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高中人教版 (2019)第1节 重组DNA技术的基本工具导学案及答案
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这是一份高中人教版 (2019)第1节 重组DNA技术的基本工具导学案及答案，共23页。学案主要包含了师问导学，智涂笔记，师说核心，检测反馈，网络建构，主干落实等内容，欢迎下载使用。
课程标准
1.基因工程是一种重组DNA技术。
2．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
3．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
素养达成
1.了解基因工程的概念、诞生及发展。(生命观念、社会责任)
2．掌握限制酶及DNA连接酶的作用。(科学思维)
3．理解载体需具备的条件。(科学思维)
在亚洲和非洲的贫困地区，人们由于无法获取足够的肉类和蔬菜，导致维生素A严重缺乏，据世界卫生组织估计，全世界有1.2亿～2.5亿人缺乏维生素A，每年约有100多万儿童因缺乏维生素A失去生命。胡萝卜素可在人体内转变成维生素A，因此，科学家利用基因工程技术，将有关酶的基因转入水稻中，并诱导它们在水稻细胞中表达，使水稻体内能够合成β胡萝卜素。如果人每天食用的大米含β胡萝卜素，就能满足人体对维生素A的需求。人们是怎样将胡萝卜体内的基因转移到水稻体内的呢？这个过程中需要哪些技术和操作工具呢？
探究点一 基因工程及其诞生与发展
【师问导学】
背景材料 我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉，就是通过精心设计，用“分子工具”构建成的。培育抗虫棉首先要在体外对含有抗虫基因的DNA分子进行“切割”、改造、修饰和“拼接”，然后导入棉花体细胞内，并使重组DNA在细胞中表达。
[思考交流]
1．填写下表，理解基因工程的概念。
【智涂笔记】
[易错提醒]
(1)有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行。
(2)基因工程可以定向地改变生物的性状，可以在不同物种间进行基因重组。
[方法链接]
基因重组的三种主要类型
(1)减数第一次分裂四分体时期，同源染色体上的非姐妹染色单体间发生交叉互换，导致染色单体上的基因重新组合。
(2)减数第一次分裂后期，随着非同源染色体的自由组合，非同源染色体上的非等位基因也自由组合。
(3)人工操作导致的基因重组，即基因工程。
2.不同生物的DNA能够拼接成功的基础是什么？
3．一种生物的基因能在另一种生物的细胞中成功表达的基础是什么？
4．有性生殖中的基因重组是随机的，且只能在同一物种间进行。基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组有何区别？
【师说核心】
1．基因工程的原理是基因重组
自然状态下基因重组有两种情况：减数第一次分裂前期四分体的非姐妹染色单体间的交叉互换和减数第一次分裂后期非同源染色体的自由组合。基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。
2．基因工程的理论基础
(1)拼接的基础
①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。
②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。
③碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。
(2)表达的基础：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内可表达出相同的蛋白质。
3．基因工程可以按照人们的意愿，定向改造生物的遗传特性，从而产生定向的变异，并可实现不同物种间的基因交流，打破生殖隔离。应与现代进化论中的“变异是不定向的”“物种间存在生殖隔离”区分开来。
【检测反馈】
1．下列对基因工程的说法，错误的是( )
A．基因工程是在分子水平上进行设计和施工
B．基因工程属于染色体变异
C．基因工程可以导入不同种生物的基因
D．基因工程可定向改变生物性状
2．以下事实与基因工程的诞生无关的是( )
①肺炎链球菌的转化实验 ②中心法则的确立 ③克隆羊“多莉”的诞生 ④精子获能机理的揭示 ⑤遗传密码的破译
⑥质粒、限制酶、连接酶及逆转录酶的发现 ⑦DNA合成仪的问世 ⑧体外重组DNA分子构建的成功 ⑨重组DNA进入受体细胞并成功表达
A．①⑥ B．③⑥
C．③④ D．④⑤
3．科学家经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体的DNA分子
B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向地改造生物的遗传性状
4．下列叙述符合基因工程概念的是( )
A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
探究点二 基因工程的工具酶
【师问导学】
一、背景材料
【智涂笔记】
[易错警示]
(1)限制酶不切割自身DNA的原因是该生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。
(2)限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。
(3)DNA连接酶无识别的特异性，对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接。
[思考交流]
1．DNA分子中磷酸与脱氧核糖是如何连接的？该化学键的名称是什么？
2．限制酶的作用特点是什么？所识别的序列有何特点？作用后的结果有哪两种形式？
3．DNA连接酶的作用是什么？
二、下图中的图1和图2分别表示的是EcRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。请据图回答：
1．请说出EcRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。
2．EcRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶作用的结果分别是什么？
3．以上实例说明限制酶有何特性？该特性的含义是什么？
4．DNA连接酶、限制酶和DNA聚合酶都作用于哪种化学键，分别对这种化学键有何影响？
[特别提醒]
(1)限制酶是一类酶而不是一种酶。
(2)不同种类的限制酶识别的序列与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。
(3)在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割2次，产生4个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的末端。
(4)限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成；后者是双链序列。
(5)DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口连接起来，因此DNA连接酶不需要模板。两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能通过DNA连接酶拼接起来；平末端只能用T4DNA连接酶连接。
(6)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同，即同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割。
【师说核心】
1．限制酶与DNA连接酶的比较
(1)区别
(2)两者的关系可表示为：
(3)磷酸二酯键指的是下图圆圈中的化学键，而限制酶切割或DNA连接酶连接的只能是箭头所指处的化学键，因为圈中另一个化学键属于一个核苷酸的内部结构。
(4)识别序列的特点
呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线(如图)，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；为轴，两侧碱基互补对称。
中轴线
