆菌移向这些细胞
(3)茎尖(4)按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型
3.(2019 年天津滨海七校高三联考)基因工程中，GUS 基因编码的酶可将无色底物生成蓝色产物，GFP 基因会产生绿色荧光蛋白，这两种基因都可作为标记基因来研究发育生物学的问题。利用双 CRISPR/Cas9 系统和 Cre/lxP 重组酶系统技术可更好地实现该研究。请据图作答：
(1)图 1 为双 CRISPR/Cas9 系统作用示意图。该系统能够特异性识别 DNA 序列并切割特定位点，图中行使这些功能的分子结构分别是____________、____________。图中向导 RNA 与DNA 结合的原理是____________。将删除区切割后，转入基因与原 DNA 片段可通过形成____________拼接起来，形成新的DNA 序列。
(2)双 CRISPR/Cas9 系统可直接在靶细胞内起作用，与传统的基因工程相比，该操作无需__________(填写工具)。与质粒载体导入外源基因比，双 CRISPR/Cas9 系统编辑的基因可以不含____________________________________________。(3)图 2 为Cre/lxP 重组酶系统作用示意图。利用双CRISPR/Cas9 系统可精准地将 lxP 序列、GUS 基因及 GFP 基因连接，接上 35s 启动子之后可在组织中检测出蓝色而无绿色荧光区，这是由于__________基因自身无启动子而无法表达。Cre 基因是重组酶基因，经 38 ℃热处理后可被激活表达，在此前提下组织中可检测出绿色荧光区，据此分析绿色荧光区形成的原因是_____________________________________________________，采用__________________等手段可以扩大组织中绿色荧光区的面积。
解析：(1)图 1 为双 CRISPR/Cas9 系统作用示意图。该系统能够特异性识别 DNA 序列并切割特定位点的原因分别是向导RNA 能识别特定序列、Cas9 蛋白能定点切割 DNA 序列。图中向导 RNA 与 DNA 结合的原理是碱基互补配对。将删除区切割后，转入基因与原 DNA 片段可通过形成磷酸二酯键拼接起来，形成新的 DNA 序列。(2)双 CRISPR/Cas9 系统可直接在靶细胞内起作用，与传统的基因工程相比，该操作无需载体(运载体)。与质粒载体导入外源基因相比，双 CRISPR/Cas9 系统编辑的基因可以不含启动子、终止子和标记基因。(3)GUS 基因编码的酶可将无色底物生成蓝色产物，GFP 基因会产生绿色荧光蛋白，
在组织中检测出蓝色而无绿色荧光区，说明 GUS 基因正常表达而 GFP 基因不能正常表达，根据“Cre 基因是重组酶基因，经38 ℃热处理后可被激活表达，在此前提下组织中可检测出绿色荧光区”提示，可见 GFP 基因的正常表达需以 Cre 基因被激活表达为前提，即 GFP 基因自身无启动子，无法启动自身的表达。通过用 Cre 重组酶处理后，切割 lxP 序列，产生GFP 基因的启动子，使 GFP 基因得以表达。由于 Cre 基因是重组酶基因，经38 ℃热处理后可被激活表达，因此热处理时间越长，越有利于基因的表达，绿色荧光区的面积就越大。
答案：(1)向导 RNA
(2)载体(运载体、质粒)
启动子、终止子和标记基因
(3)GFP 重组酶能(特异性识别并)切割 lxP 序列，使 GFP
基因工程的基本操作程序
[典例 3](2018 年新课标Ⅰ卷)回答下列问题：(1)博耶(H.Byer) 和科恩(S.Chen) 将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了___________________________________________________________(答出两点即可)。入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体 DNA 通常需与_______组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA 导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是______________________。
(2)体外重组的质粒可通过 Ca2＋参与的___________方法导
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加__________的抑制剂。
[解析](1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2) 体外重组的质粒可通过Ca2＋处理，目的是以增大细胞的通透性，使
重组的质粒能够导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通
过Ca2＋ 参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA 通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵
染的方法将重组噬菌体 DNA 导入受体细胞。噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其他细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。[答案](1)体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基
外壳蛋白(或噬菌体蛋白)
4.(2019 年江苏卷)图 1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒 P0 具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
(1)EcR V 酶切位点为
…GAT↓ATC……CTA↑TAG…
，EcR V 酶切出来
的线性载体 P1 为______末端。(2)用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体 P1 用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成 P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒 P3。
(3)为筛选出含有重组质粒 P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到 A、B、C 三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________、________。
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行 PCR 鉴定。图 2 所示为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了 400bp 片段，原因是___________________________。
解析：(1)根据题意分析，EcR V 酶识别的序列是
－GATATC －，并且两条链都在中间的 T 与 A 之间进行切割，因此其切出来的线性载体 P1 为平末端。(2)据图分析，目的基
因两侧为黏性末端，且漏出的碱基为 A，则在载体 P1 的两端需要加一个碱基 T 形成具有黏性末端的载体 P2，再用 DNA 连接酶将 P2 与目的基因连接起来形成重组质粒 P3。(3)根据以上分析可知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒 P3 的菌落在四环素中应该不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择 B 类菌落。根据表格分析，A 类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C 类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没
有导入任何质粒。(4)据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR 技术的原理分析，PCR 鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物(甲、乙)从某一菌落的质粒中扩增出了 400bp 的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
(2)胸腺嘧啶(T) DNA 连接
(3)B A 类菌落含有 P0