(5)作用结果：限制酶切割DNA产生的DNA末端有黏性末端和平末端两种形式。
①黏性末端是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：
②平末端是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：
2．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
三、回答下列问题：
1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
2．限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？
3.与DNA相关的五种酶的比较
【检测反馈】
1．限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示，下列有关说法正确的是( )
A．一个DNA分子中，酶a与酶b的识别序列可能有多个
B．酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接
C．酶a与酶b切断的化学键不完全相同
D．用酶a切割有3个识别位点的质粒，得到4种切割产物
2．下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E.cli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸
3．下列关于几种酶作用的叙述，错误的是( )
A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接
B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录
C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因
D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链
4．下表所示为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，正确的是( )
注：Y＝C或T，R＝A或G。
A．限制酶切割后不一定形成黏性末端
B．限制酶的切割位点一定在识别序列的内部
C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
探究点三 基因工程中的载体
【师问导学】
1．质粒作为目的基因的载体，其本质是什么？
2．所有载体都是质粒吗？为什么？
3．将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
4．质粒上的一些抗生素抗性基因有什么作用？
5．细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
【智涂笔记】
[特别提醒]
(1)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，后者是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。
(2)一般来说，天然载体不能同时满足上述条件，要对其进行人工改造才可以使用。
【师说核心】
1．作为载体所具备的条件
2.常用载体的种类及用途
3.标记基因的筛选原理
(1)前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
(2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。
(3)结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
原理如图所示：
【检测反馈】
1．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B．在质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA的鉴定和选择
2．下面是四种不同质粒的示意图，其中ri为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是( )
3．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( )
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择
4．限制酶Mun Ⅰ和限制酶EcR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是 和。如图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是( )
探究点四 DNA的粗提取与鉴定
【师问导学】
1．实验材料的选取：
哺乳动物的红细胞和鸡的血液提取DNA效果更好的是________。原因是
________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
2．实验操作分析：
(1)实验过程要充分地研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
(2)实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
【智涂笔记】
DNA的粗提取与鉴定中的注意事项
(1)过滤含DNA的黏稠物时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。
(2)用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。
(4)鉴定DNA还可使用甲基绿染液，甲基绿染液可将DNA染成绿色。
【师说核心】
1．加入洗涤剂的目的是溶解细胞膜、核膜，释放出细胞内含物。加入食盐的目的是使构成染色体的核蛋白加速解聚，游离出DNA分子，并使DNA分子充分溶解于浓NaCl溶液中。
2．过滤不能用滤纸代替纱布，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
3．滤液中可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等细胞成分。
【检测反馈】
1．下列各项中不宜选作DNA提取材料的是( )
A．洋葱表皮细胞 B．鲜豌豆种子
C．人的红细胞 D．猪肝
2．下面不能影响DNA粗提取含量的是( )
A．选材 B．洗涤剂的用量
C．二苯胺的用量 D．搅拌和研磨的程度
3．玻璃棒搅拌出的较纯净的DNA的颜色以及DNA遇二苯胺(沸水浴)染上的颜色分别是( )
A．黄色、紫色 B．白色、砖红色
C．白色、蓝色 D．蓝色、砖红色
4．用过滤的方法得到含DNA的NaCl溶液后，还要用酒精处理，才可以得到较纯的DNA，这是因为( )
A．DNA易溶于酒精，而滤液中某些杂质不易溶于酒精
B．DNA不易溶于酒精，而滤液中某些杂质易溶于酒精
C．DNA和滤液中其他成分更易溶于酒精
D．DNA和滤液中其他成分都不溶于酒精
【网络建构】
【主干落实】
1．基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
2．DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。
3．限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。
4．E.cli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。
5．质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。
6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
1.下列关于限制酶的说法，不正确的是( )
A．限制酶广泛存在于各种生物中，主要分布在真核生物中
B．限制酶可以将DNA分子切开
C．一种限制酶通常只能识别一种特定的核苷酸序列
D．一般不同的限制酶切割DNA的切点不同
2．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核(或细胞核)外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制
3．现有一长度为1 000个碱基对(bp)的DNA分子，用限制酶EcR Ⅰ酶切后得到的DNA分子仍是1 000 bp，用Kpn Ⅰ单独酶切后得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子，用EcR Ⅰ、Kpn Ⅰ同时酶切后得到200 bp和600 bp两种长度的DNA分子。如图所示，该DNA分子的酶切图谱正确的是( )
4．如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。
(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同，都是____________，二者还具有其他共同点，如________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。(写出两条即可)
(2)若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为____________，可使用________把质粒和目的基因连接在一起。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________，其作用是________________________________________________________________________。
(4)下列常在基因工程中用作载体的是( )
A．苏云金芽孢杆菌抗虫基因
B．土壤农杆菌环状RNA分子
C．大肠杆菌的质粒
D．动物细胞的染色体
(一)从社会中来
提示：科学家用到了限制酶、DNA连接酶、载体等“分子工具”。限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并将DNA双链切断，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，即催化一个DNA片段3′端的羟基与另一个DNA片段5′端的磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键。载体上可以插入外源基因，它能携带该基因进入受体细胞，并在受体细胞中进行自我复制，或者整合到受体DNA上，随着受体DNA同步复制。载体一般还带有标记基因，以便进行重组DNA分子的筛选。
(二)旁栏思考题
1．提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
2．不是一回事。虽然DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成的酶，但两者存在显著的区别。
(1)DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是催化单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶以一条DNA链为模板，催化形成与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，它不需要模板。
此外，两者虽然都是蛋白质，但它们的组成和性质各不相同。
(三)思考·讨论
1．剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2．提示：根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3．不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
(四)到社会中去
提示：在调查中需要了解企业的生产技术、产品的种类和产量、销售渠道和销售情况等，这样才有可能对企业的经营状况进行正确的判断。
(五)探究·实践
1．提示：观察提取的DNA颜色：如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
二苯胺法鉴定：二苯胺鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新提取。
2．提示：本实验提取的DNA粗制品中有可能含有核蛋白、多糖等杂质。
3．提示：实验结果不明显的可能原因
(1)材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
(2)加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
(3)二苯胺最好现配现用，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
(六)练习与应用
概念检测
1．C
2．A
拓展应用
1．提示：迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
2．(1)Xba Ⅰ。因为Xba Ⅰ与Spe Ⅰ切割产生了相同的黏性末端。
(2)提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
第3章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
互动·探究·智涂
探究点一
【师问导学】
1．DNA重组 转基因 遗传特性 生物类型 生物产品 DNA分子
2．提示：都由四种脱氧核苷酸组成，都具有规则的双螺旋结构。
3．提示：所有生物共用一套遗传密码。
4．提示：基因工程可以在不同物种间进行基因重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
【检测反馈】
1．解析：基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工，A正确；基因工程属于基因重组，B错误；基因工程可以导入不同种生物的基因，C正确；基因工程可按照人们的意愿，定向改变生物性状，D正确。
答案：B
2．解析：肺炎链球菌的转化实验证明了一个生物的遗传物质可在同种的另一个生物的细胞中发挥作用，证明了转基因技术的可能性，①有关；中心法则的确立使人们认识了遗传信息的表达过程，奠定了基因工程的理论基础，②有关；克隆羊“多莉”的诞生、精子获能机理的揭示都属于细胞水平的研究成果，与基因工程的诞生无关，③④无关；遗传密码的破译使人们认识到核酸与蛋白质中的氨基酸的对应关系，这也是基因工程诞生的理论基础，⑤有关；质粒、限制酶、连接酶及逆转录酶的发现、DNA合成仪的问世为基因工程诞生提供了技术支持，⑥⑦有关；体外重组DNA分子构建的成功、重组DNA进入受体细胞并成功表达标志着基因工程的诞生，⑧⑨有关。
答案：C
3．解析：该题的关键词是“最终目的”，A、B、C三项都是基因工程的技术手段，这些手段的目的是定向改造生物的遗传性状，故选D项。
答案：D
4．解析：基因工程是在生物体外将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性，A错误；B项符合基因工程的概念；C项属于诱变育种；D项外源基因导入细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴。
答案：B
探究点二
【师问导学】
一、
1．提示：DNA分子中磷酸与脱氧核糖交替连接。其中同一核苷酸内部磷酸与脱氧核糖的5号碳相连，相邻两核苷酸之间磷酸与3号碳相连。连接形成的化学键叫磷酸二酯键。
2．提示：(1)一种限制酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
(2)限制酶所识别的序列一般都具有反向对称重复排列的特点。
(3)黏性末端和平末端。
3．提示：将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段之间的磷酸二酯键连接起来“缝合”成新的DNA分子。
二、
1．提示：EcRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
2．提示：EcRⅠ限制酶将DNA切割成黏性末端，SmaⅠ限制酶将DNA切割成平末端。
3．提示：说明限制酶具有专一性。专一性指的是限制酶能识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上进行切割。
4．提示：均作用于磷酸二酯键，DNA连接酶和DNA聚合酶是形成磷酸二酯键，限制酶是破坏磷酸二酯键。