[典例 4](2018 年新课标Ⅱ卷)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达，某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在 GFP 基因的 5′末端，获得了 L1－GFP 融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒 P0，构建了真核表达载体 P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中 E1～E4 四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒 P0 时，使用了两种限制酶，这两种酶是____________，使用这两种酶进行酶切是为了保证____________，也是为了保证________________。(2)将 P1 转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明 L1 基因在牛的皮肤细胞中完成了__________和____________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的__________移入牛的________中，体外培养，胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用 PCR 方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的__________(填“mRNA”“总 RNA”或“核 DNA”)作为PCR 模板。
[解析](1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在 GFP 基因的 5′末端而获得的 L1－GFP 融合基因，分析图示可知：该团队在将甲插入质粒 P0 时，如果用 E2 或 E3，则目的基因不完整，而使用E1 和E4 这两种
限制酶进行酶切既保证了甲的完整，也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶是 E1 和 E4。(2)构建的真核表达载体 P1 中含有 GFP 基因，而 GFP 基因的表达产物在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入 P1 的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明 L1 基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR 是多聚酶
链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。若利用 PCR 方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核 DNA 作为PCR 模板。
[答案] (1)E1 和 E4
(3)细胞核 去核卵母细胞
基因工程操作过程中的四个注意点
(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切 2 次，共产生 4 个黏性末端或平末端，切割质粒则只需限制酶剪切 1 次，因为质粒是环状 DNA 分子，而目的基因在 DNA 分子链上。
(2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶：如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在 DNA 连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(3)目的基因的插入点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。
(4)基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现象：第一步存在于用逆转录法等获得 DNA 时，第二步存在于黏性末端连接时，第四步存在于分子水平杂交检测时。
[考向预测]5.B 基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究 B 基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达 B 基因的转
基因植株。下列关于该实验的叙述，错误的是(
注：启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光。
A.B 基因在水稻卵细胞中不转录，可能是 B 基因的启动子
在卵细胞中无法启动转录
B.可利用水稻体细胞和精子中的 RNA 构建 cDNA 文库，从
中获得 B 基因中编码蛋白的序列
C.过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测 T-DNA 是否
整合到水稻细胞染色体 DNA 上
D.在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该
植株卵细胞中是否发出荧光
解析：启动子是与 RNA 聚合酶结合并能起始 mRNA 合成的序列，所以 B 基因在水稻卵细胞中不能转录，可能是 B 基因的启动子在卵细胞中无法启动转录，A 正确；目的基因获取途径之一就是从 cDNA 文库中获得，B 正确；检测 T-DNA 是否整合到水稻细胞染色体 DNA 上，应该用 DNA 分子杂交法，C 错误；由于基因表达载体上有 Luc 基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，D 正确。
6.(2019 年四川成都模拟)图 1 所示为用 PvuⅠ限制酶切下的某目的基因及其上 DNA 片段的示意图；图 2 所示为三种质粒结构，含复制原点标记基因(图中 Ap 为氨苄青霉素抗性基因，Tc 为四环素抗性基因)、EcRⅠ和 PvuⅠ限制酶切割位点等。请
(1)组成片段 D 的基本骨架与细胞膜的基本骨架相同的元素
是____________。
(2)图 2 中质粒 A、质粒 C 能否作为目的基因运载体最理想的质粒？________(填“能”或“否”)，请说明理由______________________________________________________________。
(3)重组质粒成功导入受体细胞的概率一般仅为 10－7，用质
粒 B 构建重组质粒后，为了筛选出导入了重组质粒的大肠杆菌，在导入完成后，将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养，大肠杆菌在两种培养基的生长状况不可能的是_________________________________________________，最可能是_____________________________________________。(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物，则需要将重组质粒导入至山羊的________(细胞种类)中。
解析：(1)脱氧核糖和磷酸交替连接构成 DNA 片段 D 的基本骨架，脱氧核糖由 C、H、O 三种元素组成，组成磷酸的元素是 H、P、O；磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架，磷脂分子是由 C、H、O、N、P 组成，可见组成片段 D 的基本骨架与细胞膜的基本骨架相同的元素是 C、H、O、P。(2)分析图 2 可知：质粒 A 缺少标记基因，质粒 C 在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制酶切割，进而影响重组质粒的自主复制，所以质粒 A、质粒 C 均不能作为目的基因运载体最理想的质粒。(3)用质粒 B 构建重组质粒，当用和目的基因相同的限制
酶(PvuⅠ)切割时，Tc 遭到破坏，而Ap 结构完好，因此在重组
质粒导入完成后，将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养，大肠杆菌在两种培养基的生长状况不可能的是在含四环素的培养基上能正常生长，在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长。因重组质粒成功导入受体细胞的概率
一般仅为10－7，所以最可能是在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长。(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物，则需要将重组质粒导入山羊的受精卵中。
答案：(1)C、H、O、P (2)否 质粒 A 缺少标记基因，质粒 C 在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制
酶切割，会影响重组质粒的自主复制
(3)在含四环素的培养基