三、
1．提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
2．提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.cli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，专一性不强。
【检测反馈】
1．解析：一个DNA分子中，可能存在一个至多个酶a与酶b的识别序列，A正确；由图可知，酶a与酶b识别的序列虽然不同，但切出的黏性末端相同，相同的黏性末端能相互连接，B错误；酶a与酶b切断的化学键均为相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；质粒为小型环状DNA分子，用酶a切割有3个识别位点的质粒，可得到3种切割产物，D错误。
答案：A
2．解析：DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来。E.cli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。
答案：C
3．解析：限制酶具有专一性，一种限制酶一般只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子。DNA连接酶能使不同DNA片段的脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，重新形成DNA分子；RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录；DNA聚合酶能以DNA的一条链为模板，把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链，复制形成新的DNA分子。
答案：C
4．解析：由表中信息可知，Hind Ⅱ能识别4种不同的核苷酸序列；Sau3A Ⅰ酶的切割位点在识别序列的外部；BamH Ⅰ酶与Sau3A Ⅰ酶切割后能形成相同的黏性末端；Sma Ⅰ酶切割后产生的是平末端。
答案：A
探究点三
【师问导学】
1．提示：小型环状DNA。
2．提示：不是，除了质粒外，载体还有动植物病毒和λ噬菌体的衍生物。
3．提示：不可行，因为如果没有载体导入受体细胞，目的基因无法进行自我复制和稳定存在以及表达。
4．提示：检测目的基因是否导入受体细胞。
5．提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。
(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
【检测反馈】
1．解析：质粒不只分布于原核生物中，在真核生物(如酵母菌)细胞内也有分布，A错误；并不是每个质粒上都有限制酶的切割位点，B错误；重组质粒进入受体细胞后，有的是在细胞内自我复制，有的是整合到宿主细胞染色体DNA上随染色体DNA复制，C错误；质粒上的抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA的鉴定和选择，D正确。
答案：D
2．解析：根据题意，选用的质粒上应有复制必需序列和四环素抗性基因，且不含氨苄青霉素抗性基因。A项破坏了复制必需的序列，B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。
答案：C
3．解析：作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。
答案：A
4．解析：用限制酶Mun Ⅰ切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体。C、D质粒含有标记基因，但用限制酶切割后会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体。
答案：A
探究点四
【师问导学】
1．鸡的血液 鸡血细胞的核DNA含量丰富，材料易得，而哺乳动物的红细胞无细胞核，不含DNA
2．(1)提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
(2)提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
【检测反馈】
1．解析：作为DNA提取材料的首要条件是细胞内要含有DNA，次要条件是DNA的含量丰富，而哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，所以不宜选作实验材料。
答案：C
2．解析：A项：尽量选择DNA含量高的材料粗提取DNA。B项：洗涤剂的用量和类型能影响细胞膜的瓦解程度，从而导致DNA的释放量的变化。C项：二苯胺是DNA的鉴定剂，而非提取剂。D项：搅拌和研磨充分有利于DNA的释放。
答案：C
3．解析：从体积分数为95%的冷酒精中析出的较纯净DNA的颜色是白色；鉴定DNA时，DNA遇二苯胺在沸水浴条件下呈现蓝色。
答案：C
4．解析：DNA不易溶于酒精，而滤液中某些杂质易溶于酒精，利用这个特点可去除溶于酒精的杂质，得到较纯的DNA。
答案：B
随堂·巩固·达标
1．解析：限制酶主要是从原核生物中分离出来的，并不是广泛存在于各种生物中；DNA分子可被限制酶特异性切割；一种限制酶通常只能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
答案：A
2．解析：质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。
答案：A
3．解析：该DNA分子用限制酶EcR Ⅰ切割后长度不变，可知该DNA分子为环状结构，根据EcR Ⅰ、Kpn Ⅰ的作用特点，可知酶切图谱为D项所示。
答案：D
4．解析：质粒是基因工程中最常用的载体，是一种裸露的、结构简单、独立于细胞核或细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点，进入受体细胞后能自我复制，具有标记基因便于重组DNA的鉴定与选择。
答案：(1)DNA 能够自我复制、具有遗传效应
(2) DNA连接酶
(3)标记基因 供重组DNA的鉴定和选择 (4)C
手段
通过体外________和________等技术，赋予生物新的________
目的
按照人们的愿望，创造出更符合人们需要的新的________和________
设计和施工水平
________________水平
项目
作用
应用
限制酶
使特定部位的磷酸二酯键断裂
用于提取目的基因和切割载体
DNA
连接酶
在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于基因表达载体的构建
项目
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点
催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
不
同
点
模板
不需要模板
需要DNA的一条链为模板
作用对象
游离的DNA片段
单个的脱氧核苷酸
作用结果
形成完整的DNA分子
形成DNA的一条链
用途
基因工程
DNA复制
名称
作用部位
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
将DNA切成两个片段
DNA
连接酶
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA
聚合酶
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA
(水解)酶
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
限制酶
名称
识别序列和
切割位点
限制酶名称
识别序列和
切割位点
BamH Ⅰ
eq \(GG,\s\up6(↓))ATCC
Kpn Ⅰ
GGTAeq \(CC,\s\up6(↓))
EcR Ⅰ
eq \(GA,\s\up6(↓))ATTC
Sau3A Ⅰ
eq \( G,\s\up6(↓))ATC
Hind Ⅱ
GTeq \(YR,\s\up6(↓))AC
Sma Ⅰ
CCeq \(CG,\s\up6(↓))GG
条件
分析
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
无毒害作用
避免受体细胞受到损伤
种类
用途
质粒
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
λ噬菌体的衍生物
植物病毒
将外源基因导入植物细胞
动物病毒
将外源基因导入动物细胞
课程标准
1.基因工程是一种重组DNA技术。
2．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
3．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
素养达成
1.了解基因工程的概念、诞生及发展。(生命观念、社会责任)
2．掌握限制酶及DNA连接酶的作用。(科学思维)
3．理解载体需具备的条件。(科学思维)
在亚洲和非洲的贫困地区，人们由于无法获取足够的肉类和蔬菜，导致维生素A严重缺乏，据世界卫生组织估计，全世界有1.2亿～2.5亿人缺乏维生素A，每年约有100多万儿童因缺乏维生素A失去生命。胡萝卜素可在人体内转变成维生素A，因此，科学家利用基因工程技术，将有关酶的基因转入水稻中，并诱导它们在水稻细胞中表达，使水稻体内能够合成β胡萝卜素。如果人每天食用的大米含β胡萝卜素，就能满足人体对维生素A的需求。人们是怎样将胡萝卜体内的基因转移到水稻体内的呢？这个过程中需要哪些技术和操作工具呢？
探究点一 基因工程及其诞生与发展
【师问导学】
背景材料 我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉，就是通过精心设计，用“分子工具”构建成的。培育抗虫棉首先要在体外对含有抗虫基因的DNA分子进行“切割”、改造、修饰和“拼接”，然后导入棉花体细胞内，并使重组DNA在细胞中表达。
[思考交流]
1．填写下表，理解基因工程的概念。
【智涂笔记】
[易错提醒]
(1)有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行。
(2)基因工程可以定向地改变生物的性状，可以在不同物种间进行基因重组。
[方法链接]
基因重组的三种主要类型
(1)减数第一次分裂四分体时期，同源染色体上的非姐妹染色单体间发生交叉互换，导致染色单体上的基因重新组合。
(2)减数第一次分裂后期，随着非同源染色体的自由组合，非同源染色体上的非等位基因也自由组合。
(3)人工操作导致的基因重组，即基因工程。
2.不同生物的DNA能够拼接成功的基础是什么？
3．一种生物的基因能在另一种生物的细胞中成功表达的基础是什么？
4．有性生殖中的基因重组是随机的，且只能在同一物种间进行。基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组有何区别？
【师说核心】
1．基因工程的原理是基因重组
自然状态下基因重组有两种情况：减数第一次分裂前期四分体的非姐妹染色单体间的交叉互换和减数第一次分裂后期非同源染色体的自由组合。基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。
2．基因工程的理论基础
(1)拼接的基础
①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。
②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。
③碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。
(2)表达的基础：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内可表达出相同的蛋白质。
3．基因工程可以按照人们的意愿，定向改造生物的遗传特性，从而产生定向的变异，并可实现不同物种间的基因交流，打破生殖隔离。应与现代进化论中的“变异是不定向的”“物种间存在生殖隔离”区分开来。
【检测反馈】
1．下列对基因工程的说法，错误的是( )
A．基因工程是在分子水平上进行设计和施工
B．基因工程属于染色体变异
C．基因工程可以导入不同种生物的基因
D．基因工程可定向改变生物性状
2．以下事实与基因工程的诞生无关的是( )
①肺炎链球菌的转化实验 ②中心法则的确立 ③克隆羊“多莉”的诞生 ④精子获能机理的揭示 ⑤遗传密码的破译
⑥质粒、限制酶、连接酶及逆转录酶的发现 ⑦DNA合成仪的问世 ⑧体外重组DNA分子构建的成功 ⑨重组DNA进入受体细胞并成功表达
A．①⑥ B．③⑥
C．③④ D．④⑤
3．科学家经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体的DNA分子
B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向地改造生物的遗传性状
4．下列叙述符合基因工程概念的是( )
A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
探究点二 基因工程的工具酶
【师问导学】
一、背景材料
【智涂笔记】
[易错警示]
(1)限制酶不切割自身DNA的原因是该生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。
(2)限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。
(3)DNA连接酶无识别的特异性，对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接。
[思考交流]
1．DNA分子中磷酸与脱氧核糖是如何连接的？该化学键的名称是什么？
2．限制酶的作用特点是什么？所识别的序列有何特点？作用后的结果有哪两种形式？
3．DNA连接酶的作用是什么？
二、下图中的图1和图2分别表示的是EcRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。请据图回答：
1．请说出EcRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。
2．EcRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶作用的结果分别是什么？
3．以上实例说明限制酶有何特性？该特性的含义是什么？
4．DNA连接酶、限制酶和DNA聚合酶都作用于哪种化学键，分别对这种化学键有何影响？
[特别提醒]
(1)限制酶是一类酶而不是一种酶。
(2)不同种类的限制酶识别的序列与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。
(3)在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割2次，产生4个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的末端。
(4)限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成；后者是双链序列。
(5)DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口连接起来，因此DNA连接酶不需要模板。两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能通过DNA连接酶拼接起来；平末端只能用T4DNA连接酶连接。
(6)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同，即同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割。
【师说核心】
1．限制酶与DNA连接酶的比较
(1)区别
(2)两者的关系可表示为：
(3)磷酸二酯键指的是下图圆圈中的化学键，而限制酶切割或DNA连接酶连接的只能是箭头所指处的化学键，因为圈中另一个化学键属于一个核苷酸的内部结构。
(4)识别序列的特点
呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线(如图)，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；为轴，两侧碱基互补对称。
中轴线
(5)作用结果：限制酶切割DNA产生的DNA末端有黏性末端和平末端两种形式。
①黏性末端是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：
②平末端是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：