上能正常生长，在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长
含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长(4)受精卵
生物技术的安全性和伦理问题
[典例 5](2018 年河南信阳模拟)生物技术是一把双刃剑，既可以造福人类，也可能因使用不当给人类带来灾难。请回答下列有关生物技术的安全性和伦理性问题：(1)由于科学发展水平的限制，在转基因生物中，有时候会出现一些人们意想不到的后果，引发了人们在食物安全、生物安全和__________安全三个方面发生了激烈的争论。(2)在转基因生物或产品研究过程中，绝大多数科学家都能自觉遵守科学研究道德。如对外源 DNA 进行认真选择，避免产生对人体有毒性或过敏的________。
(3)为解决不孕不育夫妇的生育问题而出现了试管婴儿技术，而 2002 年，英国一对夫妇通过设计试管婴儿，利用新生儿脐带血中造血干细胞，挽救患地中海贫血症的男孩。这两项技术的区别是____________________不需要经过基因检测。[解析](1)转基因生物的安全性在以下三个问题方面存在争议：食物安全(滞后效应、过敏源、营养成分改变)、生物安全(对生物多样性的影响)、环境安全(对生态系统稳定性的影响)；(2)在转基因生物或产品研究过程中，需对外源 DNA 进行认真选择，避免产生对人体有毒性或过敏的蛋白质；(3)设计试管婴儿技术是通过体外受精获得许多胚胎，然后从中选择符合要求的胚胎，再经移植后产生后代的技术。
[答案](1)环境 (2)蛋白质
7.生物技术的迅猛发展挑战了原有的社会伦理道德秩序，
(1)支持者认为，克隆人是一项科学研究，应当有它内在的发展规律，允许有一定的发展。反对者则认为，克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念，克隆人是在人为地制造________________________________________都不健全的人。
(2)在针对克隆技术的争论中，我国政府态度明确，及时立法，规范了克隆技术的应用。我国明确禁止生殖性克隆人，一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、________任何生殖性克隆人的实验。(3)设计试管婴儿与试管婴儿在技术手段上的区别是___________________________________________，前者的生殖方式是____________。
答案：(1)心理上和社会地位上
(3)多了胚胎移植前进行遗传诊断这一环节
[典例 6](2018 年天津卷)甲型流感病毒为 RNA 病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在 2017 年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒 RNA 为模板，逆转录成对应 DNA 后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊 tRNA 的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述 tRNA 的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加______________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊 tRNA，翻译出改造病
毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA 基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。
A.病毒的 DNA 聚合酶C.病毒的 RNA 聚合酶
B.宿主的 DNA 聚合酶D.宿主的 RNA 聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖 ，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起_______免疫，增强免疫保护效果。
[解析](1)体外进行 DNA 扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR 技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体(运载体)连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术鉴定，筛选获得成功表达目的 RNA 的细胞时，需提取宿主细胞的总 RNA。(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有 Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病
毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入 Uaa。转录时，识别启动子的酶为 RNA 聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的 RNA 聚合酶。(4)正常细胞中不含 Uaa，所以病毒有活性，但不能增殖，能引发体液免疫和细胞免疫，而灭活病毒只引起体液免疫，因此该疫苗的优越性体现在可以引发细胞免疫。
[答案](1)PCR 多肽(或蛋白质)
(2)载体 总 RNA
(3)非天然氨基酸(Uaa)
8.(2020 年山东卷)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的 DNA 序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了 3 个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的 DNA 序列插入 Ti 质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为______________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx 基因启动子序列的改变影响了________________，从而改变了 Wx 基因的转录水平。与野生型水稻相比，3 个突变品系中 Wx 基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________( 填“发生”或“不发生”) 改变，原因是________________________________。
(3)为检测启动子变化对 Wx 基因表达的影响，科研人员需要检测 Wx 基因转录产生的 mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总 RNA，经______过程获得总 cDNA。通过 PCR 技术可在总 cDNA 中专一性地扩增出 Wx 基因的cDNA，原因是____________________________________。
(4)各品系 Wx mRNA 量的检测结果如下图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是____________________________________________________________________________。
解析：(1)将目的基因与Ti 质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要 DNA 连接酶，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)根据以上分析可知，启动子是 RNA 聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA 聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平，在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此 3 个突变品系中 Wx 基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改
变。(3)以mRNA 为模板合成 cDNA 的过程为逆转录，利用 PCR技术扩增 Wx 基因的cDNA，需要以 Wx 基因的一段已知序列合成引物，这样的引物能够在总 cDNA 中与 Wx 基因的 cDNA 特异性结合，从而利用 PCR 扩增技术专一性扩增出 Wx 基因的cDNA。(4)据图分析可知，图中品系 3 的 Wx 基因的 mRNA 的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中的直链淀粉比例最小，糯性最强。