2．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
三、回答下列问题：
1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
2．限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？
3.与DNA相关的五种酶的比较
【检测反馈】
1．限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示，下列有关说法正确的是( )
A．一个DNA分子中，酶a与酶b的识别序列可能有多个
B．酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接
C．酶a与酶b切断的化学键不完全相同
D．用酶a切割有3个识别位点的质粒，得到4种切割产物
2．下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E.cli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸
3．下列关于几种酶作用的叙述，错误的是( )
A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接
B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录
C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因
D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链
4．下表所示为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，正确的是( )
注：Y＝C或T，R＝A或G。
A．限制酶切割后不一定形成黏性末端
B．限制酶的切割位点一定在识别序列的内部
C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
探究点三 基因工程中的载体
【师问导学】
1．质粒作为目的基因的载体，其本质是什么？
2．所有载体都是质粒吗？为什么？
3．将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
4．质粒上的一些抗生素抗性基因有什么作用？
5．细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
【智涂笔记】
[特别提醒]
(1)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，后者是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。
(2)一般来说，天然载体不能同时满足上述条件，要对其进行人工改造才可以使用。
【师说核心】
1．作为载体所具备的条件
2.常用载体的种类及用途
3.标记基因的筛选原理
(1)前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
(2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。
(3)结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
原理如图所示：
【检测反馈】
1．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B．在质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA的鉴定和选择
2．下面是四种不同质粒的示意图，其中ri为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是( )
3．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( )
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择
4．限制酶Mun Ⅰ和限制酶EcR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是 和。如图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是( )
探究点四 DNA的粗提取与鉴定
【师问导学】
1．实验材料的选取：
哺乳动物的红细胞和鸡的血液提取DNA效果更好的是________。原因是
________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
2．实验操作分析：
(1)实验过程要充分地研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
(2)实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
【智涂笔记】
DNA的粗提取与鉴定中的注意事项
(1)过滤含DNA的黏稠物时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。
(2)用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。
(4)鉴定DNA还可使用甲基绿染液，甲基绿染液可将DNA染成绿色。
【师说核心】
1．加入洗涤剂的目的是溶解细胞膜、核膜，释放出细胞内含物。加入食盐的目的是使构成染色体的核蛋白加速解聚，游离出DNA分子，并使DNA分子充分溶解于浓NaCl溶液中。
2．过滤不能用滤纸代替纱布，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
3．滤液中可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等细胞成分。
【检测反馈】
1．下列各项中不宜选作DNA提取材料的是( )
A．洋葱表皮细胞 B．鲜豌豆种子
C．人的红细胞 D．猪肝
2．下面不能影响DNA粗提取含量的是( )
A．选材 B．洗涤剂的用量
C．二苯胺的用量 D．搅拌和研磨的程度
3．玻璃棒搅拌出的较纯净的DNA的颜色以及DNA遇二苯胺(沸水浴)染上的颜色分别是( )
A．黄色、紫色 B．白色、砖红色
C．白色、蓝色 D．蓝色、砖红色
4．用过滤的方法得到含DNA的NaCl溶液后，还要用酒精处理，才可以得到较纯的DNA，这是因为( )
A．DNA易溶于酒精，而滤液中某些杂质不易溶于酒精
B．DNA不易溶于酒精，而滤液中某些杂质易溶于酒精
C．DNA和滤液中其他成分更易溶于酒精
D．DNA和滤液中其他成分都不溶于酒精
【网络建构】
【主干落实】
1．基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
2．DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。
3．限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。
4．E.cli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。
5．质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。
6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
1.下列关于限制酶的说法，不正确的是( )
A．限制酶广泛存在于各种生物中，主要分布在真核生物中
B．限制酶可以将DNA分子切开
C．一种限制酶通常只能识别一种特定的核苷酸序列
D．一般不同的限制酶切割DNA的切点不同
2．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核(或细胞核)外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制
3．现有一长度为1 000个碱基对(bp)的DNA分子，用限制酶EcR Ⅰ酶切后得到的DNA分子仍是1 000 bp，用Kpn Ⅰ单独酶切后得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子，用EcR Ⅰ、Kpn Ⅰ同时酶切后得到200 bp和600 bp两种长度的DNA分子。如图所示，该DNA分子的酶切图谱正确的是( )
4．如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。
(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同，都是____________，二者还具有其他共同点，如________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。(写出两条即可)
(2)若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为____________，可使用________把质粒和目的基因连接在一起。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________，其作用是________________________________________________________________________。
(4)下列常在基因工程中用作载体的是( )
A．苏云金芽孢杆菌抗虫基因
B．土壤农杆菌环状RNA分子
C．大肠杆菌的质粒
D．动物细胞的染色体
(一)从社会中来
提示：科学家用到了限制酶、DNA连接酶、载体等“分子工具”。限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并将DNA双链切断，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，即催化一个DNA片段3′端的羟基与另一个DNA片段5′端的磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键。载体上可以插入外源基因，它能携带该基因进入受体细胞，并在受体细胞中进行自我复制，或者整合到受体DNA上，随着受体DNA同步复制。载体一般还带有标记基因，以便进行重组DNA分子的筛选。
(二)旁栏思考题
1．提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
2．不是一回事。虽然DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成的酶，但两者存在显著的区别。
(1)DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是催化单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶以一条DNA链为模板，催化形成与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，它不需要模板。
此外，两者虽然都是蛋白质，但它们的组成和性质各不相同。
(三)思考·讨论
1．剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2．提示：根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3．不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
(四)到社会中去
提示：在调查中需要了解企业的生产技术、产品的种类和产量、销售渠道和销售情况等，这样才有可能对企业的经营状况进行正确的判断。
(五)探究·实践
1．提示：观察提取的DNA颜色：如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
二苯胺法鉴定：二苯胺鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新提取。
2．提示：本实验提取的DNA粗制品中有可能含有核蛋白、多糖等杂质。
3．提示：实验结果不明显的可能原因
(1)材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
(2)加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
(3)二苯胺最好现配现用，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
(六)练习与应用
概念检测
1．C
2．A
拓展应用
1．提示：迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
2．(1)Xba Ⅰ。因为Xba Ⅰ与Spe Ⅰ切割产生了相同的黏性末端。
(2)提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
第3章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
互动·探究·智涂
探究点一
【师问导学】
1．DNA重组 转基因 遗传特性 生物类型 生物产品 DNA分子
2．提示：都由四种脱氧核苷酸组成，都具有规则的双螺旋结构。
3．提示：所有生物共用一套遗传密码。
4．提示：基因工程可以在不同物种间进行基因重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
【检测反馈】
1．解析：基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工，A正确；基因工程属于基因重组，B错误；基因工程可以导入不同种生物的基因，C正确；基因工程可按照人们的意愿，定向改变生物性状，D正确。
答案：B
2．解析：肺炎链球菌的转化实验证明了一个生物的遗传物质可在同种的另一个生物的细胞中发挥作用，证明了转基因技术的可能性，①有关；中心法则的确立使人们认识了遗传信息的表达过程，奠定了基因工程的理论基础，②有关；克隆羊“多莉”的诞生、精子获能机理的揭示都属于细胞水平的研究成果，与基因工程的诞生无关，③④无关；遗传密码的破译使人们认识到核酸与蛋白质中的氨基酸的对应关系，这也是基因工程诞生的理论基础，⑤有关；质粒、限制酶、连接酶及逆转录酶的发现、DNA合成仪的问世为基因工程诞生提供了技术支持，⑥⑦有关；体外重组DNA分子构建的成功、重组DNA进入受体细胞并成功表达标志着基因工程的诞生，⑧⑨有关。
答案：C
3．解析：该题的关键词是“最终目的”，A、B、C三项都是基因工程的技术手段，这些手段的目的是定向改造生物的遗传性状，故选D项。
答案：D
4．解析：基因工程是在生物体外将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性，A错误；B项符合基因工程的概念；C项属于诱变育种；D项外源基因导入细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴。
答案：B
探究点二
【师问导学】
一、
1．提示：DNA分子中磷酸与脱氧核糖交替连接。其中同一核苷酸内部磷酸与脱氧核糖的5号碳相连，相邻两核苷酸之间磷酸与3号碳相连。连接形成的化学键叫磷酸二酯键。
2．提示：(1)一种限制酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
(2)限制酶所识别的序列一般都具有反向对称重复排列的特点。
(3)黏性末端和平末端。
3．提示：将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段之间的磷酸二酯键连接起来“缝合”成新的DNA分子。
二、
1．提示：EcRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
2．提示：EcRⅠ限制酶将DNA切割成黏性末端，SmaⅠ限制酶将DNA切割成平末端。
3．提示：说明限制酶具有专一性。专一性指的是限制酶能识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上进行切割。
4．提示：均作用于磷酸二酯键，DNA连接酶和DNA聚合酶是形成磷酸二酯键，限制酶是破坏磷酸二酯键。
三、
1．提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
2．提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.cli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，专一性不强。
【检测反馈】
1．解析：一个DNA分子中，可能存在一个至多个酶a与酶b的识别序列，A正确；由图可知，酶a与酶b识别的序列虽然不同，但切出的黏性末端相同，相同的黏性末端能相互连接，B错误；酶a与酶b切断的化学键均为相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；质粒为小型环状DNA分子，用酶a切割有3个识别位点的质粒，可得到3种切割产物，D错误。
答案：A
2．解析：DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来。E.cli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。
答案：C
3．解析：限制酶具有专一性，一种限制酶一般只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子。DNA连接酶能使不同DNA片段的脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，重新形成DNA分子；RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录；DNA聚合酶能以DNA的一条链为模板，把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链，复制形成新的DNA分子。
答案：C
4．解析：由表中信息可知，Hind Ⅱ能识别4种不同的核苷酸序列；Sau3A Ⅰ酶的切割位点在识别序列的外部；BamH Ⅰ酶与Sau3A Ⅰ酶切割后能形成相同的黏性末端；Sma Ⅰ酶切割后产生的是平末端。
答案：A
探究点三
【师问导学】
1．提示：小型环状DNA。
2．提示：不是，除了质粒外，载体还有动植物病毒和λ噬菌体的衍生物。
3．提示：不可行，因为如果没有载体导入受体细胞，目的基因无法进行自我复制和稳定存在以及表达。
4．提示：检测目的基因是否导入受体细胞。
5．提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。
(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
【检测反馈】
1．解析：质粒不只分布于原核生物中，在真核生物(如酵母菌)细胞内也有分布，A错误；并不是每个质粒上都有限制酶的切割位点，B错误；重组质粒进入受体细胞后，有的是在细胞内自我复制，有的是整合到宿主细胞染色体DNA上随染色体DNA复制，C错误；质粒上的抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA的鉴定和选择，D正确。
答案：D
2．解析：根据题意，选用的质粒上应有复制必需序列和四环素抗性基因，且不含氨苄青霉素抗性基因。A项破坏了复制必需的序列，B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。
答案：C
3．解析：作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。
答案：A
4．解析：用限制酶Mun Ⅰ切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体。C、D质粒含有标记基因，但用限制酶切割后会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体。
答案：A
探究点四
【师问导学】
1．鸡的血液 鸡血细胞的核DNA含量丰富，材料易得，而哺乳动物的红细胞无细胞核，不含DNA
2．(1)提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
(2)提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
【检测反馈】
1．解析：作为DNA提取材料的首要条件是细胞内要含有DNA，次要条件是DNA的含量丰富，而哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，所以不宜选作实验材料。
答案：C
2．解析：A项：尽量选择DNA含量高的材料粗提取DNA。B项：洗涤剂的用量和类型能影响细胞膜的瓦解程度，从而导致DNA的释放量的变化。C项：二苯胺是DNA的鉴定剂，而非提取剂。D项：搅拌和研磨充分有利于DNA的释放。
答案：C
3．解析：从体积分数为95%的冷酒精中析出的较纯净DNA的颜色是白色；鉴定DNA时，DNA遇二苯胺在沸水浴条件下呈现蓝色。
答案：C
4．解析：DNA不易溶于酒精，而滤液中某些杂质易溶于酒精，利用这个特点可去除溶于酒精的杂质，得到较纯的DNA。
答案：B
随堂·巩固·达标
1．解析：限制酶主要是从原核生物中分离出来的，并不是广泛存在于各种生物中；DNA分子可被限制酶特异性切割；一种限制酶通常只能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
答案：A
2．解析：质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。
答案：A
3．解析：该DNA分子用限制酶EcR Ⅰ切割后长度不变，可知该DNA分子为环状结构，根据EcR Ⅰ、Kpn Ⅰ的作用特点，可知酶切图谱为D项所示。
答案：D
4．解析：质粒是基因工程中最常用的载体，是一种裸露的、结构简单、独立于细胞核或细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点，进入受体细胞后能自我复制，具有标记基因便于重组DNA的鉴定与选择。
答案：(1)DNA 能够自我复制、具有遗传效应
(2) DNA连接酶
(3)标记基因 供重组DNA的鉴定和选择 (4)C
手段
通过体外________和________等技术，赋予生物新的________
目的
按照人们的愿望，创造出更符合人们需要的新的________和________
设计和施工水平
________________水平
项目
作用
应用
限制酶
使特定部位的磷酸二酯键断裂
用于提取目的基因和切割载体
DNA
连接酶
在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于基因表达载体的构建
项目
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点
催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
不
同
点
模板
不需要模板
需要DNA的一条链为模板
作用对象
游离的DNA片段
单个的脱氧核苷酸
作用结果
形成完整的DNA分子
形成DNA的一条链
用途
基因工程
DNA复制
名称
作用部位
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
将DNA切成两个片段
DNA
连接酶
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA
聚合酶
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA
(水解)酶
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
限制酶
名称
识别序列和
切割位点
限制酶名称
识别序列和
切割位点
BamH Ⅰ
eq \(GG,\s\up6(↓))ATCC
Kpn Ⅰ
GGTAeq \(CC,\s\up6(↓))
EcR Ⅰ
eq \(GA,\s\up6(↓))ATTC
Sau3A Ⅰ
eq \( G,\s\up6(↓))ATC
Hind Ⅱ
GTeq \(YR,\s\up6(↓))AC
Sma Ⅰ
CCeq \(CG,\s\up6(↓))GG
条件
分析
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
无毒害作用
避免受体细胞受到损伤
种类
用途
质粒
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
λ噬菌体的衍生物
植物病毒
将外源基因导入植物细胞
动物病毒
将外源基因导入动物细胞
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